31 H 3 BO 3 HClO 3 Lactose Na 2 HPO 4 CaCl 2 CuSO 4 Na 2 CO 3 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1 Phương pháp thiết kế thí nghiệm 3.5.1.1 Tuyển chọn giống Asp. niger thích hợp nhất cho quá trình lên men Nuôi cấy hai giống Asp. niger nghiên cứu trên hai môi trường có cùng điều kiện. Giống Asp. niger được cấy truyền trên môi trường thạch malt. Sau đó hai giống Asp. niger nghiên cứu được nhân giống trên môi trường bán rắn có thành phần 75 % cám gạo, 15 % trấu, 9 % bột cà rốt và 1 % (NH 4 )SO 4 , độ ẩm 64 % trong 40 giờ. Sau khi kết thúc quá trình nhân giống chúng tôi tiến hành xác định họat tính của 2 loại enzyme: cellulase, pectinase. 3.5.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ: giống Asp. niger/bột mì rang của chế phẩm lên men đến độ hòa tan và cường độ màu Kết quả tuyển chọn giống vi sinh vật ở trên được áp dụng cho thí nghiệm này. Giống Asp. niger đã tuyển chọn sau khi thu từ môi trường nhân giống được trộn với bột mì rang. Tỷ lệ giống Asp. niger so với bột mì rang sử dụng trong thí nghiệm là 1:1, 1:2, 1:3 và 1:4. Độ ẩm của chế phẩm là 55 %, giữ chế phẩm ở 34.5 o C trong 5 ngày. Độ ẩm khối lên men là 55 %. Cố định lượng chế phẩm dùng lên men là 3 % khối lượng khối hạt ca cao lên men. 3.5.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng chế phẩm enzyme sử dụng để lên men đến độ hòa tan và cường độ màu Kết quả khảo sát thu được từ hai thí nghiệm trên tiếp tục được sử dụng trong thí nghiệm này. Cố định giống vi sinh vật, tỷ lệ chế phẩm tối ưu, giữ độ ẩm chế phẩm ở 32 55 %. Độ ẩm khối lên men được giữ ở 55 % trong suốt quá trình lên men. Thay đổi lượng chế phẩm lên men như sau: 0.5 %, 1 %, 3 %, 5 % so với khối lượng hạt ca cao đem lên men. Thời gian lên men là 5 ngày. 3.5.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm của khối lên men đến độ hòa tan và cường độ màu Áp dụng những kết quả tối ưu thu được từ các thí nghiệm trước đó chúng tôi cố định giống vi sinh vật, tỷ lệ chế phẩm, lượng chế phẩm sử dụng. Chúng tôi bố trí các mẫu mẫu lên men có độ ẩm thay đổi lần lượt: 50 %, 55 %, 60 %, 65 %. Thời gian lên men là 5 ngày. 3.5.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến độ hòa tan và cường độ màu Sử dụng các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi cố định các yếu tố sau: giống vi sinh vật, tỷ lệ chế phẩm lên men, lượng chế phẩm lên men sử dụng và độ ẩm của chế phẩm. Bố trí thí nghiệm lên men các mẫu cacao kết thúc ở các thời điểm: 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày, 6 ngày và 7 ngày. 3.5.1.6 So sánh độ hòa tan và cường độ màu của bột ca cao từ phương pháp lên men truyền thống và bột ca cao từ phương pháp lên men có bổ sung vi sinh vật Ứng dụng những kết quả đã đạt được ở các thí nghiệm trên trong việc lên men Mẫu ca cao lên men không bổ sung vi sinh vật được lấy từ hộ nông dân Nguyễn Văn Lập tại huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre. Tiến hành qui trình sản xuất bột ca cao trong cùng điều kiện cho cả hai mẫu hạt ca cao nói trên 3.5.2 Phương pháp vi sinh vật 3.5.2.1 Phương pháp cấy truyền và giữ giống Môi trường PGA pha chế và bỏ vào 1/3 ống nghiệm, thanh trùng ở 121 o C trong 15 phút, lấy ra và để nghiêng 45 o cho đến khi thạch đông cứng lại. Sử dụng que cấy móc đã thanh trùng cấy truyền sang môi trường PGA. Giống sau khi cấy được nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 3 ngày sau đó được bảo quản ở 4 o C. Sau 2 tháng phải cấy truyền sang môi trường giữ giống mới. 33 3.5.2.2 Phương pháp nhân giống Cho 10 ml nước cất đã thanh trùng vào ống nghiệm chứa nấm mốc đã cấy chuyền ở trên, dùng que cấy đã thanh trùng cào nhẹ trên mặt thạch để bào tử hòa vào trong nước càng nhiều càng tốt. Sau đó đổ dung dịch đó môi trường bán rắn đã chuẩn bị ở trên, trộn đều, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày để sử dụng tiếp. 3.5.3 Phương pháp hóa lý 3.5.3.1 Xác định độ ẩm Sấy khô đĩa petri đến khối lượng không đổi rồi đem cân xác định trọng lượng đĩa (m 1 ). Cân một lượng chính xác 10 g mẫu cần phân tích đựng trên đĩa petri. Đem sấy khô mẫu ở 100-105 o C đến trọng lượng không đổi (m 2 ). Thời gian sấy khô có thể lên đến 3 - 4 giờ. Trong quá trình sấy có thể dùng đũa thủy tinh đảo trộn để nước bốc hơi hết. Sau khi sấy xong đem ra để nguội trong bình hút ẩm trong 30 phút, sau đó đem cân. Trọng lượng được coi là không đổi khi chênh lệch giữa 2 lần cần kế tiếp không quá 0.03g. Độ ẩm được tính theo công thức: W(%) = (10 – (m 2 – m 1 )) x 100/10 Trong đó: W: độ ẩm của mẫu (%) 10: khối lượng mẫu ban đầu (g) m 1 : khối lượng đĩa petri (g) m 2 : khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi sấy (g) m 2 – m 1 : khối lượng mẫu sau khi sấy 3.5.3.2 Phương pháp xác định độ hòa tan và cường độ màu của dung dịch ca cao Độ hòa tan trong luận văn này được định nghĩa là lượng chất tan (tính bằng g) có trong 10 g bột ca cao, chỉ tiêu này được xác định bằng khúc xạ kế Cân 10 g bột ca cao cho vào một becher, bổ sung 30 ml nước sôi, lọc lấy dịch giữ lại cặn, thêm 20 ml nước sôi vào cặn trên, lọc lấy dịch. Dung dịch này được đem đi xác định độ hòa tan bằng cách dùng khúc xạ kế. 34 Cũng dung dịch trên được đem đi xác định cường độ màu bằng máy đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng thích hợp 3.5.3.3 Phương pháp xác định bước sóng mà dung dịch ca cao hấp thu mạnh nhất Thu dung dịch ca cao như trên. Tiến hành pha loãng lần lượt dung dịch trên thành 6 nồng độ khác nhau: pha loãng 1 lần, 2 lần. 3 lần. 4 lần. 5 lần. 6 lần. Đem đo độ hấp thụ ánh sáng bằng máy đo quang phổ ở các bước sóng khác nhau. Bước sóng mà cho giá trị hấp thụ cao nhất được xác định là bước sóng để đo độ hấp thụ của dung dịch ca cao. 3.5.4 Phương pháp hóa sinh 3.5.4.1 Các phương pháp xác định các thành phần chủ yếu của hạt cacao i. Phương pháp xác định độ tro của hạt cacao Cân chính xác khoảng 2 – 5 g hạt cacao trong một chén sứ đã biết trọng lượng khô tuyệt đối, cho thêm vào chén sứ 5 giọt HNO 3 đậm đặc và 1 – 2 giọt H 2 O 2 30%, cho vào lò nung ở 500 – 550 o C cho đến khi nguyên liệu biến thành tro trắng như tàn thuốc lá. Lấy chén sứ ra và cho ngay vào bình hút ẩm, để nguội và cân chính xác. Tổng lượng tro được tính như sau: Tổng lượng tro (%) = Trọng lượng tro x 100/ trọng lượng mẫu khô ii. Tổng hữu cơ Cấu trúc hữu cơ của sinh vật dễ bị phá huỷ bởi các tác nhân kiềm hay acid mạnh có tính oxy hoá ở nhiệt độ cao. Các chất hữu cơ bị oxy hoá hoàn toàn chuyển thành CO 2 và nước bay ra khỏi chén sứ. Vì thế cách tính tổng hữu cơ như sau: iii. Phương pháp xác định N tổng số của hạt cacao Tổng hữu cơ (%) = 100 % - Tổng tro hữu cơ (%) N tổng số = N protein + N phi protein Trước tiên ta phải vô cơ hóa mẫu để biến đổi tất cả các loại đạm nằm dưới dạng nào đều trở thành dạng hợp chất vô cơ là amonium sulfate (NH 4 )SO 4 Vô cơ hóa Nguyên tắc 35 Sự vô cớ hóa chất đạm là sự biến đổi tất cả các chất đạm dù dưới dạng nào (hữu cơ, protein, vô cơ) thành hợp chất vô cơ là amonium sulfate (NH 4 )SO 4 bằng cách đun sôi với H 2 SO 4 đậm đặc và chất xúc tác Thực hành : Cân chính xác 1 g nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho vào một bình cổ cao có dung tích 60 ml đến 100 ml (bình Kieldahl). Thêm vào đó 5 ml H 2 SO 4 đậm đặc và khoảng 0.5 g chất xúc tác. Đun sôi hỗn hợp trong tủ hút khí độc từ 2 đến 3 giờ cho đến khi dung dịch trở thành trong suốt và có màu xanh da trời nhạt. Để nguội và pha loãng thành 100 ml với nước cất. Chất xúc tác là hỗn hợp K 2 SO 4 và CuSO 4 tỷ lệ 9 : 1 Phương pháp Kieldahl Nguyên tắc : Chất đạm đã được vô cơ hóa nằm dưới dạng amonium sulfate đem cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac (NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH Æ 2NH 4 OH + Na 2 SO 4 Sau đó lượng amoniac được hơi nước lôi cuốn bằng dụng cụ máy Parnas- Wargner và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H 2 SO 4 . Từ đây cho phép ta xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu. Tiến hành Đun sôi bình nước của máy Parnas – Warner. Đặt bình tam giác có chứa 20ml H 2 SO 4 N/100 và vài giọt methyl vào phần đuôi của máy sao cho phần nhọn nhúng chìm vào dung dịch. Hút 10 ml dung dịch vô cơ hóa cho vào máy Parnas – Wargner, thêm vào đó 10 ml NaOH đậm đặc. Tiếp tục đun sôi bình nước và để cho hơi nước lôi cuốn amoniac sang bình tam giác trong 3 phút, hạ bình tam giác xuống và tiếp tục đun thêm 2 phút nữa, tráng vòi của máy bằng một tia nước cất, tất cả đều cho chảy vào bình tam giác đựng H 2 SO 4 N/100. Lấy bình tam giác ra và định phân H 2 SO 4 thừa bằng dung dịch NaOH N/100 cho đến khi dung dịch đổi màu. Tính toán Hàm lượng nitơ có trong mẫu được xác định theo công thức 12 ( ).1,42. .100 (%) VV f Nmg w − = 36 Trong đó V 1 : số ml H 2 SO 4 . 0,1N cho vào bình hứng V 2 : số ml NaOH dùng để chuẩn độ acid dư trong bình hứng f: hệ số điều chỉnh nồng độ H 2 SO 4 ở bình hứng, f=1 khi nồng độ H 2 SO 4 chính xác 0,1 N w: khối lượng mẫu dùng để vô cơ hóa mẫu ứng với thể tích dung dịch lấy mẫu để định lượng nitơ tương ứng với 1 ml H 2 SO 4 1,42: số mg nitơ iv. Phương pháp xác định đường tổng số hòa tan Nguyên tắc Sự định lượng này căn bản dựa trên phản ứng màu đặc trưng cho bởi đường và nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của H 2 SO 4 . Để tạo phản ứng màu có thể dùng thuốc thử khác nhau như phenol, antron hay orcinol Sự chính xác của kết quả này phụ thuộc: ¾ Độ sạch dụng cụ ¾ Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H 2 SO 4 ¾ Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian đun Tiến hành Nguyên liệu: lấy 1-2 g nguyên liệu tươi đã nghiền nhỏ chứa khoảng 5 – 50 mg đường Cho vào cốc thủy tinh 50 ml và thêm 10 ml cồn 90 % V vào. Đun sôi trên nồi cách thủy 3 lần Sau khi để nguội lọc qua lọc không tro Sau đó thêm 10 ml cồn 80 % V vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun hai lần tới sôi trên nồi cách thủy. Để nguội lại tiếp tục lọc. Chiết rút như vậy khoảng 2 lần, xong đưa bã lên lọc và rửa sạch 2 - 3 lần bằng rượu nóng 80 o Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong nồi cách thủy Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50 ml với nước cất Thực hiện phản ứng màu Hút 1 ml dung dịch đường cho vào ống nghiệm rồi đổ thêm 1 ml dung dịch phenol 5 %. Sau đó cho chính xác vào ống nghiệm 5 ml H 2 SO 4 đậm đặc. 37 Để 10 phút rồi lắc và giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30 o C để xuất hiện màu. Xác định cường độ màu trong quang phổ kế ở bước sóng 490 nm Xây dựng đồ thị mẫu Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch saccharose 0.1% mẫu trên, cho nước cất vào đến vạch định mức. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml cho vào ống nghiệm rồi nhuộm bằng phenol và H 2 SO 4 như đã nói ở trên. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương đương 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 μg saccharose. So màu rồi vẽ đồ thị mẫu. Mẫu thử không với 1ml nước cất thế dung dịch đường v. Phương pháp định lượng cellulose Nguyên tắc Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền đối với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu còn các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin… ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxy hóa phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu và dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid nitrit với acid acetic Tiến hành Cân 2 g hạt cacao đã nghiền nhỏ (sấy khô đến trọng lượng không đổi ở 100 – 105 o C), cho vào bình tam giác dung tích 250 ml Thêm vào bình 16.5 ml hỗn hợp gồm 1.5 ml acid nitric đậm đặc và 15 ml acid acetic đặc. Lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hỗn hợp 30 phút. Để nguội, pha loãng hỗn hợp bằng nước nóng. Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng Rửa kết tủa cellulose 3 lần bằng nước cất nóng (mỗi lần từ 10 – 15 ml) Rửa bằng rượu ethylic 96 % 1 – 2 lần, mỗi lần 10 – 15 ml Rửa bằng ete ethylic Sấy giấy lọc có chứa cellulose ở nhiệt độ 100 – 105 o C đến trọng lượng không đổi (2 – 3 giờ). Tùy theo nồng độ của thuốc thử đem dùng, cùng với cellulose thường còn lại một hàm lượng nhỏ hemicellulose chủ yếu là pentosan và lignin. Do đó cellulose xác định gọi là cellulose thô Tính kết quả Hàm lượng cellulose tính bằng công thức sau 38 .100a X w = Trong đó X: hàm lượng cellulose tính bằng % a: trọng lượng cellulose (g) w: trọng lượng mẫu thí nghiệm (g) 100: hệ số chuyển thành % vi. Phương pháp định lượng pectin Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở thu nhận muối canxi pectat ở dạng kết tủa Tiến hành Cân 0.15 g mẫu hạt cacao có chứa pectin vào becher 100 ml Cho thêm 100 ml NaOH 0,1 N Để hỗn hợp trong 7 giờ hoặc qua đêm để xà phòng hóa hoàn toàn pectin thành acid pectic Thêm 50 ml dung dịch CH 3 COOH Sau 5 phút thêm 50 ml dung dịch CH 3 COOH Đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc không tro đã được sấy khô tới trọng lượng không đổi Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho tới khi không còn ion clo nữa (thử nước rửa với dung dịch bạc nitrat 1 % không có kết tủa trắng) Sau khi rửa xong cho giấy lọc có kết tủa vào chén cân và sấy ở 105 o C cho đến khi trọng lượng không đổi Tính kết quả Hàm lượng của canxi pectat bằng hiệu của trọng lượng giấy lọc có kết tủa và giấy lọc không Hàm lượng pectin (P) tính theo công thức sau: .0,92.100w P B = Trong đó w: trọng lượng kết tủa canxi pectat (g) 39 B: lượng pectin lấy đem xà phòng hóa khoảng 0.15 (g) 0.92: Hệ số chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (nghĩa là pectin chiếm 92 % trọng lượng canxi pectat) 100: hệ số chuyển để biểu thị kết quả theo %. 3.5.4.2 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme của Asp. niger i. Phương pháp trích ly enzyme từ môi trường nuôi cấy Asp. niger Cân chính xác 1g môi trường nhân giống Asp. niger. Nghiền mẫu cùng bột thủy tinh trong môi trường lạnh 4 o C để tránh mất hoạt tính enzyme. Thêm 100 ml nước muối 0,3 %, khuấy đều rồi đem lọc qua giấy lọc thu dung dịch enzyme 1%. Giữ lạnh dung dịch và sử dụng trong vòng 2 ngày. ii. Xác định hoạt tính CMCase Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thủy giải CMC (sodium carboxymetyl-cellulose) bằng enzyme ở pH 5.0 và 40 o C. Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường khử, đường khử sẽ phản ứng với 3,5-dinitrosalicylic acid và được xác định bằng máy đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Cách thực hiện Phản ứng enzyme Hút 1 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt ở 40 o C trong 5 phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút. Thêm 1 ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều Để phản ứng xảy ra trong khoảng chính xác 40 o C trong 10 phút Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS, lắc đều thật kỹ để ngừng phản ứng enzyme. Để tránh bốc hơi, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nước sôi trong 15 phút. Đưa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi chứa nước lạnh Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Dùng nước cất làm đối chứng (A T ) Phản ứng thử không Hút 1 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt ở 40 o C trong 5 phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút. 40 Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS, lắc đều. Thêm 1 ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều Để tránh sự bốc hơi, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nước sôi trong 15 phút. Đưa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi chứa nước lạnh. Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Dùng nước cất làm đối chứng (A B ) Phản ứng của các dung dịch đường glucose chuẩn vào các ống nghiệm Hút lần lượt 1 ml các dung dịch đường glucose chuẩn vào các ống nghiệm Thêm vào 1 ml dung dịch cơ chất và lắc đều Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS. Lắc đều Dán nilon hay parafilm lên miệng ố nghiệm, đặt vào nồi nước sôi trong 15 phút. Đưa về nhiệt độ phòng bằng nồi nước lạnh Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Sử dụng nước cất làm đối chứng (A G ) Đối với nước cất: làm tương tự như trên. Thay dung dịch glucose chuẩn bằng nước cất. Đo OD 540 nm (A W ) Tính toán Tính hệ số glucose Hệ số glucose được tính bằng công thức (/ G GW Cmgml F AA = − ) Trong đó F: hệ số glucose C G : nồng độ của dung dịch glucose chuẩn (mg/ml) A G : độ hấp thụ OD của dung dịch glucose chuẩn A W : độ hấp thu OD của phản ứng với nước cất Xác định hoạt tính enzyme Sử dụng công thức sau: 1000 1 1 1 (/) ( ) . . . 180 10 1 TB CMCase u g A A F p hut ml C =− . bột ca cao từ phương pháp lên men có bổ sung vi sinh vật Ứng dụng những kết quả đã đạt được ở các thí nghiệm trên trong vi c lên men Mẫu ca cao lên men không bổ sung vi sinh vật được lấy từ. giống vi sinh vật, tỷ lệ chế phẩm, lượng chế phẩm sử dụng. Chúng tôi bố trí các mẫu mẫu lên men có độ ẩm thay đổi lần lượt: 50 %, 55 %, 60 %, 65 %. Thời gian lên men là 5 ngày. 3 .5. 1 .5 Nghiên cứu. giống vi sinh vật, tỷ lệ chế phẩm tối ưu, giữ độ ẩm chế phẩm ở 32 55 %. Độ ẩm khối lên men được giữ ở 55 % trong suốt quá trình lên men. Thay đổi lượng chế phẩm lên men như sau: 0 .5 %, 1