NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT TỪ PHẾ LIỆU BÃ ĐẬU NÀNH. LUẬN VĂN THẠC SĨ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - VĂN THỊ DIỆU LINH NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT TỪ PHẾ LIỆU BÃ ĐẬU NÀNH LUẬN VĂN THẠC SĨ Công nghệ sinh học Đà Nẵng – Năm 2017 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - VĂN THỊ DIỆU LINH NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT TỪ PHẾ LIỆU BÃ ĐẬU NÀNH Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trương Thị Minh Hạnh Đà Nẵng – Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn PGS TS Trương Thị Minh Hạnh Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khoa học khác Ngày 11 tháng 01 năm 2018 Văn Thị Diệu Linh NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT TỪ PHẾ LIỆU BÃ ĐẬU NÀNH Họ tên: Văn Thị Diệu Linh Mã số: 60.42.02.01 Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Khóa: K32.CSH Trường Đại học Bách Khoa - ĐHĐN Tóm tắt - Nattokinase enzyme có khả làm tiêu huyết khối, giúp ngăn ngừa bệnh lý liên quan đến chứng huyết khối Sản xuất enzyme nattokinase từ lên men phế liệu bã đậu nành phương pháp góp phần tăng cường hiệu kinh tế, mà việc tận dụng phế phẩm bã đậu nành cịn có nhiều ý nghĩa mặt bảo vệ môi trường Nghiên cứu tiến hành khảo sát điều kiện thích hợp lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis natto chất bã đậu nành thu nhận enzyme Kết nghiên cứu cho thấy trình lên men bã đậu nành với tỷ lệ giống 14% (v/w), có bổ sung 20% (w/w) bột đậu nành, sau 24 lên men thu enzyme nattokinase với hoạt lực cao 11,67 đv/ml Nghiên cứu tiến hành kết tủa enzyme dung dịch ethanol 96%, sau sấy thăng hoa thu chế phẩm enzyme thơ có hoạt độ riêng 35,29đv/g Các đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm protease giàu enzyme nattokinase sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis natto, quy trình sản xuất chế phẩm enzyme nattokinase quy mơ phịng thí nghiệm trình bày nghiên cứu Từ khóa – nattokinase; bã đậu nành; Bacillus subtilis natto; lên men bề mặt; tiêu huyết khối EXTRACTION ENZYME NATTOKINASE BY SOLID STATE FERMENTATION SOYBEAN CURD RESIDUES Abstract - Nattokinase is an enzyme with fibrinolytic activity that can be used for preventing thrombolytic diseases Production nattokinase enzyme by fermentation soybean curd residues does not only increase economic value, but also brings many enviromental benefits In this study, I make survey the effect fermentation conditions to Bacillus subtilis natto strain on the soybean curd residues substrate to enhance the nattokinase activity and extraction nattokinase enzyme It is showed that when ferment conditions were involved with 14% (v/w) of Bacillus subtilis natto, 20% (w/w) soybean power added, for 24 hours, the highest protease activity could reach 11,67 units/ml I also try to extract enzyme by ethanol 96% and create dried products by freeze drying process and obtain nattokinase activity 35,29 units/g Offerings of the process of receiving nattokinase and Bacillus subtilis natto rich protease and receiving crude nattokinase enzyme in laborary were showed in this research Key words – nattokinase; soybean curd residues; Bacillus subtilis natto; solid state fermentation; fibrinolytic activity MỤC LỤC MỞ ĐẦU ……………………………………………………………… …… 1 Tính cấp thiết đề tài…………………………………………… .1 Mục tiêu nghiên cứu…………………………………………………… Đối tượng phạm vi nghiên cứu ……………………… .3 Phương pháp nghiên cứu………………………………………………… … Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu…………………… Bố cục đề tài………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN……………….… ………………………… 1.1 TỔNG QUAN VỀ BÃ ĐẬU NÀNH ………………………………… … 1.1.1 Giới thiệu bã đậu nành……………………………………………….5 1.1.2 Một số ứng dụng bã đậu nành…………………… …….……… 1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME NATTOKINASE…………………… … 10 1.2.1 Giới thiệu nattokinase…………………………………………… …10 1.2.2 Cơ chế tác dụng nattokinase………………………………………12 1.3 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS SUBTILIS NATTO…….………… ……13 1.3.1 Giới thiệu Bacillus subtilis natto……………………………….… 13 1.3.2 Đặc điểm hình thái sinh hóa Bacillus subtilis natto … …… 15 1.3.3 Khả sinh tổng hợp enzyme Bacillus subtilis natto …………………………………………………………………………… …….16 1.3.3.1 Các enzyme nội bào Bacillus subtilis natto 16 1.3.3.2 Các enzyme ngoại bào Bacillus subtilis natto 16 1.3.4 Các phương pháp lên men 16 1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men sinh tổng hợp enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis natto 17 1.3.5.1 Nhiệt độ .17 1.3.5.2 pH 18 1.3.5.3 Thời gian nuôi cấy .18 1.3.5.4 Thành phần môi trường .18 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC …… ……18 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới……………………………… ……18 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước………………………………… … 19 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………………………… ……………………… … 21 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT….………………………………… …….21 2.1.1 Nguyên liệu…………………………………………………………… 21 2.1.2 Thiết bị………………………………………………………………… 21 2.1.3 Hóa chất……… ……………………………………………………….22 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………… ….23 2.2.1 Phương pháp xác định số thành phần hóa học bã đậu nành……………………………………………………………… ….…… …24 2.2.2 Phương pháp hoạt hóa giữ giống 24 2.2.3 Phương pháp nhân giống ………… 24 2.2.4 Phương pháp xác định mật độ tế bào …………………………… … 24 2.2.5 Phương pháp lên men .25 2.2.5.1 Khảo sát thời gian lên men……… …………… …………………… 26 2.2.5.2 Khảo sát tỷ lệ giống……………………………………… ……………26 2.2.5.3 Khảo sát tỷ lệ bột đậu nành bổ sung…………………………… 26 2.2.6 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô………… ……… .26 2.2.7 Phương pháp kết tủa enzyme nattokinase dung môi ethanol 96% 27 2.2.8 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease 27 3.2.9 Phương pháp sấy thăng hoa…………… …………………………… 29 2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu… …………… ……………………… 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN… ……………………… 30 3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÃ ĐẬU NÀNH……… … 31 3.2 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN TYROSIN.… …………………… 32 3.3 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG… ………………… 32 3.4 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG QUÁ TRÌNH LÊN MEN.34 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men … ……… .34 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống…………… 36 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ bột đậu nành bổ sung vào môi trường lên men 38 3.5 KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÀM TAN HUYẾT KHỐI CỦA ENZYME NATTOKINASE 41 3.6 KHẢO SÁT TỶ LỆ ETHANOL 96% TRÊN DỊCH CHIẾT ENZYME THÔ THU NHẬN KẾT TỦA ENZYME… …… 42 3.7 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROTEASE GIÀU ENZYME NATTOKINASE VÀ SINH KHỐI VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS NATTO 45 3.8 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME NATTOKINASE THƠ QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………… .51 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO……… …………………… 52 PHỤ LỤC BIÊN BẢN HỌP HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN VĂN THẠC SỸ (bản sao) NHẬN XÉT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỦA CÁC PHẢN BIỆN (bản sao) QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (bản sao) DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA CFU Analysis of Variance Colony Forming Unit DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 1.1 Thành phần acid amin bã đậu nành 1.2 Thành phần khống chất có bã đậu nành 1.3 Các sản phẩm lên men từ bã đậu nành 2.1 Các thiết bị dụng cụ sử dụng nghiên cứu 21 2.2 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 22 2.3 Bảng pha dung dịch xây dựng đường chuẩn tyrosine 28 3.1 Một số thành phần hóa học bã đậu nành 30 3.2 Kết lên men thu nhận enzyme 38 3.3 Kết thử khả làm tan huyết khối dịch chiết enzyme 40 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Số hiệu hình vẽ Tên hình vẽ Trang 1.1 Bã đậu nành 1.2 Quy trình thu nhận bã đậu nành sở sản xuất đậu phụ 1.3 Cấu trúc bậc nattokinase 10 1.4 Một số sản phẩm thương mại chứa nattokinase 12 1.5 Cơ chế tác dụng enzyme nattokinase 12 1.6 Các sản phẩm natto truyền thống (C) natto đại (A, B) 14 1.7 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto 15 1.8 Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis natto 15 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 23 2.2 Quy trình lên men bã đậu nành phương pháp lên men bề mặt 25 2.3 Sơ đồ quy trình thu nhận dịch chiết enzym nattokinase thô 27 3.1 Đồ thị đường chuẩn tyrosine 31 3.2 Đường cong sinh trưởng Bacillus subtilis natto 32 3.3 Dịch tăng sinh 24 33 3.4 Ảnh hưởng thời gian lên men trình lên men bã đậu nành thu nhận enzyme nattokinase 34 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ giống trình lên men bã đậu nành thu nhận enzyme nattokinase 35 [37] Yong Feng, Xiao juan Yang, Yizheng Zhang, Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity invivo, Appl Microbiol Biotechnol, Vol 69, 2005, pp 126-132 [38] Yunqi Weng, Jian Yao, Sawyer Sparks, Kevin Yueju Wang , Nattokinase: An Oral Antithrombotic Agent for the Prevention of Cardiovascular Disease, International Journal Molecular Science, Vol 18, 2017, p 523 Website: [39] http://www.baomoi.com/benh-ly-tim-mach-khien-200-000-nguoi-tu-vong-moinam/c/19897728.epi (ngày truy cập: 20/8/2017) [40] http://www.science.nus.edu.sg/research-highlights/1646-yeast-fermented-okarasmells-good (ngày truy cập: 20/8/2017) [41] http://trungtamnghiencuuthucpham.vn/quy-trinh-san-xuat-dau-phu/(ngày truy cập: 20/8/2017) PHỤ LỤC Môi trường giữ giống: Pepton : 1g Cao thịt : 0,5g NaCl : 0,5g Agar-agar : 1,8g Trong 100ml nước cất PHỤ LỤC Phương pháp xác định thành phần hóa học bã đậu nành Phương pháp xác định độ ẩm - Nguyên tắc: sấy mẫu nhiệt độ 100-105oC 3-4 Cân trọng lượng mẫu trước sau sấy khơ, từ tính phần trăm nước có thực phẩm - Dụng cụ vật liệu thuốc thử + Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ (1000C – 1050C) + Cân phân tích số + Bình hút ẩm + Cốc thủy tinh - Tiến hành Cân khoảng gam mẫu cho vào cốc thủy tinh Dàn thành lớp mỏng cho vào tủ sấy 100 – 1030C, 3-4 Sấy xong, làm nguội bình hút ẩm (20 -25 phút) đem cân cân phân tích với độ xác Cho lại vào tủ sấy 100 – 1030C 30 phút, lấy làm nguội bình hút ẩm (20 -25 phút) đem cân tới trọng lượng không đổi Kết hai lần cân liên tiếp không cách 0,5mg cho gam mẫu thử - Tính kết Độ ẩm theo phần trăm tính theo cơng thức: W=  m1 – m2  *100 m1 + m1: khối lượng mẫu trước sấy, g; + m2: khối lượng mẫu sau sấy, g Từ công thức trên, ta tính lượng nước cất (lit) cần thêm để điều chỉnh độ ẩm mong muốn Wm là: a = Wm/( 1- Wm) Phương pháp xác định hàm lượng lipid - Ngun tắc: Dựa vào tính tan hồn tồn chất béo vào dung mơi hữu Dùng dung mơi hữu trích ly chất béo có mẫu Sau làm bay hết dung mơi, chất béo cịn lại đem cân, tính hàm lượng chất béo có mẫu - Dụng cụ vật liệu thuốc thử + Tủ sấy; + Nồi cách thủy; + Bình hút ẩm; + Cân phân tích; + Giấy lọc, bơng; + Cốc thủy tinh; + Mặt kính; + Dung môi ete etylic + Bộ chiết soxhlet - Tiến hành: Chuẩn bị mẫu lắp hệ thống máy trích ly Soxhlet + Cân 5g mẫu nghiền nhỏ, gói giấy ( gài khéo buộc lại) cho vào tháp trích ly máy Soxhlet (chú ý: đầu ống giấy thấp đỉnh ống xiphông tháp trích ly) + Lắp bình cầu sấy khơ vào máy Qua cổ ống sinh hàn rót dung mơi vào bình cầu Lượng dung mơi rót vào khoảng 2/3 thể tích bình cầu hai lần dung tích tháp trích ly Cho nước chảy liên tục vào ống làm lạnh Trích ly chất béo + Đun từ từ dung mơi bình cầu bếp cách thủy nhiệt độ 40-600 C + Dung môi sôi, bay gặp lạnh, ngưng tụ tháp trích ly, thời gian này, dung mơi trích ly chất béo, đến dung mơi tháp trích ly vượt q đầu ống xiphơng tràn bình cầu kéo theo chất béo, ta gọi chu trình Dung mơi lại tiếp tục bay hơi, cịn chất béo có nhiệt độ sơi cao nên khơng bay hơi, cịn chất béo có nhiệt độ sơi cao khơng bay lại bình cầu, trình lại diễn tiếp tục + Để tránh tổn thất dung môi, dung môi bình cầu khơng sơi mạnh, đảm bảo khoảng - chu trình Trong trình chiết cần ý kiểm tra nước làm lạnh, lượng dung mơi Muốn biết q trình chiết kết thúc hay chưa, lấy túi giấy lọc cho nhỏ vài giọt vào mặt kính đồng hồ tờ giấy lọc, dung mơi bay hết, mặt kính hay mặt giấy lọc khơng có vết chất béo q trình chiết kết thúc Cất dung mơi + Sau trình chiết kết thúc, bỏ túi giấy lọc tiến hành cất dung môi tháp để thu hồi dung môi (trường hợp dung môi bình cầu đục, có lẫn bột nghiền phải lọc qua giấy lọc cất thu hồi dung mơi) + Chuyển chất béo bình cầu vào cốc thủy tinh (đã sấy khô biết khối lượng) tráng bình cầu dung mơi + Sau cho cốc thủy tinh vào tủ sấy, sấy nhiệt độ 100-1050 C giờ, lấy để nguội bình hút ẩm cân, sấy tiếp 30 phút, sấy đến trọng lượng sai lệch không 0,002gam - Tính kết Hàm lượng chất béo mẫu tính % theo cơng thức: X=  m1  m2  *100 G Trong đó: m1: khối lượng cốc (g) m2: khối lượng cốc khối lượng chất béo sau sấy(g) G: khối lượng mẫu (g) Phương pháp xác định hàm lượng protein - Nguyên tắc: Mẫu vô hố H2SO4đđ nhiệt độ cao có chất xúc tác Các phản ứng q trình vơ hoá mẫu xảy sau: 2H2SO4 = H2O + 2SO2 + O2 Oxy tạo thành phản ứng lại oxy hoá nguyên tố khác Các phân tử chứa nitơ tác dụng H2SO4 tạo thành NH3 Các protein bị thuỷ phân thành axit amin Cacbon hydro axit amin tạo thành CO2 H2O, cịn nitơ giải phóng dạng NH3 kết hợp với axit H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan dung dịch 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 Các nguyên tố khoáng khác P, K, Ca, Mg,…chuyển thành dạng oxit: P2O5, K2O, CaO, MgO…tuy tồn dung dịch mẫu khơng ảnh hưởng đến kết phân tích Đuổi amoniac khỏi dung dịch NaOH (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + H2O + 2NH3 NH3 bay cất lại thu vào bình chứa H2SO4 biết trước số lượng Căn vào lượng H2SO4 dư sau cất ta biết lượng NH3 thoát biết lượng nitơ chứa mẫu phân tích - Dụng cụ vật liệu thuốc thử Thiết bị: + Cân phân tích + Máy phân tích đạm Kjeldahl + Máy cất nước Hoá chất: + Hỗn hợp xúc tác: K2SO4 CuSO4 theo tỷ lệ 3:1 + Nước cất + NaOH 40% + H2SO4 đậm đặc + H2SO4 0,1N chuẩn + NaOH 0,1N chuẩn + Thuốc thử hỗn hợp: methyl đỏ 0,1% pha cồn methyl xanh 0,1% pha cồn, tỷ lệ 2:1 - Tiến hành: Cân 1,0-1,5g mẫu vào bình Kjeldahl khơ (chú ý khơng để mẫu dính lên thành bình) Cho thêm 10-20ml H2SO4 đậm đặc hỗn hợp xúc tác: K2SO4 CuSO4 Đậy bình, lắc nhẹ đặt lên bếp đun đến màu khoảng thời gian 2-3 Chuyển tồn dung dịch sang bình định mức 50 100ml, tráng bình Kjeldahl vài lần nước cất đổ vào bình định mức Lấy 10-20ml dung dịch vơ hóa cho vào bình cất Rót từ từ 70ml NaOH 40% vào bình cất, lắp vào cất đạm Ở bình tam giác hứng cho lượng xác định H 2SO4 0,1N (ngập đầu ống hứng) vài giọt thuốc thử hỗn hợp metyl Bật bếp trước lắp bình để giảm thiểu nguy chất lỏng chảy ngược vào ống ngưng Lắc bình để đảm bảo trộn nhanh cấp nhiệt Đun bình phản ứng, NH3 bay lên với nước qua ống ngưng sang bình hứng tác dung với H2SO4 0,1N Trong trình cất, theo dõi bình hứng, thấy dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu mạ cho thêm 5ml H2SO4 0,1N nữa, cần làm nhanh để tránh nitơ Tiến hành chưng cất 30-40 phút Kiểm tra NH3 hết chưa cách hứng dịch cất thử giấy đo pH Khi NH3 cất hồn tồn, hạ thấp bình hứng, dùng tia nước cất tráng axit dính đầu ống Chuẩn độ axit dư dung dịch NaOH 0,1N chuẩn - Tính kết Hàm lượng nitơ tổng số: Nt = Trong đó:  n1 – n2  * 1, 42 * 100 m * 100 – w n1: số ml H2SO4 0,1N cho vào bình hứng; n2: số ml NaOH 0,1N dùng chuẩn độ; m: khối lượng mẫu dùng để vô hóa ứng với thể tích mẫu lấy để định lượng nitơ (g) w: độ ẩm mẫu, % 1,42: số mg nitơ ứng với ml H2SO4 0,1N Phương pháp xác định hàm lượng tinh bột - Nguyên tắc: Hàm lượng tinh bột hiệu số hàm lượng gluxit tổng số hàm lượng đường tổng số xác định theo phương pháp Bectrang nhân với hệ số 0,9 Phương pháp Bectran phương pháp dựa nguyên tắc chiết đường tổng số từ mẫu nước nóng, dùng axit clohydric thủy phân thành đường glucoza, lượng glucoza xác định qua phản ứng với dung dịch pheling, sắt (III) sunfat kali pemanganat - Dụng cụ vật liệu thuốc thử: + Cân phân tích; + Bình tam giác dung tích 250 500ml; + Nút cao su có gắn sinh hàm ngược ống thủy tinh đường kính 2cm, dài 1m; + Bình định mức, dung tích 250 500ml; + Phễu lọc; + Pipet 25ml; + Buret 10; 25ml; + Ống đong 10; 50ml; + Cốc thủy tinh có mỏ dung tích 50; 250ml; + Bình hút lọc dung tích 500; 1000ml; + Bơm chân khơng vịi hút Burner; + Bếp cách thủy điều chỉnh nhiệt độ; + Axit clohydric 1/3; + Chì axetat 10% kẽm axetat 20%; + Kali oxalat bão hòa dinatriphotphat bão hòa; + Natri hydroxit 20%; + Phenolphtalein 0,1% etanola 600; + Sắt (III) sunfat 5%: hòa tan 50g sắt (III) sunfat 200ml nước có chứa sẵn 108ml axit sunfuric đặc (d = 1,84), khuấy tan, thêm nước đến 1000ml Dung dịch phải khử sắt (II) oxyt kalipermanganat 0,1N có màu phớt hồng; + Kalipermanganat 0,1N; + Pheling A: Hòa tan 69,2g đồng sunfat 500ml nước cất, thêm 10ml axit sunfuric đặc để dễ tan, thêm nước cất đến 1000ml, lắc kỹ, lọc; + Pheling B: Hòa tan 346g kali natri tactrat 500ml nước cất; hòa tan 100g natri hydroxit 500ml nước cất, đổ chung hai dung dịch với nhau, thêm nước đến 1000ml, lắc kỹ, lọc - Tiến hành: a Xác định hàm lượng đường tổng số: Cân - 20g mẫu chuẩn bị, chuyển tồn vào bình tam giác 250ml, tráng kỹ cốc cân nước cất, lượng nước cho vào bình 1/2 thể tích, đậy bình nút cao su có gắn ống sinh hàn ống thủy tinh Đun bếp cách thủy 80 0C 15 phút Lấy để nguội Thêm 10ml chì axetat 10% lắc kỹ để kết tủa protit có mẫu Có thể kiểm tra việc loại protit hoàn toàn cách để lắng mẫu rót từ từ theo thành bình dịng mảnh chì axetat 10%, chỗ tiếp xúc hai dung dịch khơng hình thành kết tủa loại protit hồn tồn, cịn kết tủa cần thêm dung dịch chì axetat Để lắng Thêm vào mẫu - 10ml dung dịch kalioxalat bão hịa, lắc kỹ để loại chì dư Để lắng Lọc qua giấy lọc gấp nếp, thu dịch lọc vào bình định mức 500ml, rửa kỹ kết tủa, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ Hút 50 - 100ml dịch lọc chuyển vào bình tam giác 250ml thêm 15ml axit clohydric 1/3, đậy nút cao su có cắm ống thủy tinh, đun bếp cách thủy sôi 15 phút lấy để nguội Trung hòa dung dịch mẫu natri hydroxit 30% thử giấy thị Chuyển toàn dịch mẫu vào bình định mức 250ml, thêm nước cất đến vạch, lắc kỹ Hút 10 - 25ml dung dịch mẫu vào bình tam giác 250ml, cho vào bình hỗn hợp gồm 25ml dung dịch pheling A 25ml dung dịch pheling B, lắc nhẹ, đặt bếp điện có lưới amiăng đun phút kể từ lúc sôi Để nguội bớt lắng kết tủa đồng oxyt Lắp hệ thống lọc (xem hình vẽ) Lọc dung dịch qua phễu lọc G1 Chú ý để lúc mặt kết tủa có lớp dung dịch hay nước cất Rửa kỹ kết tủa phễu lọc vào bình tam giác nước cất đun sơi Chuyển phễu lọc sang bình tam giác có kết tủa, hịa tan kết tủa phễu vào bình 10 - 20ml dung dịch sắt (III) sunfat 5% Cốc lọc xốp Bình hút có nhánh Ra bơm chân khơng vịi hút Busner Chuẩn độ lượng sắt (II) hình thành bình tam giác dung dịch kali pemanganat 0,1N dung dịch có mầu hồng sẫm bền vững phút Ghi số ml kalipemanganat 0,1N dùng - Tính kết Từ số ml kalipemanganat 0,1N dùng tra bảng Bectrang số mg glucoza tương ứng, chuyển gam Hàm lượng đường tổng số (X) tính % theo cơng thức: X  a.V1.V3.100 m.V V2 Trong đó: a - lượng glucoza tương ứng, g; V - thể tích bình định mức mẫu để khử protit, ml; V1 - thể tích mẫu lấy để thủy phân, ml; V2 - thể tích bình định mức mẫu thủy phân, ml; V3 - thể tích mẫu lấy để làm phản ứng với pheling, ml; m - lượng cân mẫu, g b Xác định hàm lượng gluxit tổng số Cân 5-20g mẫu, chuyển toàn vào bình tam giác dung tích 250ml, tráng kỹ cốc cân nước cất, lượng nước cho vào bình khoảng 100-150ml Thêm 5ml axit clohydric đặc vào bình khoảng 100 -150 ml Thêm 50 ml axit clohydric đặc vào bình mẫu, đậy nút cao su có cắm ống sinh hàn ngược đun bếp cách thuỷ sôi Lấy bình làm nguội, trung hồ mẫu natri hydroxit 30%, khử protit, lọc, định mức theo điều 1.5.Hút 5-25ml dịch lọc, chuyển vào bình tam giác dung tích 250ml, thêm vào bình 50ml hỗn hợp pheling A, B tiếp tục đun, lọc, hoà tan chuẩn độ điều 1.5 Ghi số ml kali pemanganat 0,1N dùng Hàm lượng gluxit tổng số(X1) tính % theo cơng thức: Trong đó: a - lượng glucoza tương ứng, g; V - thể tích bình định mức mẫu để khử protit, ml; V1 - thể tích mẫu lấy để làm phản ứng với pheling, ml; m - lượng cân mẫu, g c Hàm lượng tinh bột xác định là: X2 = ( X1 – X) 0,9 PHỤ LỤC Xây dựng đường chuẩn tyrosin Nồng độ tyrosin (µg/ml) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Kết đo quang 0,196 0,293 0,398 0,587 0,697 0,815 0,913 1,032 1,172 1,202 0,195 0,298 0,402 0,557 0,699 0,82 0,927 1,127 1,131 1,281 0,195 0,297 0,402 0,586 0,699 0,82 0,918 1,029 1,132 1,295 Giá trị trung bình kết đo quang 0,0 0,2 0,3 0,4 0,6 0,7 0,8 0,9 1,1 1,1 1,3 PHỤ LỤC Xây dựng đường cong sinh trưởng vi khuẩn Bacillus subtilis natto Thời gian (h) Mật độ tế bào x106 (CFU/ml) Log(CFU/ml) 12 16 20 24 28 32 36 40 44 23 31 73,5 135 195 397 885,6 1.592 1.923 2.015 1.132 761 7,36 7,49 78,6 8,13 8,24 8,60 8,90 9,20 9,28 9,30 9,13 8,88 PHỤ LỤC Khảo sát yếu tố ảnh hưởng trình lên men Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men Thời gian lên men (giờ) 20 22 24 26 28 Kết đo quang Mẫu Mẫu 0,380 0,383 0,564 0,424 0,467 0,376 0,395 0,524 0,445 0,393 Hoạt độ (đv/ml) 1,17c  0,021 1,27bc  0,085 3,26a  0,455 1,76b  0,170 1,74bc  0,601 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống Tỷ lệ giống % (v/w) 10 12 14 16 18 Kết đo quang Mẫu Mẫu 0,547 0,627 0,656 0,553 0,551 0,523 0,614 0,667 0,571 0,539 Hoạt độ (đv/ml) 3,04c  0,255 4,48b  0,170 5,27a  0,156 3,47c  0,205 3,20c  0,134 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ bột dậu nành bổ sung vào môi trường lên men Tỷ lệ bột đậu nành % (w/w) 10 20 30 40 Kết đo quang Mẫu Mẫu 0.779 0.917 0.951 0.832 0.766 0.909 0.841 0.825 Hoạt độ (đv/ml) 7,86c  0,219 11,67a  0,170 9,76b  0,191 9,29b  0,141 PHỤ LỤC Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cồn 96% dịch chiết enzyme thô thu nhận kết tủa enzyme Tỷ lệ ethanol: dịch chiết enzyme thô (v/v) 1/1 1,5/1 2/1 2,5/1 Khối lượng kết tủa (g) Mẫu Mẫu 18.03 19.98 13.83 13.83 17.12 19.76 14.24 14.03 Giá trị trung bình khối lượng kết tủa (g) 17.58b  0,643 19.87a  0,156 14.04c  0,290 13.93c  0,100