Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học theo định hướng hoạt tính kháng khuẩn của loài an điền nón h edyotis pilulif e r a pit t n ninh

Analogues with Various Substituents at the Sulfinyl Sulfur: 24 T J Wenzei; J Zaia Organic-Soiuble Lanthanide Asymmetric Synthesis and Biological Activities J Org Nuciear Magnetic Resonance Shift Reagents for Chem., 2009, 74,6002-6009 Sulfonium and isothiouronium Salts Anal, Chem., 1987, *2 H L Holiand; F M Brown; B G Larsen; M Zabic 59,562-567 Biotransformation of organic sulfides Part Formation of 25 H Golchoubian; F Hosseinpour Effective chiral isothiocyanato sulfoxides and related compounds Oxidation of Sulfides to Sulfoxides with Hydrogen by microbial biotransformation Tetrahedron Asymmetry, Peroxide under Transition-Metal-Free Conditions 1995, ổ(7), 1569-1574 ivioiecuies, 2007, 12, 304-311 23 E L Eliei; R Hutchins; R Mebane; R L 26 M H Benn and Vinod K Singh A simple, Wilier Endocyciic vs Exocyclic Attack in Nucleophiiic biogeneticaily modeled synthesis of 4-(methy1thio)butyỉ Displacement Reactions on Five- and Six-Membered thiocyanate: the reaction of thiocyanaie anion with SCyclic Onium Salts J Ory Chem., 1976, 41(6), 1052methy!-(1,n)-epithionium ions Can J Chem., 1986, 64, 1057 940-942 NGHIÊN u ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHÀN HÓA HỌC THẸO ĐỊNH HƯỚNG 'h o t tín h k h n g KHUẢN CỦA LOÀI AN ĐIÈN NÓN (H e d y o t i s p i l u l i f e r a (Pit.) T.N.Ninh) , Nhóm nghiên cửu: ThS Võ Quốc Hùng, ThS Nguyễn Đình Quỳnh Phú, T S Hồ Việt Đức, T S Nguyên Thị Hoài (Khoa Dược, Đại học Y Dược Huế) TÓM TẤT Đặt vấn đề mục tiêu: Tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn đặt yêu cẩu cấp thiết cho việc phàt triển thuốc khàng sinh Kết nghiên cứu sàng lọc cho thấy triển vọng An điền nón trình tìm kiếm thành phần có hoạt tính kháng khuẩn Vì vậy, để tài thực nhằm khảo sâỉ đặc điểm thực vật, thành phần hóa học hoạt tính kháng khuẩn cốc hợp chất phân lập từ An điên nón - vốn chưa nghiên cứu cụ thể Việt Nam giới Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Phần mặt đất An điền nón (Hedyotis pilulifera (Pit) T.N.Ninh) thu hái Vĩnh Linh, Quảng Trị vào tháng 08/2014 Nghiên cứu đặc điểm thực vật phương pháp cắt nhuộm vi pbẫu thân, /á, soi bọt Phân lập cốc hợp chểt tình khiết sử dụng phương pháp sắc ký kết hợp Xốc định cẩu trúc qua liệu phổ, thông số vật lý, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo Xảc định hoạt tính kháng sinh phương phàp pha loằng khay 96 giếng Kết - Kết luận: Đă xác định đặc điếm vi học thân lâ An điền nón Đã phân lập 01 hợp chất irìdoid ià 10-0-acetylborreríagenin (1), 05 hợp chất irídoid (2-6) 05 hợp chất tríterpene biểt (7-11) Hợp chất 7,8, 10 11 thể hiẹn hoạt tính ức chế cốc mức độ khàc đổi với chủng vi khuẩn S aureus, B subtilis M smegmatis Trong đó, hợp chất 10 cố hoạt tính mạnh chủng vi khuẩn (MIC la 2,5; 2,5 1,25 ụg/mL) T k h ó a : Hedyotis pilulifera, 10-0-acetylborrerìagenin, irídoid, trìterpene, hoạt tính kháng khuẩn SUMMARY Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh: BOTANICAL PRO PER TIES AND ANTIBACTERIAL CO NSTITU ENTS Authors: Vo Quoc Hung, Nguyen Dinh Quynh Phu, Ho Viet Due, Nguyen Thi H oai (Faculty o f Pharmacy, Hue University o f Medicine and Pharmacy) Background: Drug resistance has become a serious problem encouraging scientists to deveplop new antibiotics The screening o f antibacterial effect ofHedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh showed the potential o f this plan to discover antibacterial constituents Therefore, this study was conducted to investigate botanical properties, phytochemicals, and antibacterial activity o f H pilulifera which has not been studied ye t Materials and method: Anal parts o f H pilulifera (Rubiaceae) were collected from Vinh Linh, Quang Tri province in August 2014 Botanical properties were studied using microscopic methods Pure compounds were isolated by using the combination o f various chromatographic methods, structure o f isolated compounds were identified by analyzing their spectral data, physical properties, and by comparing with those in literature Antibacterial activity o f isolated compounds was evaluated by microdilution assay Results & Conclusion: Microscopic botanical properties o f H pilulifera were described One new iridoid, 10-0- acetylborreriagenin (1), together with five known iridoid compounds (2-6), and five known triterpenes (7-11) were isolated The result o f antibacterial activity test o f these 11 compounds showed that compounds 7, 8, 10, and 11 possessed inhibitory activity toward s aureus, B subtilis, and M smegmatis with different strengths Among those, compound 10 possessed strong inhibitory effect toward all three tested bacteria (MIC 2.5, 2.5, 1.25 ụg/mL, respectively) Keywords: Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh, 10-0-aceỉylborreriagenin, iridoids, triterpenes, antibacterial activity - 732- Đ ẬT VẮN ĐỀ V À MỤC TIÊU Trong vài thập kỷ trờ lại đây, việc đề kháng loại thuốc kháng vi sinh vật írở íhành nguy đáng báo động, làm giảm hiệu điều trị, gia ỉăncỊ phí tỉ ỉệ tử vong Do đó, việc nghiên cứu nham phát kháng sinh có hiệu điều trị cao yêu cầu cấp bách [24], Trong trình tỉm kiếm này, thiên nhiên đã, tiếp tục đối tượng đầy triển vọng với nguồn hợp chấỉ có hoạt tính sinh học vơ phong phu [11 ] Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có nguồn ỉàí ngun thực vật đa dạng Trong đó, Hedyotis L gồm 500 lồi chi thực vật có số lượng lồi lớn họ Cà phê (Rubiaceae), biết có 66 lồi, thứ Việt Nam [3, 6], Các nghiên cứu cho thấy nhiều loài chi Hedyotis L có phổ hoạt tính sinh học tương đối rộng hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, bảo vệ gan, tác dụng gây độc số dòng tế bào ung thư ỉhử nghiệm [10, 12], Đáng ý hoạt tính khang khuẩn với hiệu ức chế vỉ khuẩn Gram (-) Gram (+) [10,16] Trong ỉrình nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng sĩnh lồi thuộc chi Hedyotis L , dịch chiết methanol ỉừ An điền nổn (Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Nính) thể tác dụng đáng lưu ý Tuy nhiên nay, chưa thấy cỏ công bố đặc điểm vi học, thành phần hóa học, tác dụng sinh học loài Việt Nam thể giới Với iý nêu trên, đề tài “N ghiên u đặc điểm th ự c v ậ t thành phần hóa h ọ c th e o định hư ng hoạt tính kháng khuẩn c ủ a lồi A n điền nón (Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.NỈnh)" thực nhằm góp phần phục vụ cho cơng tac bảo tồi% chuẩn hóa nguyên liệu iàm sáng tỏ thành phần hóa học tác dụng kháng khuẩn dược liệu ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIỀN c u Đôi tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu phần mặt đất An điền nón, mẫu thu thập huyện Vĩnh Linh, tỉnh Quảng Trị vào tháng năm 2014 Tên khoa học xác định ià Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh.íhuộc họ Cà phê (Rubiaceae) Tiêu mẫu (kí hiệu VL-01) lưu giữ phòrig tiêu Viện Sinh ỉháỉ Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khọa học Công nghệ Việt Nam Khoa Dược - Trương Đại học Y Dược HŨế PhiPơng pháp nphiên cửu 2.1 Nghiên cứu v ế thự c vật Quan sát, chụp ảnh mơ tả đặc điểm hình thái thực vật íại thực địa Thu hái, làm tiêu mẫu lưu giữ tiêu Giám định tên khoa học cùa sở phân tích đặc điểm hình thái, so sánh với tiêu !ưu trữ tài liệu phân loại thực vật [4] với hỗ trợ cùa chuyên gia phân loại thực vật Nghiên cứu cấu tẹo giải phẫu kính hiển vi sừ dụng phương pháp cắt nhuộm kép V! phẫu xanh methylene đỏ carmin, phương pháp soi bột [7] 2.2, Nghiên cứu thành phần hóa học Tạo dịch chiết tồn phần bang phương pháp ngâm với dung mơi hữu nhiệt độ phịng Chiết xuất phân đoạn sử đụng phương pháp chiết phân bố [2 ], Phân lập chẩỉ tình khiết sẳc ký cột silica gel pha thường (Silica gei 60 0,040-0,063mm (230-400 mesh ASTM), Merck); silica gel pha đảo YMC (30-50 ụm, F u ji Siiysia Chemical Ltd.); Diaion HP-20 vá Sẹphadex LH-20 (Merck) Theo dõi phân đoạn sắc ký lớp mỏng (SKLM) tráng sẵn pha thường (Merck, Kielselgeí 60 F254, 250 |jm ) pha đảo (Merck, RP C-18 F ) Phát vếí chẩt đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm 366 nm dùng thuốc thừ dung dịch H2SO 10% Xác định cấu trúc hợp chất phân lập dựa phương pháp bao gồm: phổ cộng hường từ hạt nhân (NMR) mộì chiều (1H NMR, 13c NMR, DEPT) và' hai chiều (HMBC, HSQC, COSY, NOESY); phổ khối iượng phân giải cao HR-ESI-MS; thông số vật lý nhiệt độ nóng chảy, độ quay cực, quang phổ tư ngoại phổ hồng ngoại 2.3 Nghiên cứu hoat tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuần đánh giá phương pháp pha loãng chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus (NBRC 100910), Bacillus subtilis (NBRC 13719), Mycobacterium smegmatis (NBRC 13167), Klebsiella pneumoniae (NBRC 14940), Escherichia coli (NBRC 102203) Pseudomonas aeruginosa (NBRC 106052) Các chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ ngân hàng vi khuẩn Trung tâm Tài nguyên Sinh vậí NITE, N hậỉ Bản Vi khuẩn cấy ỉrên thạch YP [chứa 1% polypeptone (Nihon Pharmaceutical, Nhật Bản), 0,2% yeast extract (Difco, Mỹ), 0,1% M gS 4.7H 20 , 2% agar (Nacalai Tesque, Nhạt Bản)] sau ủ 30 ° c trịng 12 Dung địch gốc mẫu thừ pha dimethyl sulfoxide nồng độ 10 mg/mL dịch chiết, mg/mL hợp chất tinh khiết, sau pha iỗng thành nồng độ khác cho vào khay 96 giếng đâ chứa sẵn chùng vi khuẩn U moi trường YP Sau ủ qua đêm 37 °c, dung dịch 3-(4,5-dimethyiihiazol-2-yl)-2,5dimethyltetrazolium bromide (Sigma Aldrich, Mỹ) pha isopropyl-HCI {0,5 mg/mL) thêm vào giếng ủ tiếp Giá trị nống độ ửc chế tối thiểu (MIC) đữợc xac đĩnh bời nồng đọ tháp có tác dụng ức chế sinh trưởng cua vi khuẩn kiểm định Kanamycin ampicillin (Nacalai Tesque, Nhật Bản) sư dụng !àm chất đối chứng tương ứng với đối VỚI vi khuẩn Gram (-) Gram (+) [20] KÉT QUẢ Kết nghiên cứu thực vật 1.1 Nghiên cứu vi phẫu Tiến hành phơi sấy khơ íhân dược liệu, c ắ t nhuộm kép vi phẫu thân lá, quan sát đặc điểm, mô tả chụp ảnh tiêu bạn kính hiển vi Đặc điềm vi phẫu thân.A): Mặt cắt hình trịn, từ ngồi vào có: Biểu bì (2) hàng tế bào xếp đặn mang lông che chở đa bào (1) Mơ dày (3) có 2-3 IỚỊP tế bào hình đa giác thành dày xếp sát bi bi Mơ mem vò (4) gồm 4-5 lớp tế bào thành mỏng, hình trứng, xếp lộn xộn Libe (5) gồm 6-8 lớp tế bao nhỏ xếp sát thành vịng ìibe sát phía ngồi vịng gỗ, iibe có tinh thể canxi oxalat hình cau gai rai rác hay tập trung thành đám Tầng phát sinh lìbe-gỗ (6) gốm 1-3 hàng tế bào nhỏ tạo thành vịng liên tục Mơ gỗ (7) xếp sat tạo thành vòng liên tục, mạch go xếp thành dãy Mô mềm ruột (8) tể bào hình trịn đa giác, thành mỏng, phần trung tâm có tế bào với kích thước lớn Tinh canxi oxai hình cầu gai (9) tập trung nhiều mô mềm vỏ, rải rác libe mơ mềm ruột Trong mơ mềm ruột cịn xuất tinh thề canxi oxalat hình kim (10) Đ ặc điểm vi phấu lá: Phần gân lá.B1): gân lồi, gân loi nhiều Biểu bĩ (2) hang tế bào hỉnh írứng xếp liên tục đặn mang lông che chở đa bào (1) Long che chở đa bào cấu tạo bời 2-7 tế bào, tế bào gần đầu íơng ciài nhỏ đần x ế p sát biểu bì mơ dày (3) có 3-4 hàng tế bào, tế bào hỉnh trịn đa giác, có thành dày góc, kích thước khơng Mơ mềm (4) tế bào hình đa giác trịn, thành mong, kích thước khơng đèu Phản gân chinh có cung libe gỗ, libe dưới, gỗ Libe (5) gồm té bào nhỏ, xếp sát nhaụ tạo thành cung lỉbe bao bó gơ cầu tạo mạch gô tương đối nhỏ, xếp thành hàng Phần phiến (.B2): Tế bào biểu bi có klch thưởc lớn tế bào biểu bì dưới, gồm hàng tế bào hình trứng đa giác, xếp đặn mang iông che chở đa bào íữơng tự phần gân Biểu bì mang lơng tiết (10), lỗ khí (11) Mơ giậu (7) nằm lớp biểu bì trên, cau tạo hàng tế bao hình chữ nhật, xếp sít thẳng góc với biểu bì írên, chiếm khoảng 1/4 bề dày phiến Mô khuyết (8) cấu tạo tế bào thành mỏng, kfch thước khổng đều, kéo dai theo chiều ngang đề hở khuyet nho Tinh thể canxi oxalat (9) hình cầu gai tập trung nhiều phiến lá, mật độ nhiều mô giậu, rải rác mơ khuyềt Hình Vi phẫu thân (hình A) vi phẫu (phần gân - Hình B1 phần phiến iá - Hình B2) An điền nón 1.2 Nghiên u b ộ t thân iá Tách riêng phần thân lá, nghiền thành bột mịn, soi chụp ảnh kính hiển vi đặc điểm bột Bột thân (Hình 2.A) màu nâu, khơng mùi, khơng vị Quan sát kính hiển vi nhận thấy: mảnh biểu bi (1), lông che chở đa bào (2), mảnh mô mềm tế bào thành mỏng hlrth trứng (3a) hoậc đa giác (3b), mảnh mô mang íinh thể canxi oxalat hình cầu gai (4), bó sợi (5), mảnh mạch xoắn (6), mảnh mạch điểm (7), tinh thể canxi oxalat hình cầu gai (8) có kích thước 0,02-0,03 mm, tinh thể canxi oxalat hình kim (9) có kích thước 0,06-0,07 mm Bột (Hlnh 2.B) màu xanh, khơng mùi, khơng vị Soi kính hiền vi nhận thầy: mảnh biểu bì mang lơng che chở đa bào (1), bó sợi (2), mảnh mạch xoắn (3), lơng che chở đa bào (4a) nhiều đoạn lông đứt gãy (4b), mảnh biểu bì mang lo khí (5), mảnh mơ mềm gồm tế bào gần tròn thành mong (6), tinh thể canxi oxalat hình cầu gai (7) có kích thước 0,02-0,03 mm A B Hình M ột số đặc điềm bột thân (hình A) bột (hình B) An điền nón -734- Kết nghiên cứu thành phần hóa học 2.1 Chiết xuất phân lập Mâu nguyên liệu rửa sạch, ỉhái nhỏ, phơi, sấy khơ 0-60 ° c , sau xay thành bột ỉhô bảo quản nơi khô ỉhọáng Bột khô (1,4 kg) ngâm chiết nhiệt độ phòng với methanol (MeOH) (5 Ưlần/7 ngày X lần), gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi áp suất giảm, nhiệt độ -6 ° c thu cao chiết MeOH (38 g) Phân tán cao chiết L nước chiếi phân bố lan iượt với chloroform (CHCi3) (2 L X lan) ethyl acetate (EA) (2 L X lần), cất thu hồi dung môi áp suất giảm thu cao chiết tương ứng HC (13 g), HE (11 g) phân đoạn nước lại HW (14 g) Cao HC (13 g) tiến hành chiết pha rắn sử dụng silica ge! pha thường rửa giải gradient nồng độ hỗn hợp dung môi n-hexane (He) acetone (Ac)7 với tỉ ĩệ lẩn lượt 100:0, 95:5, 90:10, 50 10 1 vả 0:100 jv /v , L hệ), thu phân đoạn từ HC1 đến HC6 Phân 'đoạn HC3 (1,9 g) tiến hành sac kỵ cộỉ silica gel pha thường với dung môi khai triển He-EA (6:1) Theo dõi trình rưa gỉải SKLM, gộp phân đoạn tương tự, thu phận đoạn (H C3A-HC3E) Phân đoạn HC3B (210 mg), H C3C (180 mg) va H C3E (2,1 g) tiếp tục phân tách cột pha thưởng, thu hợp chất lan lượt (11,0 mg), 11 (8,0 mg) (2,6 mg) Phân đoạn HC6 (1,5 g) sau khỉ triển khai qua cột pha thường pha đảo thỉ thu hợp Chat (8,1 mg) 10 (4,5 mg) Cao HW (14 g) phân tán ỉrong lượng nước tối thiểu đưa lên cột Diaion HP-20, sau rửa giải gradient nồng độ với hệ dung môi MeOH-nươc (0:100, 25:75, 50:50, 75:25, 100:0, v/v, L hệ), thu phân đoạn (HW 1-HW 5) Phân đoạn HW3 (2,5 g) triển khai cột pha thường, hệ rửa giải EA:MeOH cho phân đoạn (HW3A-HW 3F) Phân đoạn HW3B (470 mg) tiếp tục phân lập cột R P-C18, rửa giải hỗn hợp MeOH-nước (1:2) cho phân đoạn (HW3B1-HW3B4).' Sau tinh chế cột Sephadex LH-20 sử dụng dung môi MeOH, từ phân đoạn HW3B1 thu hợp chất (5,0 mg) Phân đoạn HW3B2 HW3B4 tiến hành sắc ký cột RP-C18 cho hợp chất theo thư tự (6,0 mg), (8,0 mg) (15,0 mg) Sau từ phân đoạn HW3D (350 mg) thu hợp chất (4,5 mg) va (5,0 mg) sau triền khai sắc kỷ cột RP-C18 với hệ MeOH-nước (1:1) 2.2 Xác định cấu trúc càc họp chất phân lập Dựa liệu thực nghiệm kết hợp đối chiếu với tồi ỉiệu công bố, cấu írúc hóa học 11 hợp chất tinh khiết phân lập từ phân đoạn CH CỈ phân đoạn nước An điền nón được" khẳng định la 10 -0 acetylborreriagenin (1), asperuioside (2) [13], paederosỉde (3) [22], asperulosidic acid (4), daphylloside (5) £13], paederosidic acid methyl ester (6) [21], oleanic acid (7) [17], betuiinic acid (8) [15], 3-O-acetyl pomolic acid (9) [19], rotungenic acid (10) [18] rotundic acid (11) [14] (hinh 8) Trong đó, kết qua tra cứu íàỉiíẹu gần cho thấy hợp chất chất mới, lần biết đến tự nhiên Hợp chất tách từ phân đoạn nước dạng bột màu không màu Phổ H R-ESI-M S hợp chất cho peak ion giả phân tử m /z 279,0830 [M + N a f (tỉnh tốn lý thuyết cho cơng thức C12H16Ĩ6Na 279,0845) cho phép thiết lập cơng thức phân íừ C 12H160 Phổ IR dải hấp thụ mạnh đạc trưng cho nhóm OH (3356 cm '1), ester (1659 cm '1) nối đôi (2942, 2835, 1452, 1415 cm '1) Phổ u v (MeOH) g ự ĩý s ự có mặt nhóm ester (Xmax 208 nm) cấu trúc chất Phổ 1H NMR tín hiệu đặc trưng proton olefin ậị 5,88 (m) proton nhóm methyl ỏH 2,09 (3H, s) Phân tích phổ 13c NMR HMQC diện 12 íín hiệu carbon gồm carbon carbonyl (Sc 172,47; 180,96), carbon olefin (ỏc 12 ,11; 148,47), carbon methine gắn oxy (