LUAN VAN Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học một số dịch chiết của hoa đu đủ đực ở Đại Lộc tỉnh Quảng Nam

đầy đủ, nhiều nội dung, phổ, sắc ký cột, phổ đồ, đu đủ đực Đã tách được các phân đoạn có thành phần giống nhau từ dịch chiết nhexan. + Thu được hợp chất kết tinh + Bước đầu xác định các phổ:IR, 1HNMR và 13CNMR của hợp chất kết tinh DDC1 đã thu được. Hợp chất kết tinh là hỗn hợp của các hợp chất: Campesterol, Stigmasterol, gamma– Sitosterol.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG LÊ THỊ THẢO NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ DỊCH CHIẾT CỦA HOA ĐU ĐỦ ĐỰC Ở ĐẠI LỘC, TỈNH QUẢNG NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng - Năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG LÊ THỊ THẢO NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ DỊCH CHIẾT CỦA HOA ĐU ĐỦ ĐỰC Ở ĐẠI LỘC, TỈNH QUẢNG NAM Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ Mã số: 60 44 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học : TS Vũ Thị Duyên Đà Nẵng - Năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn ký ghi rõ họ tên LÊ THỊ THẢO MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Đối tượng nghiên cứu 3 Mục đích phạm vi nghiên cứu Phương pháp nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Bố cục luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Nguồn gốc phân bố 1.1.3 Đặc điểm thực vật học đu đủ 1.2 GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA CÂY ĐU ĐỦ 11 1.2.1 Tác dụng dinh dưỡng 12 1.2.2 Tác dụng dưỡng sinh 12 1.2.3 Tác dụng làm đẹp 13 1.2.4 Tác dụng chữa bệnh 13 1.3 MỘT SỐ CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY ĐU ĐỦ 15 1.3.1 Một số cơng trình nghiên cứu đu đủ giới 15 1.3.2 Một số cơng trình nghiên cứu đu đủ Việt Nam 16 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 18 2.1.1 Mẫu nguyên liệu 18 2.1.2 Xử lý nguyên liệu 18 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 19 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Sơ đồ thực nghiệm 20 2.2.2 Xác định thơng số hóa lý nguyên liệu 23 2.2.3 Cơ sở lý thuyết phương pháp chiết 26 2.2.4 Xác định thành phần hóa học dịch chiết từ hoa đu đủ đực 32 2.2.5 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới q trình chiết dung mơi metanol 33 2.2.6 Chiết tách phương pháp mỏng 34 2.2.7 Sắc ký cột 37 2.2.8 Thử hoạt tính sinh học 39 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ 41 3.1.1 Độ ẩm 41 3.1.2 Hàm lượng tro 42 3.1.3 Xác định hàm lượng số kim loại 42 3.2 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN, CẤU TẠO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÁC DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU CỦA HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 43 3.2.1 Dịch chiết dung môi n-Hexan 43 3.2.2 Dịch chiết dung môi Clorofom 45 3.2.3 Dịch chiết dung môi etylaxetat 48 3.2.4 Dịch chiết dung môi diclometan 51 3.3.5 Dịch chiết dung môi metanol 54 3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CỦA PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 60 3.3.1 Khảo sát thời gian chiết 61 3.3.2 Khảo sát nhiệt độ chiết 62 3.3.3 Khảo sát tỉ lệ rắn - lỏng 62 3.3.4 Khảo sát số lần chiết 63 3.4 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 64 3.5 KẾT QUẢ PHÂN LẬP MỘT SỐ CẤU TỬ CÓ TRONG CAO DICLOMETAN 65 3.5.1 Kết sắc ký mỏng 66 3.5.2 Kết sắc ký cột 69 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI (Bản sao) DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AAS Atomic Absorption Spectrophotometric GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry NMR Nuclear magnetic resonance DEPT Distortionless enhancement by polarisation transfer IR Infrared Radiation IC50 The half maximal inhibitory concentration DMSO Dimethyl sulfoxide DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng 2.1 Tên bảng Hóa chất sử dụng q trình làm thí nghiệm Trang 19 3.1 Kết xác định hàm lượng kim loại nặng 42 3.2 Thành phần hóa học dịch chiết n-hexan 44 3.3 Thành phần hóa học dịch chiết clorofom 46 3.4 Thành phần hóa học dịch chiết etylaxetat 49 3.5 Thành phần hóa học dịch chiết diclometan 52 3.6 Thành phần hóa học dịch chiết metanol 54 3.7 3.8 Tổng hợp cấu tử phát phương pháp phổ GC-MS Kết thử hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết metanol hoa đu đu đực 57 65 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu Tên hình Trang 1.1 Cây đu đủ 1.2 Cấu tạo đu đủ 1.3 Hoa đu đủ đực 1.4 Hoa đu đủ 1.5 Cây đu đủ đực 1.6 Cây đu đủ 10 1.7 Cây đu đủ lưỡng tính 11 1.8 Quả đu đủ chín 12 2.1 Mẫu ngun liệu thơ 18 2.2 Hoa, bột đu đủ đực 18 2.3 Sơ đồ qui trình chiết tách hoa đu đủ đực 20 2.4 Bộ chiết soxhlet 21 2.5 Dịch chiết dung môi 21 2.6 Sơ đồ qui trình phân lập số hợp chất dịch chiết metanol 22 2.7 Mơ hình phương pháp chiết soxhlet 28 2.8 Sơ đồ thiết bị sắc ký ghép khối phổ 32 3.1 Mẫu nguyên liệu trước, sau xử lý 41 3.2 Sắc ký đồ dịch chiết n-hexan hoa đu đủ đực 43 3.3 Sắc ký đồ dịch chiết clorofom hoa đu đủ đực 46 3.4 Sắc ký đồ dịch chiết etyl axetat hoa đu đủ đực 49 3.5 Sắc ký đồ dịch chiết diclometan hoa đu đủ đực 51 3.6 Sắc ký đồ dịch chiết metanol hoa đu đủ đực 54 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 Sự phụ thuộc khối lượng cao chiết (m) vào thời gian chiết (t) Sự phụ thuộc khối lượng cao chiết (m) vào nhiệt độ chiết (oC) Ảnh hưởng tỉ lệ rắn- lỏng đến khối lượng cao chiết (m) dung môi metanol (V) Ảnh hưởng số lần chiết đến khối lượng cao chiết dung môi metanol Kết sắc ký mỏng dung môi 61 62 63 64 66 66 chạy sắc ký mỏng tiến hành phân lập cột sắc ký với hệ dung môi khác 3.5.1 Kết sắc ký mỏng a Kết sắc ký mỏng với dung môi khác Hinh 3.11 Kết sắc ký mỏng dung môi ♦Nhận xét Dựa vào kết dung môi (từ trái sang phải hình) nhexan , clorofom, metanol, diclometan, etyl axetat ta thấy dùng dung mơi để tách cấu tử vết tách khơng rõ ràng, không 67 tách riêng biệt, nhiều vết có cịn kéo dài Do đó, tơi khơng chọn dung mơi thí nghiệm sau mình, mà tiến hành thử hệ dung mơi khác ví dụ clorofom:etyl axetat, n-hexan:etyl axetat … để tìm hệ dung mơi thích hợp b Kết sắc ký mỏng hệ dung môi clorofom:etyl axetat Tôi tiến hành chạy sắc ký mỏng với hệ dung môi clorofom:etyl axetat thu kết hình 3.12 Hình 3.12 Kết sắc ký mỏng hệ dung môi clorofom:etyl axetat soi đèn UV bước sóng 365 nm ♦Nhận xét Với kết hình 3.12 cho thấy hệ dung mơi vết tách chưa tốt, cịn có kéo dài đi, vết tách khơng rõ Do đó, tơi khơng chọn hệ dung mơi để tiến hành thí nghiệm c Kết chạy sắc ký mỏng hệ dung môi n-hexan:etyl axetat Tiến hành chạy sắc ký mỏng hệ dung môi n-hexan: etyl axetat thu kết hình 3.13 68 (a) ` (b) Hình 3.13 Kết chạy sắc ký mỏng hệ dung môi n-hexan: etyl axetat soi đèn UV bước sóng 365 nm ♦ Nhận xét + Với hệ dung môi n-hexan: etyl axetat = 10:0: Các vết chưa tách + Với hệ dung môi n-hexan:etyl axetat = 9:1, 8:2, 7:3: Các vết tách rõ Trong vết tách tốt 8:2, vết tách rõ + Với hệ dung môi n-hexan:etyl axetat =5:5: Các vết tách kém, có kéo + Với hệ dung môi n-hexan:etyl axetat = 0:10: Các vết tách kém, vết trùng lên vị trí mép mỏng 69 Do đó, chọn hệ dung môi n-hexan: etyl axetat = 9:1 làm hệ dung mơi khởi đầu, sau tăng dần độ phân cực hệ dung môi nhexan: etyl axetat = 5:5 3.5.2 Kết sắc ký cột Sau lựa chọn hệ dung mơi thích hợp, tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan:etyl axetat Mỗi lần pha 100 ml hệ dung môi nhexan:etyl axetat với độ phân cực tăng dần theo tỉ lệ sau 95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 5:5 Tiến hành chạy sắc ký cột với hệ dung môi, thu phân đoạn hình 3.16 Hình 3.14 Cột sắc ký ( sau nhồi) 70 Hình 3.15 Các dịch chiết tách Sau tiến hành chạy sắc ký mỏng với phân đoạn tách trên, thu kết hình 3.17 (a) 71 (b) Hình 3.16 Sắc ký mỏng phân đoạn Từ kết bảng mỏng cho thấy phân đoạn từ 21 đến 23; từ 25 đến 27; từ 28 đến 30; từ 32 đến 34 từ 36 đến 39 có tách vết giống chứng tỏ phân đoạn chứa cấu tử Đồng thời tiến hành cho bay tự nhiên phân đoạn thu ta thấy ống 25, 26, 27 có xuất kết tinh DDC1 màu trắng lên thành bình Hình 3.17 Chất kết tinh lên thành bình DDC1 Cấu trúc hợp chất DDC1 khẳng định định thơng qua việc phân tích số liệu phổ: IR, 1H-NMR, 13 C-NMR 72 - Phổ IR (KBr, ν cm-1) Cho tín hiệu : 3428 (O-H); 2957, 2932, 2855, 2865 (cho tín hiệu mạnh nhóm CH3, CH2, CH), 1737, 1719(dao động nối đôi C=C bậc 4); 1464( nhóm –OH); 1378, 1253, 1240, 1189, 1174, 1108, 1062, 1055, 1024, 971 (vùng nhóm C – O) ( Phổ IR thể hình 3.18 Hình 3.18 Phổ IR hợp chất kết tinh DDC1 - Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500MHz) Phổ 1H-NMR chất cho thấy tín hiệu 28 proton, bao gồm tín hiệu doublet δ = 0,822; 0,810; 0,796 ppm gợi ý nhóm CH3 gắn vào nhóm -CH Đặc biệt, cụm tín hiệu nhỏ vùng proton 3,572 ppm dự đoán nhóm CH Multilet δ = 1,186 ppm dự đốn nhóm CH3 (Phổ H-NMR thể hình 3.19) 73 Hình 3.19 Phổ 1H-NMR hợp chất kết tinh DDC1 - Phổ 1C-NMR (CDCl3, 125MHz) Tín hiệu 14,12 ppm dự đốn nhóm –CH3 – CH Các tín hiệu 31,96; 29,41; 28,67; 26,01; 25,75; 22,71 ppm pic nhóm – CH2 C bậc Các tín hiệu 77,27; 77,01; 76,76 ppm dung môi CDCl3 Khơng có C có độ dịch chuyển lớn 160 ppm nên dự đốn khơng có C nhóm chức C=O ( phù hợp với tín hiệu phổ IR) Phổ khơng có vùng tín hiệu nhân thơm (Phổ hình 3.20) 13 C-NMR thể 74 Hình 3.20 Phổ 13C-NMR chất kết tinh sau phân lập Hình 3.21 Phổ DEPT hợp chất kết tinh DDC1 75 ♦ Nhận xét Dựa giả thiết phổ IR, 1H-NMR, 13 C-NMR , đồng thời so sánh với tài liệu chất chuẩn [16], [17], [18] dự đốn chất kết tinh DDC1 Campesterol Stigmasterol gamma– Sitosterol Đây Nhóm chất Phytosterol có hoạt tính sinh học Do thời gian khối lượng chất kết tinh nên tiến hành xác định cấu trúc cụ thể hợp chất vừa tách 76 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã xác định số tiêu hóa lý hoa đu đủ đực lồi Carica papaya, gồm: + Độ ẩm trung bình bột hoa đu đủ đực khô: 6,67 ± 0,036 +Hàm lượng tro trung bình hoa đu đủ đực: 10.71± 0,292 + Hàm lượng kim loại nặng Cd, Pb, As, Hg nằm khoảng cho phép dược liệu - Bằng phương pháp GC-MS xác định số cấu tử có dịch chiết hoa đu đủ đực + Dịch chiết n-hexan: Phương pháp GC-MS định danh cấu tử + Dịch chiết clorofom: Trong dịch chiết clorofom có 12 cấu tử phát + Dịch chiết etyl axetat: Với phương pháp GC-MS định danh 10 cấu tử dịch chiết etyl axetat từ hoa đu đủ đực + Dịch chiết diclometan: Trong dịch chiết diclometan có 11 cấu tử phát + Dịch chiết metanol: Trong dịch chiết metanol có 17 cấu tử phát Với dung môi metanol tách nhiều cấu tử (17 cấu tử) so với dung mơi cịn lại - Đã tìm điều kiện chiết tối ưu cho trình chiết dung môi metanol hoa đu đủ đực + Thời gian chiêt : 100 phút + Nhiệt độ chiết: 70 oC + Tỉ lệ rắn lỏng : 100ml metanol- 10 gam bột + Số lần chiết: Cần chiết tối thiểu lần 77 - Dịch chiết metanol từ hoa đu đủ đực khơng thể hoạt tính kháng chủng vi sinh vật nấm kiểm định nồng độ IC50