Ứng dụng kỹ thuật vi trung hòa trong xác định hiệu giá kháng thể igg trung hòa vi rút dengue 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc oOo Tp HCM, ngày 03 tháng 12 năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ CÔNG DUNG Giới tính : Nam / Nữ X Ngày, tháng, năm sinh : 06/03/1982 Nơi sinh : Tp Hồ Chí Minh Chun ngành : Cơng Nghệ Sinh Học Khố (Năm trúng tuyển) : 2006 1- TÊN ĐỀ TÀI: Ứng dụng kỹ thuật vi trung hòa xác định hiệu giá kháng thể IgG trung hòa vi-rút dengue-2 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: thực theo mục tiêu nghiên cứu: Xác định hiệu giá kháng thể IgG trung hòa vi rút dengue huyết bệnh nhân sốt dengue sốt xuất huyết dengue kỹ thuật vi trung hòa Nội dung nghiên cứu bao gồm: Nuôi cấy tế bào Vero Tạo nguồn chủng vi-rút dengue có hiệu giá xác định Xác định độ pha loãng kháng thể đơn dòng (IgG chuột) đặc hiệu với týp huyết vi-rút dengue Xác định độ pha loãng kháng thể IgG dê kháng IgG chuột gắn men HRPO Xác định độ pha loãng chủng vi-rút dengue Xác định độ lặp lại kỹ thuật vi trung hòa So sánh kỹ thuật vi trung hòa với kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 01/2008 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 11/2008 5- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS BS VŨ THỊ QUẾ HƯƠNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua Tháng 01 năm 2008 TRƯỞNG PHÒNG ĐT – SĐH TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Thực theo mục tiêu nghiên cứu: xác định hiệu giá kháng thể IgG trung hòa vi rút dengue huyết bệnh nhân sốt dengue sốt xuất huyết dengue kỹ thuật vi trung hòa Kỹ thuật vi trung hòa dựa phương pháp miễn dịch gắn men (ELISA) nghiên cứu ứng dụng cho loại vi-rút khác [11] [50] [81] [82] Theo kỹ thuật này, vi rút khơng bị trung hịa kháng thể xâm nhập vào tế bào đánh giá mật độ quang (OD) Kỹ thuật giúp cho việc đọc kết thuận lợi xử lý số liệu cách khách quan Nhằm tạo nguồn sinh phẩm cho thử nghiệm, tiến hành nuôi cấy tế bào Vero thu dòng tế bào cảm nhiễm tốt với vi-rút dengue-2 Trên dòng tế bào này, thực gây nhiễm để tạo nguồn chủng vi-rút dengue-2 sử dụng cho thử nghiệm kỹ thuật vi trung hòa kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử Sử dụng thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, sau ngày nuôi cấy, xác định chủng virút dengue-2, không bị tạp nhiễm tế bào bị gây nhiễm có khả bắt màu huỳnh quang đạt yêu cầu Từ tiến hành giữ chủng xác định hiệu giá Để xây dựng kỹ thuật vi trung hòa, chúng tơi tiến hành xác định độ pha lỗng hai loại kháng thể sử dụng kháng thể đơn dòng (IgG chuột) đặc hiệu với týp huyết vi-rút dengue-2 kháng thể IgG dê kháng chuột gắn men HRPO Với độ pha lỗng kháng thể vừa tìm được, xác định độ pha loãng vi-rút dựa vào yêu cầu cụ thể kỹ thuật vi trung hòa Sau có đủ thơng số kỹ thuật vi trung hòa, thực kỹ thuật mẫu huyết bệnh nhân qua nhiều lần theo quy trình đưa để xác định độ lặp lại Cuối cùng, sử dụng kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử mẫu huyết bệnh nhân để so sánh với kỹ thuật vi trung hòa Từ kết thu được, xác định hệ số tương quan hai kỹ thuật làm sở cho khằng định kỹ thuật vi trung hịa có khả thay kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử xác định hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút dengue MỤC LỤC Trang phụ bìa Nhiệm vụ luận văn thạc sĩ Lời cảm ơn Lời cam đoan Tóm tắt luận văn thạc sĩ Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị, sơ đồ MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi-rút dengue 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Lịch sử 1.1.3 Tương quan vi-rút dengue với vi rút khác 1.1.4 Phức thể vi-rút dengue 1.1.5 Thành phần cấu trúc vi-rút 1.1.6 Chu kỳ vi-rút 1.1.7 Đặc điểm hóa sinh lý vi rion 1.1.8 Chẩn đoán vi sinh vật 10 1.1.9 Chẩn đoán huyết 11 1.2 Kháng thể đáp ứng miễn dịch thể vi rút dengue 12 1.2.1 Kháng thể IgG 13 1.2.2 Kháng thể IgM 13 1.3 Kỹ thuật vi trung hòa 14 1.3.1 Các định nghĩa 14 1.3.2 Lịch sử 15 1.3.3 Các loại phản ứng trung hòa 17 1.3.4 Kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử 18 1.3.5 Kỹ thuật vi trung hòa 20 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu nghiên cứu 27 2.1.1 Dụng cụ trang thiết bị 27 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.3 Mơi trường, hóa chất, sinh phẩm 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Nuôi cấy tế bào Vero 30 2.2.2 Tạo nguồn vi rút 32 2.2.3 Phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút 34 2.2.4 Kỹ thuật vi trung hòa 37 2.2.5 Xác định độ pha loãng kháng thể đơn dòng IgG đặc hiệu DEN-2 từ chuột kháng thể kháng chuột gắn HRPO 40 2.2.6 Xác định độ pha loãng vi rút DEN-2 43 2.2.7 Xác định độ lặp lại kỹ thuật vi trung hòa 44 2.2.8 So sánh kỹ thuật vi trung hòa với kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử 46 2.2.9 Phương pháp xử lý phân tích số liệu 48 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 49 3.1 Nuôi cấy tế bào Vero 49 3.2 Tạo nguồn vi-rút 51 3.3 Chuẩn độ hiệu giá stock vi-rút 54 3.4 Xác định độ pha loãng CH1và CH2 dùng kỹ thuật vi trung hòa 56 3.5 Xác định độ pha loãng vi-rút 60 3.6 Xác định độ lặp lại kỹ thuật vi trung hòa 61 3.7 So sánh với kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử 65 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 4.1 Kết luận 70 4.2 Kiến nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ARN: Acid ribônuclêic ADN: Acid dezoxyribơnuclêic CDC: Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa dịch bệnh (Centers for Disease Control and Prevention) CMRL: Chemically Defined Basal Medium CPE: Hiệu đáp ứng tế bào (Cytopathogenic effect) DEN: Dengue EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA: Phản ứng hấp phụ miễn dịch gắn men (Enzyme-linked immunosorbent assay) FCS: Fetal Calf Serum H+L: Chuỗi nặng (heavy) + chuỗi nhẹ (light) HI: Thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu (HemagglutinationInhibition) HRPO: Horse raddish peroxidase IFA: Thử nghiệm kháng thể huỳnh quang gián tiếp (Indirect Flourescent Antibody Test) IgG: Kháng thể G (Immune globulin G) IgM: Kháng thể M (Immune globulin M) kDa: Kilo Dalton KTĐD: Kháng thể đơn dòng MAC-ELISA: Thử nghiệm ELISA tóm bắt kháng thể IgM (IgM antibody-capture ELISA) PRNT: Kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử (Plaque reduction neutralisation test) RT-PCR: Phản ứng dây chuyền polymerase-transcriptase ngược (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) SD: Sốt dengue SXHD: Sốt xuất huyết dengue TMB: 3,3’,5,5’ tetra methyl benzidine DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Bố trí độ pha lỗng vi rút bảng nhựa giếng 36 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm bảng nhựa giai đoạn vi rút tiếp xúc tế bào 42 Bảng 2.3 Vị trí cho CH1 CH2 khay nhựa liên tiếp 43 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm cho xác định độ pha loãng vi rút DEN-2 44 Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm bảng nhựa 96 giếng kỹ thuật vi trung hòa 46 Bảng 2.6 So sánh thông số kỹ thuật kỹ thuật PRNT vi TH 47 Bảng 2.7 Vị trí độ pha loãng huyết mẫu khay nhựa giếng 48 Bảng 2.8 Bảng nhựa giếng dùng cho chứng vi rút tế bào 48 Bảng 3.1 Kết chuẩn độ vi rút bảng nhựa giếng 54 Bảng 3.2 Kết xử lý thống kê thử nghiệm xác định độ pha loãng vi-rút 60 Bảng 3.3 Kết hiệu giá kháng thể mẫu huyết 64 Bảng 3.5 Hệ số tương quan kỹ thuật mẫu huyết 67 DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc vi rút dengue Hình 1.2 Cấu trúc thành phần protein vi rút DEN Hình 1.3 Chu trình sống Flavi vi-rút Hình 1.4 Thảm tế bào nhuộm màu cịn đám hoại tử khơng bắt màu, có hình trịn nhỏ 19 Hình 1.5 Tế bào bị gây nhiễm vi-rút Herpes-simplex 1, tạo CPE 20 Hình 1.6 Tế bào vero kính hiển vi soi ngược 22 Hình 2.1 Các chai tế bào 31 Hình 2.2 Nguyên lý kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp 33 Hình 2.3 Kỹ thuật IFA lam 12 giếng 33 Hình 3.1 Tế bào Vero sau ngày nuôi cấy 49 Hình 3.2 Tế bào Vero sau ngày nuôi cấy 49 Hình 3.3 Tế bào Vero bị vi rút dengue-2 xâm nhập tạo CPE 51 Hình 3.4 Kết nhuộm IFA ni tế bào Vero nhiễm vi rút DEN-2 dương tính với KTĐD NGC 3H5-1-21 52 Hình 3.5 IFA tế bào Vero sau 14 ngày cấy vi rút DEN-2 53 Hình 3.6 Hình ảnh chuẩn độ vi-rút theo đơn vị PFU/mL khay nhựa giếng 54 Hình 3.7 Hình ảnh khay nhựa 96 giếng bước đọc kết OD thí nghiệm xác định độ pha loãng CH1, CH2 56 Hình 3.8 Hình ảnh khay nhựa 96 giếng bước đọc kết OD thí nghiệm xác định độ lặp lại kỹ thuật vi trung hòa 61 Sơ đồ 1.1 Sự xuất kháng thể IgM IgG người nhiễm vi-rút dengue theo thời gian 12 Sơ đồ 1.2 Sơ đồ trình bày chế trung hịa vi-rút 15 Sơ đồ 2.1 Sơ đồ kỹ thuật vi trung hòa 38 Đồ thị 3.1 Đồ thị biểu diễn biến thiên OD chứng vi rút dựa độ pha loãng CH2 CH1 58 Đồ thị 3.2.Đồ thị biểu diễn biến thiên OD chứng tế bào dựa độ pha loãng CH2 (c), CH1 (d) 59 Đồ thị 3.3 Giá trị OD trung bình mẫu 1, đợt 62 Đồ thị 3.4 Sự biến thiên giá trị OD theo độ pha loãng huyết 66 Đồ thị 3.5 So sánh điểm pha loãng cuối đạt 50% trung hòa 66 Đồ thị 3.6 Mối tương quan hiệu giá kỹ thuật mẫu huyết 67 MỞ ĐẦU Vi-rút dengue thuộc họ Flaviviridae, nhóm có khoảng 70 loại vi-rút Trong đó, có số loại đáng ý sức khỏe cộng đồng (là vi-rút dengue, vi-rút sốt vàng, vi-rút viêm não St Louis, vi-rút Tây sông Nile vi-rút viêm não Nhật Bản) Hầu hết vi-rút nói vi-rút gây dịch bệnh cho người [12] Bên cạnh đó, phản ứng chéo kháng nguyên thuộc nhóm gây khó khăn cho việc chẩn đoán giám sát dịch vùng lúc lưu hành từ loại vi-rút thuộc nhóm flavivi-rút trở lên cụ thể vi-rút dengue vi-rút sốt vàng Châu Phi Nam Mỹ, vi-rút dengue vi-rút viêm não Nhật Bản Châu Á, vi-rút viêm não St Louis vi-rút Tây sông Nile Bắc Mỹ Mặc dù đáp ứng miễn dịch vi-rút đặc hiệu týp huyết virút, nhiên kỹ thuật chẩn đoán huyết học trường hợp cụ thể khơng phân biệt týp huyết vi-rút Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu [14] phương pháp miễn dịch gắn men (ELISA) phát kháng thể IgG [18] [53] có phản ứng chéo nhóm flavivi-rút việc chuẩn độ kháng thể dựa vào kháng nguyên tương ứng cho chứng dương cao Hơn nữa, kỹ thuật yêu cầu gắt gao thời điểm lấy mẫu từ bệnh nhân [29] Phương pháp ELISA thu bắt kháng thể IgM (MAC-ELISA) sử dụng nhiều chẩn đoán phịng thí nghiệm nhóm flavivi-rút cho phản ứng chéo týp huyết vi-rút dengue, giúp phân biệt virút dengue vi-rút viêm não Nhật Bản (CDC, tài liệu nội bộ) Kỹ thuật cố định bổ thể đặc hiệu týp huyết với nhóm vi-rút dengue lại dựa kháng thể không bền sử dụng Phản ứng trung hòa vi-rút biết đến nhiều qua kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT) Đây kỹ thuật đặc hiệu cho týp huyết vi-rút dengue, thường sử dụng đáng tin cậy Trong kỹ thuật PRNT, huyết bệnh nhân pha loãng, vi-rút chuẩn độ sử dụng mức hiệu giá cố định để có the Vero Cell Line", the Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee, pp 2-3 59 Rice, C M (1996), "Flaviviridae: the viruses and their replication", Fields Virology 3rd edition, vol Lippincott-Raven, Philadelphia, in B N Fields and D M Knipe A-17y and P M Howley (ed.), pp 931-959 60 Rojanasuphot, S (1986), "Plaque Reduction Neutralization Test for Dengue Virus by Semi-micro Methods in LLC-MK2 Cells", Virus Research Institute, pp 1-41 61 Rudnick, A and Lim, T W (eds) (1986), "Dengue fever studies in Malaysia", BulIetin from the Institute for MedicalResearch, Malaysia, No.23, pp 1-241 62 Russell P K., D Chiewslip, and W E Brandt (1970), "Immunoprecipitation analysis of soluble complement-fixing antigens of dengue viruses", Journal of Immunology, 105, pp 838-845 63 Russell, P K., Ananda Nisalak, Pairatana Sukhavachana and Stefano Vivona (1967), "A plaque reduction test for dengue virus neutralizing antibodies", the Journal of Immunology, Vol 99, No 2, pp 285-290 64 Russell, P K., Buescher E L., McCown J M., Ordonez J (1966), "Recovery of dengue viruses from patients during epidemics in Puerto Rico and East Pakistan", American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 15, pp 573–579 65 Russell, P K., Nisalak, A., Sukhavachana, P., and Vivona, S (1967) "A plaque reduction test for dengue virus neutralizing antibodies", Journal of Immunol, 99(2), pp 285-290 66 Russell, P K., W E Brandt, and J M Dalrymple (1980), "Chemical and antigenic structure of flaviviruses", in R W Schlesinger (ed.), The togaviruses, Academic Press, Inc., New York, pp 503-529 67 Sabin, A B (1950), "Symposium on viral and rickettsial Iiseases IV The dengue group of viruses and its family relationships", Bacteriol Rev., 14, pp 225-232 68 Sabin, A B (1959), "Dengue", In T Rivers and F Horsfall (ed.), Viral and rickettsial infections of man J B Lippincott Co., Philadelphia, pp 361373 69 Sabin, A.B (1952), "Research on dengue during World War II", American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1, pp 30-50 70 Sahu, S P., Douglas D Pedersen, Harold D Ridpath, Eileen N Ostlund, Beverly J Schimitt and David A Alstad (2002), "Serologic survey of cattle in the northeastern and north central United States, Virginia, Alaska, and Hawaii for antibodies to cache valley and antigenically related viruses (Bunyamwera serogroup virus)", American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 67(1), pp 119-122 71 Schlesinger, R W (1977), "Dengue viruses", Springer-Verlag, New York, pp 1-132 72 Shu, P Y., Li-Kuang Chen, Shu-Fen Chang, Chien-Ling Su, Li-Jung Chien, Chuan Chin (2004), "Dengue Virus Serotyping Based on Envelope and Membrane and Nonstructural Protein NS1 Serotype-Specific Capture Immunoglobulin M Enzyme-Linked Immunosorbent Assays", Journal of Clinical Microbiology, Vol 42, No 6, pp 2489–2494 73 Shu, P Y., Li-Kuang Chen, Shu-Fen Chang, Yi-Yun Yueh, Ling Chow, LiJung Chien, Chuan Chin, Hui-Hua Yang, Ting-Hsiang Lin and JyhHsiung Huang* (2002), "Potential Application of Nonstructural Protein NS1 Serotype-Specific Immunoglobulin G Enzyme-Linked Immunosorbent Assay in the Seroepidemiologic Study of Dengue Virus Infection: Correlation of Results with Those of the Plaque Reduction Neutralization Test", Journal of Clinical Microbiology, Vol 40, No 5, pp 1840–1844 74 Shu, P Y., Li-Kuang Chen, Shu-Fen Chang, Yi-Yun Yueh, Ling Chow, LiJung Chien, Chuan Chin, Ting-Hsiang Lin and Jyh-Hsiung Huang (2003), "Comparison of Capture Immunoglobulin M (IgM) and IgGEnzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and Nonstructural Protein NS1 Serotype-Specific IgG ELISA for Differentiation of Primary and Secondary Dengue Virus Infections", Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Vol 10, No 4, pp 622–630 75 Siler, J F., M W Hall, and A P Hitchens (1926), "Dengue: Its history, epidemiology, mechanism of transmission, etiology, clinical manifestations, immunity and prevention", Philipp Journal of Science 29, pp 1-304 76 Smithburn, K C., (1954), "Antigenic relationships among certain arthropodborne viruses as revealed by neutralization test", Journal of Immunol, 72, pp 376-388 77 Sukhavachana, P., Yuill TM, Russell PK (1969), "Assay of arbovirus neutralizing antibody by micro methods", Transactions Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 63, pp 446–455 78 Talarmin, A., Labeau B., Lelarge J., and Sarthou j L (1998), "Immunoglobulin A-specific capture enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of dengue fever", Journal of Clinical Microbiology, Vol 36, No 5, pp 1189-1192 79 Tan, B H., Fu, J Sugrue, R J., Yap, E H., Chan, Y C., Tan, Y H (1996), "Recombinant degue type virus NS5 protein expressed in Escherichia coli exhibits RNA-dependent RNA polymerase activity", Virology, 216, pp 317-325 80 Tikunova, N.V., V.V Morozova, T.A Batanova, E.F Belanov, N.I Bormotov and A.A Ilyichev (2001), "Phage antibodies from combinatorial library neutralize vaccinia virus", Human Antibodies, 10, pp 95–99 81 Ting, S H L , E'ein See, Hwee Cheng Tan, May Ann Lee, Eng Eong Ooi (2001), "Development of a simplified assay for the detection of neutralizing antibodies to Japanese encephalitis virus", Journal of Virological Methods, 93, pp 43-47 82 Vordam, V and Manuela Beltran (2002), "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Format Microneutralization Test for Dengue Viruses", American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 66(2), , pp 208-212 83 Warrener, P., Tamura, J K., Collett, M S (1993), "RNA-stimulated NTPase activity associated with yellow fever virus NS3 protein expressed in bacteria", Journal of Virology, 67, pp 989-996 84 Wengler, G., Czaya, G., Faber, P M., Hegermann, J H (1991), "Invitro synthesis of West Nile virus protein indicates that the amino terminal segment of the NS3 protein contains the active centre of the protease which cleaves the viral polyprotein after multiple basic amino acids", Journal of General Virology, 72, pp 851-858 85 World Health Organization (1999), "Prevention and control of dengue and dengue haemorrhagic fever", W.H.O Regional Publication, Searo, No 29, pp 1-134 86 Wurm, R., G Dobler, M Peters and S T Kiessig (2000), "Serological Investigations of Red Foxes (Vulpes vulpes L.) for Determination of the Spread of Tick-borne Encephalitis in Northrhine-Westphalia", Journal of Veterinary Medicine, B, 47, pp 503–509 TIẾNG PHÁP 87 Marianneau, P (1997), "La dengue", Virologie, 2, pp 199-204 TÀI LIỆU ĐIỆN TỬ 88 Dengue CD-ROM, Topics in International Health series, A collaboration between The Wellcome Trust and TDR, ww.wellcome.ac.uk/tih PHỤ LỤC 1: Thành phần môi trường, dung dịch Môi trường CMRL 1066 _ Gibco Thành phần có CMRL 1066 Trọng lượng phân tử Nồng độ (mg/L) mM Axít amin Glycine 75 50 0.666667 131 10 0.076336 89 25 0.280899 L-Arginine hydrochloride 211 70 0.331754 L-Aspartic acid 133 30 0.225564 L-Cysteine hydrochloride-H2O 176 260 1.477273 L-Cystine 240 26 0.108333 L-Glutamic Acid 147 75 0.510204 L-Histidine hydrochloride-H2O 210 20 0.095238 L-Isoleucine 131 20 0.152672 L-Leucine 131 60 0.458015 L-Lysine hydrochloride 183 70 0.382514 L-Methionine 149 15 0.100671 L-Phenylalanine 165 25 0.151515 L-Proline 115 40 0.347826 L-Serine 105 25 0.238095 L-Threonine 119 30 0.252101 L-Tryptophan 204 10 0.04902 L-Tyrosine disodium salt dihydrate 225 58 0.257778 L-Valine 117 25 0.213675 Ascorbic Acid 176 50 0.284091 Biotin 244 0.01 0.000041 Cholesterol 387 0.2 0.000517 Choline chloride 140 0.5 0.003571 D-Calcium pantothenate 477 0.01 0.000021 Folic Acid 441 0.01 0.000023 Hydroxy L-proline L-Alanine Vitamin Niacinamide 122 0.025 0.000205 Nicotinic acid (Niacin) 123 0.025 0.000203 Para-Aminobenzoic Acid 137 0.05 0.000365 Pyridoxal hydrochloride 204 0.025 0.000123 Pyridoxine hydrochloride 206 0.025 0.000121 Riboflavin 376 0.01 0.000027 Thiamine hydrochloride 337 0.01 0.00003 i-Inositol 180 0.05 0.000278 Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 111 200 1.801802 Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) 120 97.7 0.814167 Potassium Chloride (KCl) 75 400 5.333334 Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 84 2200 26.190475 Sodium Chloride (NaCl) 58 6800 117.24138 Muối khoáng Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4H2O) 138 140 1.014493 2'Deoxyadenosine 251 10 0.039841 2'Deoxycytidine 227 10 0.044053 2'Deoxyguanosine 267 10 0.037453 5-Methyl-deoxycytidine 225 0.1 0.000444 Co-carboxylase 461 0.002169 Coenzyme A 768 2.5 0.003255 D-Glucose (Dextrose) 180 1000 5.555555 Diphosphopyridine nucleotide (NAD) 663 0.010558 FAD (flavin adenine dinucleotide) 786 0.001272 Glutathione (reduced) 307 10 0.032573 376.4 20 0.053135 Sodium acetate-3H2O 136 83 0.610294 Sodium glucuronate-H2O 236 4.2 0.017797 Thymidine 242 10 0.041322 Triphosphopyridine Nucleotide (NADP) 743 0.001346 ∞ 0.002066 Các thành phần khác Phenol Red Tween 80® Uridine 5'- triphosphate 484 (nguồn Gibco, 2008) Bảo quản 4°C Mơi trường phủ có CMC MEM 2X 50mL FCS 5mL L-Glutamin 1mL Kháng sinh_Kháng nấm 1mL NaHCO3 1mL CMC 3% (trong nước cất) vừa đủ 100mL Bảo quản 4°C DPBS (Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline) KCl 200mg KH2PO4 200mg NaCl 8000mg Na2HPO4.7H2O 2160mg Nước cất vô trùng vừa đủ 1000mL Hấp vô trùng 121°C/1atm, bảo quản 4°C PBS (Phosphate-Buffered Saline) NaCl 870mg Na2PO4 108,9mg KH2PO4 31,5mg NaOH 4,2mL (cho đạt pH=7,2) Nước cất vô trùng vừa đủ 1000mL Hấp vô trùng 121°C/1atm, bảo quản 4°C Dung dịch sữa loại béo 5% (dùng pha loãng CH1, CH2) Sữa loại béo 5000mg Triton X-100 0,5mL Tween 20 0,05mL PBS vừa đủ 100mL Bảo quản 4°C Thuốc nhuộm xanh đen Napthone Napthone blue black 1000mg Sodium acetate 13600mg Glacial acetic acid 60mL Nước cất vô trùng vừa đủ 1000mL Bảo quản nhiệt độ phòng PHỤ LỤC 2: Độ pha loãng Cộng Hợp Độ pha loãng Cộng Hợp 1/3000 1/2500 1/4000 1/5000 1/3000 1/5000 1/4000 1/5000 1/3000 1/10000 1/4000 1/5000 1/3000 1/20000 1/4000 1/5000 1/3000 1/30000 1/4000 1/5000 Kết đo OD xác định độ pha loãng Cộng Hợp 1, Cộng Hợp Độ pha loãng vi-rút Chứng vi-rút 2,606 2,709 2,528 2,699 2,529 2,304 2,648 2,508 2,117 2,203 2,140 1,948 1,811 1,430 1,689 1,512 1,858 1,508 1,438 1,555 1,515 1,362 1,372 1,332 0,566 0,562 0,552 0,551 0,356 0,454 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/25600 1/51200 1/102400 1/204800 1/409600 Chứng tế bào 2,748 2,613 2,465 2,643 2,377 2,514 2,423 2,370 2,351 2,027 2,028 1,576 1,923 1,953 1,719 1,767 1,752 1,550 1,102 1,119 1,380 1,134 1,105 1,234 0,526 0,555 0,453 0,407 0,247 0,454 2,498 2,511 2,394 2,558 2,268 2,532 2,438 2,325 2,376 1,912 1,996 1,650 1,920 1,883 1,695 1,616 1,412 1,452 0,844 0,721 0,975 1,083 0,901 0,795 0,494 0,376 0,381 0,354 0,254 0,378 2,464 2,525 2,278 2,585 2,165 2,608 2,457 2,218 2,245 2,097 1,608 1,560 1,850 1,348 1,508 1,589 0,854 0,792 0,600 0,629 0,537 0,643 0,459 0,473 0,388 0,363 0,363 0,295 0,258 0,273 2,400 2,592 2,364 2,623 2,024 2,550 2,187 2,144 2,200 1,848 1,676 1,559 1,493 1,628 1,554 1,552 0,424 0,562 0,166 0,316 0,334 0,241 0,113 0,203 0,283 0,285 0,377 0,219 0,108 0,155 2,632 2,288 2,036 2,121 2,036 2,295 2,235 2,035 1,930 1,413 1,031 1,490 1,570 1,533 1,425 1,378 0,304 0,362 0,263 0,399 0,224 0,417 0,064 0,129 0,220 0,223 0,349 0,177 0,084 0,125 1,529 2,020 1,402 1,760 1,925 1,890 1,786 1,840 2,004 1,037 1,127 1,460 0,718 0,910 0,926 1,343 0,282 0,274 0,292 0,182 0,104 0,060 0,065 0,094 0,157 0,216 0,106 0,092 0,069 0,075 1,144 1,968 1,155 1,663 1,012 1,126 1,860 1,578 1,447 1,244 0,848 0,604 0,534 0,600 0,980 0,977 0,158 0,150 0,146 0,225 0,100 0,068 0,029 0,082 0,140 0,103 0,098 0,065 0,066 0,094 0,955 1,196 1,257 1,383 0,944 0,537 1,106 1,465 1,358 0,578 0,782 0,552 0,216 0,216 0,197 0,276 0,170 0,180 0,060 0,060 0,063 0,059 0,026 0,058 0,068 0,083 0,084 0,082 0,068 0,068 0,823 0,929 0,484 0,779 0,609 0,223 1,036 1,313 1,203 0,477 0,138 0,149 0,194 0,187 0,158 0,216 0,162 0,164 0,028 0,046 0,069 0,069 0,026 0,059 0,068 0,072 0,068 0,064 0,068 0,071 0,492 0,709 0,286 0,215 0,254 0,196 0,184 0,315 0,295 0,154 0,133 0,151 0,182 0,160 0,092 0,108 0,162 0,150 0,004 0,064 0,072 0,064 0,029 0,051 0,081 0,069 0,067 0,064 0,068 0,066 0,214 0,215 0,177 0,214 0,183 0,180 0,173 0,153 0,134 0,094 0,148 0,134 0,112 0,108 0,084 0,085 0,079 0,066 0,066 0,069 0,067 0,064 0,058 0,068 0,055 0,062 0,059 0,035 0,035 0,061 PHỤ LỤC Bảng 1: Kết OD trung bình giếng độ pha loãng Cộng Hợp 1/3000 Độ pha loãng Cộng Hợp Độ pha loãng vi-rút Chứng vi-rút 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/25600 1/51200 1/102400 1/204800 1/409600 Chứng tế bào Cut off 1/2500 2,658 2,681 2,505 2,495 2,496 2,460 1,775 1,556 1,076 0,876 0,601 0,215 0,429 1/5000 2,578 2,397 2,382 2,338 2,166 2,135 1,813 1,719 1,286 1,174 0,250 0,163 0,325 1/10000 1,621 1,938 1,901 1,599 1,560 1,551 0,814 0,567 0,216 0,191 0,171 0,110 0,220 1/20000 1,497 1,111 0,783 0,615 0,241 0,331 0,237 0,186 0,060 0,037 0,034 0,068 0,135 1/30000 0,564 0,541 0,435 0,376 0,284 0,222 0,187 0,122 0,076 0,070 0,075 0,059 0,117 Bảng 2: Kết OD trung bình giếng độ pha lỗng Cộng Hợp 1/4000 Độ pha loãng Cộng Hợp Độ pha loãng vi-rút Chứng vi-rút 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/25600 1/51200 1/102400 1/204800 1/409600 Chứng tế bào Cut off 1/2500 2,614 2,554 2,476 2,432 2,494 2,079 1,581 1,409 1,320 0,632 0,251 0,196 0,391 1/5000 2,160 2,189 2,144 2,171 2,024 1,672 1,521 1,346 0,968 0,840 0,225 0,114 0,228 1/10000 1,601 1,743 1,656 1,549 1,553 1,402 1,135 0,979 0,237 0,187 0,100 0,085 0,169 1/20000 1,439 1,257 1,029 0,590 0,288 0,321 0,082 0,084 0,061 0,069 0,068 0,066 0,131 1/30000 0,552 0,430 0,368 0,329 0,298 0,263 0,099 0,082 0,083 0,066 0,066 0,047 0,094 Bảng 3: Kết OD trung bình giếng độ pha loãng Cộng Hợp 1/5000 Độ pha loãng Cộng Hợp Độ pha loãng vi-rút Chứng vi-rút 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/25600 1/51200 1/102400 1/204800 1/409600 Chứng tế bào Cut off 1/2500 2,417 2,446 2,400 2,387 2,287 2,166 1,908 1,069 0,741 0,416 0,225 0,182 0,363 1/5000 2,044 1,802 1,823 1,584 1,618 1,261 1,294 0,726 0,667 0,144 0,142 0,141 0,282 1/10000 1,683 1,651 1,432 0,823 0,493 0,333 0,278 0,154 0,175 0,163 0,156 0,073 0,145 1/20000 1,352 1,170 0,848 0,466 0,158 0,097 0,080 0,056 0,042 0,043 0,040 0,063 0,126 30000 0,405 0,351 0,316 0,266 0,132 0,105 0,072 0,080 0,068 0,070 0,067 0,048 0,096 PHỤ LỤC Kết đo OD thử nghiệm xác định độ pha loãng vi-rút Độ pha loãng vi-rút Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần OD trung bình OD trung vị CV (%) 1/50 1,766 1,776 1,937 1,882 1,962 1,394 1,401 1,339 1/100 2,038 1,848 1,578 1,684 1,780 1,307 1,231 1,630 1/200 1,686 1,681 1,569 1,469 1,559 1,241 1,154 1,229 1/400 1,371 1,675 1,484 1,538 1,440 1,082 0,964 1,216 1/800 1,239 1,395 1,560 1,448 1,636 0,835 0,908 0,334 1/1600 1,496 1,154 1,157 1,576 1,383 0,657 0,723 0,208 1/3200 1,190 1,014 0,616 0,886 0,332 0,316 0,346 0,269 1/6400 1/12800 1/25600 0,407 0,289 0,216 0,144 0,072 0,640 0,479 0,074 0,060 0,516 0,171 0,061 0,032 0,037 0,042 0,187 0,042 0,040 0,183 0,049 0,450 0,075 0,052 0,061 1/51200 0,067 0,080 0,079 0,070 0,040 0,044 0,044 0,038 1,682 1,637 1,449 1,346 1,169 1,044 0,621 0,253 0,098 0,196 0,058 1,771 1,657 1,514 1,406 1,317 1,156 0,481 0,185 0,062 0,061 0,056 15,549 16,412 14,658 17,892 37,993 45,479 58,510 74,076 89,755 116,364 31,152 PHỤ LỤC STT CV Đợt 1 Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Bảng 1: Giá trị OD hiệu giá kháng thể có huyết bệnh nhân theo kỹ thuật vi trung hòa 1/10 1/20 1/40 1/80 0,132 0,148 0,135 0,176 0,105 0,074 0,120 0,110 0,121 0,137 0,098 0,123 0,095 0,093 0,109 0,108 0,116 0,119 0,096 0,101 0,117 0,136 0,105 0,087 0,332 0,185 0,280 0,211 0,337 0,212 0,317 0,215 0,198 0,245 0,100 0,196 0,112 0,135 0,230 0,202 0,143 0,089 0,078 0,080 0,093 0,089 0,086 0,103 0,085 0,088 0,089 0,109 0,092 0,080 0,724 0,571 0,509 0,889 0,679 0,999 0,781 0,542 0,714 0,694 0,509 0,656 0,252 0,642 1,123 0,521 0,246 0,884 0,077 0,069 0,083 0,081 0,082 0,100 0,076 0,088 0,088 0,100 0,091 0,086 1,298 0,757 0,838 1,640 0,923 1,370 1,212 0,934 0,882 1,379 0,881 0,973 0,898 1,172 1,197 1,250 1,060 0,881 0,073 0,070 0,083 0,080 0,080 0,092 0,081 0,111 0,105 0,097 0,099 0,113 1,237 1,240 1,165 1,313 1,358 1,515 Độ pha loãng huyết bệnh nhân 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1,292 0,983 1,172 1,655 1,525 1,234 1,314 1,573 2,035 1,744 1,575 1,257 0,074 0,070 0,079 0,083 0,100 0,091 0,218 0,133 0,208 0,119 0,095 0,170 1,500 1,258 1,161 1,849 1,526 1,475 1,442 1,212 1,464 1,440 1,211 1,404 1,409 1,743 2,024 2,211 1,595 1,598 0,071 0,072 0,084 0,081 0,079 0,088 0,650 0,334 0,337 0,474 0,171 0,510 1,773 1,435 1,294 1,693 1,587 1,478 1,522 1,167 1,588 1,810 1,442 1,379 1,397 1,743 1,964 1,857 1,427 1,602 0,102 0,088 0,084 0,080 0,088 0,089 0,968 0,935 1,296 0,758 0,716 0,963 1,566 1,221 1,330 1,766 1,607 1,390 1,620 1,200 1,499 1,861 1,438 1,446 1,433 1,863 1,684 1,949 1,705 1,353 0,170 0,145 0,104 0,096 0,080 0,089 1,257 1,205 1,332 1,127 0,994 1,011 1,649 1,280 1,469 1,802 1,781 1,487 1,636 1,290 1,410 1,683 1,314 1,423 1,397 1,717 1,994 1,807 1,431 1,527 0,716 0,736 0,679 0,752 0,170 0,409 1,390 1,388 1,628 1,012 1,000 1,265 1,515 1,192 1,591 1,740 1,552 1,645 1/5120 1/10240 1,548 1,324 1,328 1,802 1,526 1,781 1,544 1,505 1,958 1,828 1,710 1,507 1,432 1,263 1,744 1,389 1,215 0,888 1,716 1,839 1,645 1,496 1,263 1,537 1,737 1,380 1,428 1,807 1,701 1,477 1,631 1,334 1,398 1,722 1,260 1,272 1,167 1,743 1,671 1,819 1,348 1,463 1,452 1,522 1,757 1,831 1,146 0,950 1,696 1,704 1,560 1,383 1,277 1,469 1,703 1,203 1,374 1,525 1,519 1,621 Chứng vi-rút Chứng tế bào 1,147 0,107 1,247 0,112 1,070 0,096 1,275 0,101 1,247 0,112 1,070 0,096 1,275 0,101 1,247 0,112 1,070 0,096 1,275 0,101 1,247 0,112 1,169 0,089 1,275 0,101 1,082 0,103 1,169 0,089 Bảng 2: Giá trị OD hiệu giá kháng thể có huyết bệnh nhân theo kỹ thuật vi trung hòa (tt) STT CV Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt 1/10 1/20 1/40 Độ pha loãng huyết bệnh nhân 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 0,115 0,104 0,096 0,095 0,088 0,088 0,178 0,160 0,119 0,113 0,180 0,150 0,111 0,110 0,097 0,089 0,116 0,115 1,656 1,824 1,516 1,376 1,69 1,9 0,127 0,077 0,096 0,113 0,071 0,100 0,326 0,288 0,153 0,140 0,438 0,394 0,506 0,499 0,126 0,100 0,227 0,134 1,835 1,828 2,15 2,328 1,828 2,001 0,175 0,167 0,163 0,143 0,161 0,121 0,508 0,940 0,530 0,348 0,619 0,683 0,826 0,897 0,147 0,249 0,820 0,520 1,862 2,057 2,2 2,096 1,88 1,754 0,346 0,683 0,716 0,431 0,636 0,536 0,821 1,395 0,986 0,901 1,188 0,950 1,617 1,463 1,524 1,108 1,478 1,539 1,547 1,846 2,197 2,085 1,889 1,809 0,671 1,114 1,160 1,098 0,792 0,970 0,827 1,268 1,437 1,545 1,162 1,299 1,882 1,911 1,726 1,947 1,989 1,877 1,21 1,874 2,109 2,167 1,78 1,846 0,731 1,238 1,367 1,433 1,191 1,061 1,066 1,420 1,689 1,520 1,425 1,284 1,976 1,869 2,022 2,036 1,972 1,984 1,582 1,763 2,204 2,11 1,599 1,706 1,213 1,399 1,656 1,493 1,542 1,592 1,029 1,432 1,803 1,724 1,468 1,335 2,057 1,826 1,968 1,939 1,949 1,703 1,396 1,903 2,001 2,054 1,468 1,556 0,968 1,640 1,547 1,601 1,331 1,313 0,965 1,472 1,891 1,752 1,501 1,500 1,980 1,630 1,802 1,823 1,913 1,682 1,408 1,578 2,113 2,051 1,716 1,513 1,239 1,627 1,691 1,649 1,691 1,583 1,032 1,583 1,515 1,802 1,448 1,640 1,883 1,994 1,962 1,920 1,578 1,937 1,408 1,593 2,033 1,957 1,554 1,532 1/5120 1/10240 1,021 1,533 1,823 1,787 1,537 1,562 1,100 1,577 1,784 1,802 1,612 1,592 2,007 1,914 1,991 2,056 1,786 2,008 1,432 1,299 1,996 1,965 1,601 1,51 1,137 1,546 1,635 1,834 1,740 1,564 1,058 1,572 1,623 1,827 1,453 1,556 2,063 1,782 1,766 1,931 1,730 1,933 1,125 1,422 1,964 1,898 1,55 1,664 Chứng vi-rút Chứng tế bào 1,111 0,092 1,082 0,103 1,169 0,089 1,002 0,098 1,010 0,094 1,164 0,087 1,287 0,110 1,303 0,090 1,484 0,101 1,1255 0,0953 1,152 0,0965 1,0478 0,0833 PHỤ LỤC STT CV Đợt A Đợt Đợt Đợt B Đợt Đợt Đợt C Đợt Đợt Trung bình Kết vi trung hịa mẫu huyết A, B, C 1/10 1/20 1/40 Độ pha loãng huyết bệnh nhân 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 0,103 0,100 0,100 0,098 0,094 0,094 0,105 0,095 0,104 0,127 0,105 0,099 0,114 0,117 0,114 0,109 0,094 0,099 0,107 0,078 0,107 0,081 0,078 0,054 0,076 0,078 0,093 0,122 0,094 0,081 0,086 0,101 0,096 0,088 0,081 0,079 0,095 0,085 0,101 0,077 0,081 0,087 0,123 0,185 0,137 0,127 0,139 0,119 0,094 0,093 0,096 0,079 0,088 0,076 0,262 0,408 0,358 0,254 0,223 0,238 0,244 0,335 0,339 0,338 0,156 0,425 0,074 0,109 0,101 0,102 0,112 0,076 0,956 0,816 0,996 0,961 0,626 0,414 0,777 0,691 0,863 0,560 0,925 0,644 0,098 0,212 0,100 0,098 0,287 0,228 1,196 1,279 1,348 1,177 0,778 0,638 1,109 1,236 1,232 1,018 0,700 1,120 0,289 0,513 0,158 0,114 0,586 0,481 1,574 1,451 1,468 1,717 1,225 0,877 1,512 1,312 1,304 1,042 1,148 1,338 1,027 0,774 0,245 0,392 0,961 1,077 1,344 1,762 1,370 1,480 1,471 1,075 1,701 1,469 1,724 1,057 1,125 1,276 1,241 1,235 0,522 1,086 1,469 1,245 1,601 1,554 1,756 1,623 1,408 1,172 1,710 1,406 1,491 1,419 1,138 1,473 1,499 1,526 0,921 1,268 1,618 1,274 1/5120 1/10240 1,901 1,559 1,738 1,786 1,594 1,003 1,642 1,370 1,453 1,150 1,358 1,370 1,712 1,348 1,256 1,657 1,455 1,584 1,626 1,544 1,551 1,472 1,226 1,144 1,525 1,494 1,467 1,139 1,319 1,719 1,400 1,218 1,051 1,693 1,655 1,503 Điểm cuối trung hòa 50% Chứng vi-rút Chứng tế bào 1,111 0,092 0,601 160 119 1,082 0,103 0,592 160 114 1,169 0,089 0,629 320 253 1,111 0,092 0,601 160 136 1,082 0,103 0,592 160 134 1,164 0,087 0,625 160 134 1,111 0,092 0,601 640 448 1,010 0,094 0,552 1280 918 1,164 0,087 0,625 640 380 0,602 Hiệu giá Trung bình hiệu giá 162,000 134,667 582,000 PHỤ LỤC Bảng 1: Giá trị OD trung bình mẫu huyết theo độ pha loãng kỹ thuật vi trung hịa Độ pha lỗng huyết Mẫu huyết 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240 A B C 0,098 0,106 0,108 0,084 0,091 0,089 0,088 0,138 0,088 0,291 0,306 0,096 0,795 0,743 0,171 1,069 1,069 0,357 1,385 1,276 0,746 1,417 1,392 1,133 1,519 1,440 1,351 1,597 1,391 1,502 1,427 1,444 1,420 Trung vị điểm pha lỗng cuối đạt 50% trung hịa Trung hòa Vi trung giảm đám hòa hoại tử 160,000 160,000 160,000 160,000 640,000 640,000 Bảng 2: Kết trung hòa giảm đám hoại tử mẫu huyết A, B, C STT A B C CV Lần Lần Lần Lần Lần Lần Độ pha loãng huyết 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 4 2 10 5 14 12 9 12 11 10 11 10 16 17 16 16 12 11 23 22 27 29 15 14 K K K K 15 16 K K K K 21 20 K K K K 26 29 K: không thực thí nghiệm Chứng vi-rút 30,5 Chứng tế bào Điểm cuối trung hòa 50% Hiệu giá 160 160 160 160 1280 640 145 137 151 150 667 520 Trung bình hiệu giá 140,833 150,714 593,333 ... thực đề tài: ? ?Ứng dụng kỹ thuật vi trung hòa chẩn đốn xác định hiệu giá kháng thể IgG trung hịa vi- rút dengue? ?? Mục tiêu luận văn nhằm xác định hiệu giá kháng thể IgG trung hòa vi rút dengue huyết... kỹ thuật vi trung hòa: Kỹ thuật vi trung hòa dùng để định lượng kháng thể trung hòa vi- rút dengue Kỹ thuật sử dụng khay 96 giếng cho vi? ??c pha loãng huyết thanh, trung hòa virút kháng thể để vi- rút. .. độ hiệu giá vi rút 34 2. 2.4 Kỹ thuật vi trung hòa 37 2. 2.5 Xác định độ pha loãng kháng thể đơn dòng IgG đặc hiệu DEN -2 từ chuột kháng thể kháng chuột gắn HRPO 40 2. 2.6 Xác