41 Trong đó A T : độ hấp thu OD của dung dịch phản ứng enzyme A B : độ hấp thu OD của phản ứng thử không F: hệ số glucose (mg/ml) 1000: chuyển từ mg sang μg 180: trọng lượng phân tử của glucose, đổi từ μg sang μmol 10 phút: thời gian phản ứng C: nồng độ dung dịch mẫu (g/ml) iii. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp so màu Nguyên tắc Xác định lượng galacturonic acid là sản phẩm của quá trình thủy phân pectin dưới tác dụng của pectinase không kết tủa bằng ZnSO 4 Cách tiến hành Cho 20 ml dung dịch pectin 1 % vào ống nghiệm rồi tiếp theo cho 10 ml dung dịch enzyme 1 %, lắc đều và cho vào tủ ấm ở 30 o C (dung dịch pectin có pH = 3,9 – 4,1). Sau 60 phút lấy ra thêm vào 2 ml ZnSO 4 15 %, đem lọc qua giấy lọc, dung dịch lọc được đem pha loãng gấp 5 lần dùng cho phản ứng với Antron Lấy 5 ml Antron cho vào ống nghiệm, rồi cho 2.5 ml dung dịch lọc đã pha loãng, lắc mạnh trong thời gian 10 phút. Sau đó đặt trong nồi cách thủy ở 70 o C trong thời gian 12 phút. Sau đó lấy ra làm nguội đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo giá trị OD ở bước sóng 584 nm. Tính kết quả Hoạt tính pectinase được tính bằng công thức 0,340. 0,0104OD DVHT m − = Trong đó OD: mật độ quang của dung dịch sau khi phản ứng với antron m: lượng enzyme lấy tiến hành phản ứng (g hoặc ml) 42 3.5.5 Qui trình sản xuất bột ca cao trong phòng thí nghiệm Rửa sạch Sấy khô Làm nguội Hạt ca cao tươi Ủ Chế phẩm sinh học Sấy khô Loại hạt lép, sâu Rang, 20’, t = 140 o C Tách vỏ Đập nhỏ hạt nhân Kiềm hóa bằng dd Na 2 CO 3 3% , 80 o C , 45’ Xay nhuyễn Ép bơ bằng máy ép thủy lực Xay nhuyễn ở nhiệt độ lạnh Bột ca cao 43 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 XÁC ĐỊNH CÁC THÀNH PHẦN CHỦ YẾU CỦA HẠT CA CAO Bảng 4.1: Các thành phần chủ yếu có trong hạt ca cao tươi STT Thành phần Phần trăm so với khối lượng Chất nhầy Hạt nhân 1 Độ pH 3.5 4.5 2 Đường tổng số hòa tan (%) 14 1.6 3 Hàm lượng đường khử (%) 9 4 Hàm lượng pectin (%) 9.568 11 5 Hàm lượng tro (%) 2.2 3 6 Tổng lượng hữu cơ (%) 97.78 97 7 Nitơ tổng % 2.26 8 Hàm lượng cellulose (%) 1.89 16 (nguồn từ kết quả thực nghiệm) Nhận xét Từ các số liệu thu thập được, chúng tôi nhận thấy rằng chất hữu cơ là một thành phần chiếm chủ yếu trong hạt ca cao. Trong đó, ở cả lớp nhầy và hạt nhân chúng tôi đều nhận thấy thành phần pectin và cellulose chiếm một tỷ lệ khá lớn. Ở lớp nhầy hàm lượng pectin và cellulose tương ứng là 9.568 % và 1.89 %. Còn trong phần hạt nhân tỷ lệ là 11 % pectin và 16 % cellulose. Cellulose và pectin là những thành phần rất bền và khó phân giải nếu chỉ sử dụng các tác nhân hóa học, nhiệt độ hay cơ học… Trong tế bào thực vật, cellulose và pectin phân bố chủ yếu ở lớp vỏ tế bào. Do khả năng khó bị phá vỡ nên chúng cản trở những thành phần hòa tan có trong tế bào chiết ra môi trường bên ngoài. Chính những thành phần hòa tan này mới dễ được cơ thể hấp thụ và sử dụng. Vì vậy để tăng khả năng hòa tan của bột ca cao cần phải phá vỡ những cấu 44 trúc pectin và cellulose bền vững bằng phương pháp sinh học. Chúng tôi chọn nấm mốc Aspergillus niger là loại vi sinh vật có khả năng tạo enzyme cellulase, pectinase cao và đã được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm để bổ sung vào quá trình lên men. 4.2 TUYỀN CHỌN GIỐNG VI SINH VẬT THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN HẠT CA CAO Chúng tôi tiến hành so sánh dựa trên hai giống nấm mốc được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Khoa học tự nhiên và tại phòng thí nghiệm công nghê sinh học trường Đại học Bách khoa. Nuôi hai giống Asp. niger trong cùng một điều kiện môi trường có 9 % cà rốt, trấu 15 %, cám 75 %, và 1% (NH 4 )SO 4 , độ ẩm 64 %, thời gian 48 giờ. Thí nghiệm được lập lại 3 lần. Bảng 4.2:So sánh hoạt tính enzyme cellulase và pectinase do hai giống Asp. niger lấy từ trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên và Đại Học Bách Khoa tạo ra Giống Asp. niger Bách Khoa Asp. niger Tự Nhiên Hoạt tính cellulase 2.3 UI/g MT 1.9 UI/g MT Hoạt tính pectinase 650 đvht/g MT 600 đvht/g MT (nguồn từ thực nghiệm) Nhận xét Mục đích của việc tuyển chọn là chọn ra giống Asp. niger có khả năng tạo enzyme cellulase và pectinase có hoạt tính cao nhất. Từ kết quả thực nghiệm chúng tôi nhận thấy rằng giống Asp. niger được lấy từ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Đại học Bách Khoa cho enzyme cellulase và pectinase có hoạt tính cao hơn hẳn so với giống Asp. niger được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đai học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh. Được biết giống Asp. niger của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Đại học Bách Khoa Tp.HCM là giống nấm mốc đã được tuyển chọn không sinh độc tố thích hợp cho việc sử dụng trong công nghệ thực phẩm. Chúng tôi quyết 45 định chọn giống Asp. niger của trường Đại học Bách Khoa để lên men trong các thí nghiệm tiếp theo. 4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ GIỮA GIỐNG VI SINH VẬT VỚI BỘT MÌ RANG ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO Chúng tôi sử dụng giống Asp. niger được lấy từ Bộ môn Công nghệ sinh học Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh trong thí nghiệm này. Tiến hành cùng lúc 4 thí nghiệm như đã nêu ở phần 3.5.1.2. 4.3.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan Bảng 4.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa giống vi sinh vật với bột mì rang đến độ hòa tan Tỷ lệ giống : bột mì rang 1:1 1:2 1:3 1:4 Độ hòa tan 2.4 2.5 2.8 2.5 2.4 2.5 2.8 2.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 1\1 1\2 1\3 1\4 Tỷ lệ giống/bột mì rang Độ hòa tan Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống/bột mì rang đến độ hòa tan 46 Nhận xét Trong quá trình phát triển nấm Aspergillus niger tiết ra các enzyme như cellulase, pectinase phá vỡ cấu trúc cellulose và pectin trong hạt cacao nên những chất tan có trong hạt cacao có khả năng tan vào dung dịch dễ dàng hơn. Do đó độ hòa tan tỷ lệ thuận với khả năng phân giải của enzyme cellulase và pectinase. Một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tiết enzyme là thành phần môi trường dinh dưỡng. Bột mì rang được trộn chung với Asp. niger có tác dụng như là một nguồn dinh dưỡng giúp cho sự phát triển của nấm mốc. Trong bột mì có nhiều thành phần thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm mốc. Áp lực về nồng độ cơ chất lên nấm mốc sẽ điều chỉnh lượng enzyme tiết ra nhiều hay ít. Tuy nhiên, không phải cứ tăng hàm lượng cơ chất thì sự sinh tổng hợp enzyme cũng tăng theo, mà khi đến một ngưỡng nhất định thì sự tổng hợp enzyme không thể tăng nữa. Sự tổng hợp enzyme tùy thuộc vào năng lực tiết đối đa của từng loại vi sinh vật, mỗi loài có một ngưỡng nhất định. Ngoài ra nếu tăng hàm lượng cơ chất vượt quá một giới hạn nhất định thì hoạt tính enzyme sẽ giảm do hai lý do, thứ nhất cơ chất tạo áp lực làm giảm quá trình sinh tổng hợp; thứ hai cơ chất tăng trong khi năng lực tiết tối đa không đổi làm hoạt tính enzyme giảm. Trong thí nghiệm này chúng tôi xác định được tỷ lệ giống Asp. niger : bột mì rang tối ưu nhất để tăng độ hòa tan của cacao là 1:3. 4.3.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu Bảng 4.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa giống vi sinh vật với bột mì rang đến cường độ màu Tỷ lệ giống : bột mì rang 1:1 1:2 1:3 1:4 Cường độ màu 1.98 2.134 2.229 2.028 47 1.98 2.056 2.229 2.028 0 0.5 1 1.5 2 2.5 1 1/2 1/3 1/4 Tỷ lệ giống/bột mì rang Cường độ màu Đồ thị 4.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống/bột mì rang đến cường độ màu Nhận xét Từ những khảo sát thực tế (như đã nêu ở mục 3.5.3.3) chúng tôi đã xác định được dung dịch ca cao hấp thụ bước sóng 390 nm cao nhất. Trong luận văn này chúng tôi sử dụng bước sóng 390 nm để xác định cường độ màu của dung dịch ca cao. Màu của dung dịch lọc từ bột ca cao là do các chất hòa tan tạo thành. Do đó cường độ màu của dung dịch ca cao càng cao thì độ hòa tan càng nhiều và ngược lại. Trong thí nghiệm này chúng tôi xác định được cường độ màu của dung dịch ca cao cao nhất ở tỷ lệ 3 bột mì rang : 1 giống Asp. niger 4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA LƯỢNG CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG ĐỂ LÊN MEN ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO Dựa vào kết quả thu được từ thí nghiệm trên chúng tôi chọn tỷ lệ 3 bột mì rang / 1 giống Asp. niger để tạo chế phẩm enzyme. Thí nghiệm được thiết kế như đã nêu ở phần 3.5.1.3. 48 4.4.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan Bảng 4.5: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm sinh học đến độ hòa tan Lượng chế phẩm sinh học (%) 0.5 1 3 5 Độ hòa tan 3.0 3.4 3.1 2.8 3 3.4 3.1 2.8 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 0.5% 1% 3% 5% Lượng chế phẩm sinh học Độ hòa tan Đồ thị 4.3: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm sinh học đến độ hòa tan Nhận xét Độ hòa tan của dung dịch là lượng chất hòa tan có trong dung dịch đó. Tỷ lệ chế phẩm cho vào càng nhiều thì khả năng phân giải các chất phức tạp càng cao. Khi đó các chất hòa tan càng dễ chiết ra khỏi ca cao để hòa tan vào dung dịch. Tuy nhiên không phải càng nhiều chế phẩm thì lượng chất hòa tan càng tạo ra nhiều. Vi sinh vật cần có đủ lượng cơ chất cần thiết để phát triển. Vì vậy nếu bổ sung lượng chế phẩm sinh học quá lớn thì nhu cầu về cơ chất của nấm mốc càng cao. Khi đó nấm mốc sẽ sử dụng những chất hòa tan để tiếp tục phát triển, làm cho độ hòa tan giảm đi. Trong thí nghiệm này chúng tôi nhận thấy ở tỷ lệ 0.5% chế phẩm lượng chế phẩm còn ít nên khả năng phân giải không cao dẫn đến tỷ lệ hòa tan thấp. Ở tỷ lệ 1% chế phẩm trên tổng lượng ca cao lên men cho kết quả độ hòa tan cao nhất. Những tỷ lệ chế phẩm cao hơn 3%, và 5% đều cho kết quả là độ hòa tan giảm mạnh. 49 4.4.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu Bảng 4.6: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm sinh học đến cường độ màu Lượng chế phẩm sinh học 0.5 % 1 % 3 % 5 % Cường độ màu 2.163 2.178 2.148 2.174 2.163 2.306 2.248 2.204 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0.5% 1% 3% 5% Lượng chế phẩm sinh học Cường độ màu Đồ thị 4.4: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm đến cường độ màu Nhận xét Những chất chiết hòa tan tạo ra màu sắc của dịch ca cao. Lượng chất hòa tan trong dung dịch càng cao thì cường độ màu khi đo càng lớn. Trong thí nghiệm này chúng tôi nhận ra rằng khi lượng chế phẩm sử dụng ở mức 0,5 %, khả năng phân giải của nấm mốc không cao nên lượng chất tan sinh ra không nhiều, cường độ màu cũng ở mức thấp. Lượng chất tan thu được ở tỷ lệ chế phẩm 1% là cao nhất 2,178 kéo theo cường độ màu đạt được ở mức cao nhất. Ở những tỷ lệ chế phẩm cao hơn 3% và 5% khi nhu cầu cơ chất của nấm mốc tăng cao, nấm mốc phải sử dụng những chiết chất hòa tan do đó lượng chiết chất hòa tan trong dung dịch giảm xuống rõ rệt do đó cường độ màu cũng giảm theo tỷ lệ thuận. 50 4.5 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ ẨM KHỐI LÊN MEN ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO Từ kết quả đạt được ở những thí nghiệm trước chúng tôi chọn giống Asp. niger của trường Đại học Bách Khoa, tỷ lệ giống vi sinh vật / bột mì rang là 1:3 để tạo chế phẩm sinh học, lượng chế phẩm sử dụng để lên men là 1 % khối lên men để áp dụng cho thí nghiệm này. Thí nghiệm được thiết kế như đã đề cập ở mục 3.5.1.4 4.5.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan Bảng 4.7: Ảnh hưởng của độ ẩm khối lên men đến độ hòa tan Độ ẩm khối lên men 50% 55% 60% 65% Độ hòa tan 2.8 3.3 3.8 3.5 2.8 3.3 3.8 3.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 50% 55% 60% 65% Độ ẩm khối lên men Độ hòa tan Đồ thị 4.5: Ảnh hưởng của độ ẩm khối lên men đến độ hòa tan Nhận xét Hầu như các quá trình sống của nấm đều có liên quan đến nước do đó độ ẩm là một yếu tố quan trọng của môi trường. Nếu độ ẩm quá thấp tức lượng nước trong môi trường thấp thì xảy ra hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào nấm mốc làm tế bào bị chết. Nhưng nếu độ ẩm quá cao thì cũng không tốt cho sự sinh trưởng và phát triển. Chỉ ở . của cacao là 1:3 . 4.3.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu Bảng 4. 4: Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa giống vi sinh vật với bột mì rang đến cường độ màu Tỷ lệ giống : bột mì rang 1:1 1:2 1:3 1:4 Cường. hòa tan Bảng 4. 3: Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa giống vi sinh vật với bột mì rang đến độ hòa tan Tỷ lệ giống : bột mì rang 1:1 1:2 1:3 1:4 Độ hòa tan 2.4 2.5 2.8 2.5 2.4 2.5 2.8 2.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 11. hòa tan của bột ca cao cần phải phá vỡ những cấu 44 trúc pectin và cellulose bền vững bằng phương pháp sinh học. Chúng tôi chọn nấm mốc Aspergillus niger là loại vi sinh vật có khả năng tạo