Lựa chọn thuộc tính trong khai phá dữ liệu

Lựa chọn thuộc tính trong khai phá dữ liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -

HOÀNG PHÚ HIỆP

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA

CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI

TRONG VI KHUẨN Echerichia coli

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -

HOÀNG PHÚ HIỆP

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA

CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI

TRONG VI KHUẨN Echerichia coli

Chuyên ngành : Di truyền học

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS LÊ THỊ THU HIỀN

1.2 Chất hoạt hóa plasminogen 5

1.3 Chất hoạt hóa plasminogen mô người 9

1.4 Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm tan máu đông 12

1.5 Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô người 14

1.6 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 18

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 19

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 19

2.1.1 Vật liệu 19

2.1.2 Hóa chất 20

2.1.3 Thiết bị 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Điện di DNA trên gel agarose 20

2.2.2 Điện di protein trên gel polyacrylamide 21

2.2.3 Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) 22

2.2.6.2 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli 24

2.2.7 Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid 25

2.2.8 Xác định trình tự gen 26

2.2.9 Biểu hiện protein trong vi khuẩn E coli 27

Chương 3: Kết quả và thảo luận 28

3.1 Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA 28

3.1.1 Nhân đoạn cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR 28

3.1.2 Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+) 30

3.1.2.1 Xử lý sản phẩm PCR cDNA mã hóa h-tPA bằng enzyme hạn chế 30

3.1.2.2 Xử lý vector pGEX6p1 và pET21a(+) bằng enzyme hạn chế 31

3.1.2.3 Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+) 32

3.1.3 Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hóa h-tPA 32

3.1.3.1 Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E coli bằng phương pháp sốc nhiệt 32

3.1.3.2 Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA 33

3.1.4 Xác định và phân tích trình tự cDNA mã hóa h-tPA 37

3.2 Biểu hiện gen 43

3.2.1 Tổng hợp protein h-tPA tái tổ hợp 43

3.2.2 Kiểm tra protein bằng phương pháp điện di trên SDS-PAGE 43

Kết luận và đề nghị 47

Tài liệu tham khảo 48

Phụ lục 54

BẢNG VIẾT TẮT

Bp Cặp bazơ (Base pair) LB Luria – Bertani

CIAP Calf Intestinal Alkaline Phosphatase P Vùng serine protease (Serine protease) ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate PA Chất hoạt hóa plasmingen (Plasminogen activator) DNA Deoxyribonucleic acid PAI

Chất ức chế chất hoạt hóa plasminogen (Plasminogen activator inhibitor)

RNase Ribonuclease

EtBr Ethidium bromide scuPA

Chất hoạt hóa urokinase sợi đơn (single chain urokinase - type plasminogen activator)

F Vùng “ngón tay” (Finger) SDS Sodium Dodecyl Sulphate

GST Glutathione S-transferase SK Streptokiase

h- tPA

Chất hoạt hóa plasminogen mô người (Human tissue plasminogen activator)

TAE Tris-acetate- EDTA

IPTG Isopropyl b-D thiogalactoside tPA

Chất hoạt hóa plasminogen mô (Tissue - type plasminogen activator)

Chất hoạt hóa urokinase (Urokinase - type plasminogen activator)

K2 Vùng Kringle 2 v/p Vòng/ phút

1.4 Quá trình phân hủy huyết khối 13

1.5 Con đường phân giải tơ máu (Fibrin) 13

2.1 Bản đồ vector pET21a(+) và pGEX6p1 19

3.1 Sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa h-tPA 30

So sánh trình tự nucleotide của h-tPA trong

pGEX6p1/h-tPA và pET21a(+)/h-pGEX6p1/h-tPA với NM_000930 42

3.8 Kiểm tra kiểm tra protein h-tPA trong pGEX6p1/h-tPA p344

3.9 Kiểm tra protein h-tPA trong pET21a(+)/h-tPA p145

Formatted: Font: BoldFormatted: Font: BoldFormatted: Font: BoldFormatted: Font: BoldFormatted: Font: BoldFormatted: Font: BoldFormatted: Font: Bold

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 ptFormatted: Font: Bold

Formatted: Font: Bold

Formatted: Font: Bold

Formatted: Font: Bold

MỞ ĐẦU 1 Lý do chọn đề tài

Bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970, các thành tựu về sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử của các bệnh xuất hiện trên động vật, thực vật và đặc biệt là trên người Giáo sư Paul Berg thuộc trường đại học Stanford (Hoa Kỳ), người được nhận giải Nobel hóa học năm 1980, là người đầu tiên tạo ra DNA tái tổ hợp (recombinant DNA- rDNA) vào năm 1972 Kể từ đó đến nay, công nghệ rDNA và những ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của các công ty công nghệ sinh học và các dược phẩm tạo ra nhờ công nghệ rDNA (dược phẩm sinh học) nhằm phục vụ và bảo vệ sức khỏe con người [44] Trong lĩnh vực nghiên cứu tạo các loại dược phẩm làm tan các cục máu đông để điều trị huyết khối và các rối loạn huyết khối tắc mạch, cuối những năm 1980, thông qua công nghệ rDNA, các nhà khoa học đã nghiên cứu và tạo ra một số loại dược phẩm sinh học là các protein tái tổ hợp có khả năng làm tan các cục máu đông “đặc hiệu” Một trong những protein đó, chất hoạt hóa plasminogen mô của người (human tissue plasminogen activator- h-tPA) đã được nhiều nhóm tác giả trên thế giới nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y dược DNA bổ sung (complementary DNA- cDNA) của gen mã hóa h-tPA đã được phân lập, tạo dòng, biểu hiện ở nhiều loại tế bào như tế bào trứng chuột đồng (Chinese hamster ovary- CHO), tế bào thận chuột chưa trưởng thành và sản xuất dưới dạng dược phẩm tái tổ hợp [39]

Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dược phẩm bằng công nghệ sinh học đang bắt đầu được tiếp cận Việc nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa

plasminogen mô trong vi khuẩn Escherichia coli tiến tới sản xuất dược phẩm sinh

học phục vụ bảo vệ sức khỏe con người có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao Xuất

phát từ các lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của người trong vi khuẩn Escherichia coli”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ rDNA để thiết kế vector

và biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E coli nhằm tiến tới sản xuất protein

h-tPA tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y dược

3 Nội dung nghiên cứu

- Tạo dòng gen mã hóa h-tPA trong các vector biểu hiện thích hợp

- Biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E coli

4 Những điểm mới của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu nhằm tiến tới ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô của người - một dược phẩm công nghệ sinh học có giá trị hoàn toàn chưa được nghiên cứu và sản xuất ở nước ta

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh tim mạch

Bệnh tim mạch là các bệnh liên quan đến những rối loạn ảnh hưởng tới tim và các mạch máu bao gồm bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não, bệnh mạch máu ngoại biên và tăng huyết áp Bệnh tim mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên thế giới Mỗi năm, bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong cho 17,5 triệu người và dự đoán sẽ có khoảng 25 triệu người bị bệnh tim mạch tử vong vào năm 2020 Bệnh tim mạch cũng được dự đoán sẽ là nguyên nhân lớn nhất gây tàn phế cho người vào năm 2020 Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cứ mỗi 2 giây có 1 người chết vì bệnh tim mạch Cứ mỗi 5 giây thì có 1 trường hợp nhồi máu cơ tim và mỗi 6 giây thì có một trường hợp đột quỵ Hiện có đến 300 yếu tố nguy cơ kết hợp với bệnh mạch vành và đột quỵ sẽ dẫn đến bệnh tim mạch [60]

Một trong những nguyên nhân sinh lý quan trọng dẫn tới các bệnh tim mạch là do thành mạch bị tổn thương, dẫn tới hình thành huyết khối bên trong mạch máu Do vậy, điều trị huyết khối là một trong những phương pháp hiệu quả giúp làm giảm nguy cơ tử vong và các biến chứng ở các bệnh nhân mắc bệnh tim mạch, đặc biệt là ở các bệnh nhân đột quỵ và nghẽn mạch máu

Trong phác đồ điều trị huyết khối và bệnh tim mạch, chất hoạt hóa plasminogen (plasminogen activator, PA) đóng vai trò quan trọng và được xem là thuốc điều trị có hiệu quả cao Chất hoạt hóa plasmminogen có vai trò biến đổi plasminogen thành plasmin- là chất phân hủy huyết khối (thrombolytic) Plasmin sau đó sẽ hòa tan dần fibrin và fibrinogen từ đó làm tan huyết khối Bằng công nghệ gen, các PA đã được nghiên cứu và đưa vào sản xuất nhằm tạo ra thuốc đặc hiệu trong điều trị huyết khối và bệnh tim mạch Tuy nhiên, do quy trình sản xuất phức tạp nên giá thành của sản phẩm này khá cao

1.2 Chất hoạt hóa plasminogen

Chất hoạt hóa plasminogen có tác dụng quan trọng trong quá trình làm tan khối máu đông Chất hoạt hóa plasminogen là nhóm enzyme duy nhất chuyển chất

xúc tác plasminogen từ dạng bất hoạt sang dạng hoạt động - plasmin Vì đặc tính này, một vài loại plasminogen khác nhau đã được sử dụng nhằm điều trị các chứng bệnh tim mạch Chất hoạt hóa plasminogen gồm bốn nhóm chính Một nhóm là chất hoạt hóa plasminogen urokinase (urokinase- type plasminogen activator, uPA) Chất này có liên quan đến kháng thể urokinase và không kết hợp với tơ máu Bởi vậy chất hoạt hóa này được cho rằng có thể có liên quan đến hoạt hóa plasminogen trong pha lỏng của huyết thanh Loại thứ hai là chất hoạt hóa plasminogen mô (tissue-type plasminogen activator, tPA), có khả năng tương tác với kháng thể chất hoạt hóa mô và kết hợp với tơ máu Loại thứ ba là streptokinase (SK) SK hoạt hóa plasminogen bằng cơ chế trực tiếp Cuối cùng là enzyme phân hủy tơ máu (fibrinolysis) được giải phóng nhanh khi huyết tương bị tổn thương và giải phóng một số chất hoạt hóa vào thành mạch [18], [47]

Chất hoạt hóa plasminogen urokinase là sản phẩm chính của thận, tồn tại dưới dạng phân tử chất hoạt hóa urokinase sợi đơn (single chain urokinase - type plasminogen activator - scuPA) không hoạt động Chất hoạt hóa plasminogen urokinase được phân lập có hai dạng: dạng có trọng lượng phân tử cao (khối lượng 54,7kDa) và dạng có trọng lượng phân tử thấp (khối lượng 31,5kDa) [18] Chúng có hai chức năng: chức năng chính là tham gia trong phân giải protein mô liên kết và chức năng thứ hai được biết đến với vai trò điều khiển của tPA như chất hoạt động sinh lý trong máu [30] Sự hoạt hóa của scuPA do sự phân hủy xung quanh bởi plasmin trong cấu trúc hai sợi dẫn tới việc tăng hoạt tính của plasminogen lên Thông qua quá trình này, một số lượng nhỏ của plasmin có thể xúc tác sản phẩm uPA hoạt động, ảnh hưởng tới hình dạng của nhiều plasmin Chất hoạt hóa plasminogen urokinase có thể chỉ hoạt hóa plasminogen với sự có mặt của fibrin Tuy nhiên, nó sẽ không kết hợp với fibrin và sẽ không phân hủy fibrin Trong huyết tương người, nồng độ kháng thể uPA từ 2 đến 7ng/ml Giá trị cao nhất thường được tìm thấy trong bệnh nhân gan mãn tính và ung thư gan [9]

Gen mã hóa tPA và protein này đã được nhiều nhóm tác giả trên thế giới nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y- dược [31], [40] Những nghiên cứu gần đây cho thấy tPA còn đóng vai trò quan trọng trong hệ thống thần kinh [49], [56] Ở người và các động vật khác, tPA đóng vai trò quan trọng trong hệ thống tiêu hủy fibrin [53], [54] Đối với các trường hợp mắc bệnh huyết khối, sau khi tPA được đưa vào cơ thể, dưới tác dụng của tPA, plasmin sẽ được tạo ra chủ yếu tại vị trí hình thành huyết khối, nên tránh được tình trạng phân hủy ở những vùng khác trong cơ thể, tuy nhiên hoạt tính chọn lọc này chỉ là tương đối [21]

Streptokinase là một chất hoạt hóa plasminogen ngoại sinh có khối lượng

47kDa Hiện nay, Streptokinase được thu chủ yếu từ nuôi cấy vi khuẩn Streptococci B-hemolytic Streptokinase có chức năng tương tự với plasminogen ở người Chức

năng chính là phụ thêm vào thay đổi cấu trúc trong phân tử plasminogen, làm trung tâm hoạt động của phân tử plasminogen này hoạt động để hoạt hóa phân tử plasminogen thứ hai bằng cách cắt phân tử plasminogen thứ hai tại vị trí Agr560-

Hình 1.1 Cấu trúc của tPA và uPA [9]

Val561 Tiếp theo, plasminogen trong hỗn hợp Streptokinase- plasminogen sẽ được chuyển thành plasmin, cuối cùng, hỗn hợp tách nhau hình thành dạng Streptokinase và plasmin tự do Cả hai loại của hỗn hợp Streptokinase đều ảnh hưởng ngang nhau tới sự hoạt hóa của plasminogen:

Streptokinase + plasminogen → Streptokinase-plasminogen

Streptokinase- plasminogen + plasminogen → streptokinase- plasmin + plasmin Streptokinase- plasmin + plasminogen → streptokinase- plasmin + plasmin

Streptokinase là một chất hoạt hóa plasminigen không đặc hiệu Việc dùng Streptokinase dẫn tới tình trạng phân hủy hệ thống Một tác dụng không mong muốn của việc dùng Streptokinase là gây cảm ứng việc đáp ứng của chất trợ đông thông qua việc tăng giải phóng thrombin Mặc dù đáp ứng trợ đông xảy ra với tất cả

các thuốc tan huyết khối, nhưng các số liệu in vitro cho thấy tác dụng này lớn nhất

với Streptokinase

Tương ứng với các nhóm hoạt hóa plasminogen, hiện nay trên thị trường có 5 loại thuốc tan huyết khối được phép lưu hành: Alteplase tương ứng với chất hoạt hóa plasminogen mô, có nguồn gốc từ DNA tái tổ hợp do hãng Genentech sản xuất [8]; Streptase tương ứng với streptokinase có nguồn gốc từ cầu khuẩn tan máu beta được sản xuất bởi hãng Aventis Pharma; Urokinase biết đến với tên là Abbokinase được sản xuất bởi hãng ImaRx Therapeutics, urokinase có nguồn gốc từ chất chiết tế bào thận người; phức chất hoạt hóa Streptokinase plasminogen anisoylat hóa (APSAC); và Tenecteplase, một dạng biến đổi của chất hóa hóa plasminogen mô người gắn với fibrin và làm biến đổi plasminogen thành plasmin Tất cả các dạng thuốc này được dùng để điều trị nhồi máu cơ tim, huyết khối tĩnh mạch sâu, nghẽn mạch phổi, tái thông mạch Tuy nhiên, tùy từng trường hợp, các loại thuốc khác nhau được sử dụng để điều trị một cách hiệu quả và ít tốn kém nhất Ví dụ, Streptase là thuốc rẻ nhất nhưng chỉ được dùng cho những trường hợp đặc biệt vì nhiều lý do như thiếu tính đặc hiệu với sợi huyết, hiệu quả thấp, thời gian dùng thuốc kéo dài Còn Alteplase được sử dụng nhiều hơn trong điều trị nghẽn động mạch phổi lớn

1.3 Chất hoạt hóa plasminogen mô người

Chất hoạt hóa plasminogen mô người là dạng chủ yếu của dạng hoạt động nội sinh của plasminogen trong máu Nó được tạo ra dưới dạng phân tử sợi đơn ở tế bào thành mạch trong và được giữ trong huyết tương một cách liên tục hoặc giải thoát một cách nhanh chóng bằng phản ứng kích thích của chất cảm ứng của tế bào thành mạch máu [39] Dạng hoạt động plasminogen được sử dụng làm tan huyết khối về phương diện lâm sàng cho các quá trình điều trị tắc mạch phổi và chứng nhồi máu cơ tim [9], [27], [46] Không giống như nhiều protease serine khác, h-tPA

hoạt động dưới dạng sợi đơn, đặc biệt khi có mặt của fibrin hoặc fibrinogen

Ở người, gen mã hóa h-tPA là một gen đơn bản có vị trí ở 8p12 nằm trên nhiễm sắc thể số 8 [20] Ở chuột, gen này cũng nằm trên nhiễm sắc thể số 8 và có vị trí 24p22 Cấu trúc và chức năng của gen mã hóa cho h-tPA được xác định bằng kết

hợp nhân bản invitro của DNA hồng cầu từ những cá thể riêng biệt và phân lập

được các dòng từ thư viện gen người Những dòng này được xác định bằng bản đồ

enzyme hạn chế, lai Southern blot và giải trình tự DNA [13], [23] Kết quả xác định

và phân tích trình tự gen cho thấy, gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen có chiều dài 36.594bp, bao gồm 32.720bp từ vị trí khởi đầu đến vị trí đuôi polyadenyl, có thêm khoảng 353 và 344 bp của hai đầu 5’ và 3’, mười ba intron xen giữa mười bốn exon, kích thước trung bình của các exon là 914bp, trong khi của intron từ 111 đến 14.257bp [20], [37 ], [41]

Thành phần base và tần suất dinucleotide trong mRNA của gen như sau: A:26,4%; C:23,6%; G:25,3% và T:24,8% và trong trình tự ngược: A:24,8%; C:26,3%; G:22,1% và T:26,9% Trình tự cặp nucleotide như sau: AA(7,5%), AC(5,2%), AG(8,1%), AT(5,6%), CA(7,7%), CC(6,8%), CG(1,9%), CT(7,3%), GA(6,8%), GC(5,8%), GG(7,6%), GT(5,1%), TA(4,3%), TC(5,8%), TG(7,7%) và TT(6,9%) [20]

Các kết quả phân tích cho thấy cấu trúc protein h-tPA bao gồm 5 vùng thuộc hai chuỗi: chuỗi nặng của h-tPA (hay còn gọi chuỗi A, có khối lượng 39.000 kDa) được xác định ở đầu amino, còn chuỗi nhẹ (hay còn gọi chuỗi B, khối lượng 33.000

kDa) ở đầu carboxyl Trong đó, chuỗi nặng chứa ba vùng: vùng “ngón tay” (F - vùng finger ) gồm 47 amino acid từ vị trí acid amin thứ 4 - 50, người ta cũng thấy cấu trúc tương tự trong fibronectin; vùng nhân tố sinh trưởng biểu bì (epidermal growth factor region - EGF) từ amino acid có vị trí 51-87; vùng thứ ba bao gồm hai cấu trúc kringle, vùng kringle 1 (K1 - kringle one region) từ amino acid 88 - 176, vùng kringle 2 (K2 - kingle two region) từ vị trí amino acid 177 đến 262 Các cấu trúc đó cũng được tìm thấy trong prothrombin, plasminogen, urokinase và nhân tố XII [14], [19], [20], [23], [38], [45], [52] Chuỗi nhẹ của h-tPA, chứa vị trí tâm hoạt động (gồm năm exon được ngăn cách bởi bốn intron), vùng serine protease (P - serine protease domain) có vị trí từ amino acid 267 đến 527 và tương đồng với

chuỗi xúc tác của enzyme phân hủy protein serine khác [38], [45]

Các vùng này có thể nằm kế tiếp nhau hoặc được ngăn cách với nhau bởi các vùng nối ngắn Các vùng này góp phần tạo nên các đặc tính sinh học đặc hiệu của cả phân tử Vùng F đóng vai trò chủ yếu tạo nên tính ái lực cao với tơ máu Hoạt tính này thể hiện tính đặc hiệu cao của h-tPA trong quá trình phân giải các khối máu đông giàu tơ máu Vùng EGF thể hiện hoạt tính gắn h-tPA với bề mặt tế bào, chức năng này được

Hình1.2 Các vùng của tPA

Formatted: Font: 13 pt

bảo thủ trong rất nhiều protein tPA ở động vật có vú Vùng EGF chứa 6 cysteine, đây là thành phần tạo nên cầu disulfide trong domain Vùng kringle trong protease serine rất quan trọng trong mối tương tác protein-protein trong quá trình hoạt hóa plasminogen và phân giải tơ máu, hoặc quá trình chuyển đổi prothrombin-thrombin Vùng kringle 2 của h-tPA cũng liên quan chặt chẽ với quá trình gắn tơ máu và có khả năng kích thích hoạt tính h-tPA đối với fibrin nên có vai trò quan trọng trong sự kết hợp giữa h-tPA và tơ máu [16], [55] Vùng kringle 1 không được xem như có liên quan đến trong đặc tính kết hợp với tơ máu của h-tPA mặc dù trình tự amino acid của kringle 1 và kringle 2 có tính tương đồng cao [52] Vùng P đảm nhiệm chức năng phân cắt plasminogen bằng enzyme để tạo ra plasmin [37]

Protein h-tPA được tổng hợp và tồn tại trong tế bào màng trong mạch dưới dạng chuỗi polypeptide sợi đơn, tuy nhiên h-tPA trưởng thành là một sợi đơn glycoprotein có 530 amino acid; 32 amino acid trình tự đầu sẽ được cắt khỏi h-tPA

Hình 1.3 Cấu trúc h-tPA [38]

trước khi h-tPA được đưa ra bên ngoài tế bào Plasmin, kallikrein huyết tương, hoặc nhân tố Xa hoạt hóa h-tPA bằng cách cắt h-tPA ở vị trí Arg 275- Ile 276 thành hai sợi (A và B), hai sợi này liên kết với nhau bởi cầu disulfide [15], [20], [28], [34], [45], [52]

Trong tự nhiên, h-tPA tồn tại ở dạng sợi đơn Dạng hai sợi đã quan sát được trong nuôi cấy tế bào ung thư tế bào hắc tố ở người Nghiên cứu cho thấy h-tPA dạng một sợi hoạt động có hiệu quả hơn dạng hai sợi Điện di trên SDS (sodium dodecyl sulfate) cho thấy, h-tPA dạng một sợi được chuyển thành dạng hai sợi trong quá trình phân giải huyết khối [45] Theo Berg, khi bị glycosyl hóa ở vị trí Asn- 184 sẽ gây ức chế trung gian đối với plasmin để chuyển h-tPA từ phân tử dạng sợi đơn sang dạng sợi đôi, và khi glycosyl hóa ở vị trí Asn- 117 và/hoặc Asn- 448 sẽ làm giảm kích thích hoạt hóa của h-tPA kết hợp với tơ máu và hoạt động phân giải huyết khối [11]

1.4 Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm tan máu đông

Sự đông máu là một quá trình phức tạp qua đó hạn chế quá trình mất máu của cơ thể Khi thành mạch máu bị tổn thương, máu được cầm nhờ chỗ tổn thương được che phủ bởi huyết khối chứa tiểu cầu và sợi huyết Cơ chế đông máu được bảo thủ khá bền vững trong tiến hóa; ở lớp thú, hệ thống đông máu bao gồm hai thành phần: tế bào (tiểu cầu) và protein (các yếu tố đông máu) Phản ứng đông máu được kích hoạt ngay sau chấn thương làm tổn hại đến nội mạc mạch máu Tiểu cầu lập tức tạo nút chặn cầm máu tại vết thương; đây chính là quá trình cầm máu ban đầu Quá trình cầm máu thứ phát diễn ra đồng thời; các yếu tố đông máu trong huyết tương đáp ứng trong một chuỗi phản ứng để tạo các sợi huyết có vai trò củng cố nút chặn tiểu cầu

Thành phần quan trọng nhất trong hệ thống phân giải tơ máu là glycoprotein plasminogen, là chất do gan sinh ra và có mặt trong huyết tương và có mặt hầu hết ở ngoài thành mạch Plasminogen là dạng tiền enzyme (zymogen), là chất có vùng dễ phân chia, dưới tác dụng của chất hoạt hóa plasminogen sẽ được chuyển đổi thành dạng hoạt động và là dạng phân giải protein, plasmin Mục tiêu đầu tiên của plasmin là tơ máu, nhưng plasmin có thể làm giảm một vài thành phần của hỗn hợp ngoài thành mạch và chuyển một số tiền hormone và tiền cytokine thành dạng hoạt động của chúng Plasmin thường liên quan đến sự di căn của bệnh ung thư Sự phát sinh của plasmin xảy ra trước tiên trên bề mặt tơ máu, thường có điểm kết hợp cho plasminogen và yếu tố cơ bản hoạt hóa của nó trong máu, tPA [59]

Quá trình làm giảm và phân hủy tơ máu sẽ được cân bằng trong quá trình sửa chữa thành mạch máu bị tổn thương Tế bào thành mạch máu bị tổn thương sẽ giải phóng chất hoạt hoá plasminogen (tPA, uPA), hoạt hóa hệ

Hình 1.4 Quá trình phân hủy huyết khối [9]

Hình1.5 Con đường phân giải tơ máu (Fibrin) [58]

thống phân giải tơ máu Chất hoạt hóa plasminogen cắt plasminogen tạo thành plasmin, là chất phân hủy huyết khối

Nguyên tắc phân hủy tơ máu: bản thân quá trình phân hủy tơ máu được điều hòa bởi các chất ức chế chất hoạt hoá plasminogen (plasminogen activator inhibitors - PAIs) và chất ức chế plasmin (α2-antiplasmin), đây là những chất làm chậm quá trình phân giải tơ máu PAI-1, một chất quan trọng của PAI, làm cho tPA và uPA không hoạt động và được giải thoát khỏi tế bào thành mạch và hoạt hóa tiểu cầu Chất ức chế tiền plasmin là α2-antiplasmin, rất nhanh giải phóng plasmin tự do không hoạt hóa thoát khỏi huyết khối Một vài α2- antiplasmin thường liên kết với nhân tố XIIIa với tơ máu trong quá trình hình thành cục máu đông, nó có thể ngăn ngừa quá mức plasmin hoạt động trong cục máu Cả tPA và uPA đều nhanh chóng được phân hủy bởi thận, một bộ phận của ngăn ngừa phân hủy huyết khối quá mức

1.5 Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô người

Như đã trình bày, chất hoạt hóa plasminogen mô người đã được thương mại hóa với tên gọi là Alteplase do hãng Genentech sản xuất Đây là thuốc làm tan huyết khối đặc hiệu (nghĩa là chúng kết hợp chọn lọc với plasminogen đã gắn với tơ máu) [43], [44] Dược phẩm này đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration - FDA) công nhận như là một dạng thuốc chữa bệnh đột quỵ vào năm 1996 Về phương diện lâm sàng, h-tPA được xem là thuốc tan huyết khối đặc hiệu (chúng kết hợp chọn lọc với plasminogen đã gắn với tơ máu) và được lựa chọn để điều trị nhồi máu cơ tim, tắc mạch phổi, đột quỵ, tắc động mạch ngoại biên và các bệnh khác liên quan đến tan huyết khối [36], [40] Trong những năm từ cuối 1990 đến đầu năm 2000, tỷ lệ bệnh nhân bị đột quỵ được điều trị bằng h-tPA chỉ chiếm 2% Khoảng 9 năm trở lại đây, tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh tim mạch và bị đột quỵ được điều trị bằng h-tPA tăng lên đáng kể, chiếm khoảng 10- 20%

Thuốc này có ưu điểm là không có tác dụng phụ, không gây chảy máu hệ thống và hiện đang thuộc loại có doanh thu rất cao trên thị trường Từ năm 1998 đến năm 2003, doanh thu mỗi năm đạt khoảng 200 triệu USD Dự kiến, tới năm 2010 doanh thu đạt được lên tới 600 USD [22], [58]

Trong những nghiên cứu ứng dụng đầu tiên về h-tPA, các tế bào u nuôi cấy được sử dụng làm nguồn sản sinh h-tPA cho các mục đích trị bệnh [26] Tuy nhiên, các ứng dụng lâm sàng đòi hỏi quy trình sản xuất protein thích hợp với sản lượng và độ tinh sạch cao Vì vậy, nghiên cứu tạo h-tPA tái tổ hợp sử dụng các tế bào động vật có vú cũng được triển khai Các tế bào buồng trứng của chuột đồng Trung Quốc (Chinese hamster ovary - CHO) đã được chuyển gen h-tPA để tổng hợp protein h-tPA tái tổ hợp [17] Các sản phẩm DNA tái tổ hợp tạo ra từ hệ thống lên men môi trường nuôi cấy tế bào động vật có vú cũng được thu nhận và làm sạch Những nỗ lực xây dựng quy trình đơn giản tạo h-tPA tái tổ hợp hiệu quả với giá thành hạ từ vi

sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn, và cụ thể hơn là từ E coli, rất được quan tâm

nghiên cứu [23], [40]

Vi khuẩn E coli: Gen mã hóa h-tPA đã được nghiên cứu và biểu hiện trên vi

khuẩn E coli từ những năm 1983 [23], [40] Trong nghiên cứu của Pennica và đồng

tác giả (đtg), lượng h-tPA thu được chỉ đạt khoảng 50- 80 µg/l dịch nuôi, tương đương với 1500- 2400 phân tử h-tPA có hoạt tính/ tế bào [40] Đến năm 1998, sau khi tinh sạch, hàm lượng protein h-tPA thu được vào khoảng 180 µg/l dịch nuôi [42]

Gần đây, Zhu và đtg đã biểu hiện thành công protein h-tPA trong vi khuẩn E coli với

hàm lượng protein h-tPA chiếm 30% tổng số protein của vi khuẩn [57]

Nấm men: Để khắc phục những nhược điểm của vi khuẩn nói chung và E

coli nói riêng, người ta cũng có thể dùng hệ thống biểu hiện là các sinh vật nhân chuẩn bậc thấp làm vật chủ tách dòng, như nấm men (ví dụ, Saccharomyces cerevisiae, Hansenulla polymorpha, Pichia pastoris) hay tảo Ưu điểm của nấm

men là chúng có thể tiến hành rất nhiều dạng biến đổi (cấu trúc) protein và giống như vi khuẩn, chúng có tốc độ sinh sản tương đối nhanh, nhu cầu dinh dưỡng khá đơn giản, không sản sinh nội độc tố và có khả năng thích ứng cao với sản xuất quy

mô lớn S cerevisiae là nấm men được sử dụng rộng rãi nhất nhằm sản xuất các protein tái tổ hợp Hiện nay, nấm P pastoris cũng được sử dụng rộng rãi, hơn 120

protein tái tổ hợp đã được biểu hiện ở tế bào chủ này trong đó rất nhiều gen có nguồn gốc từ người và động vật

Chất hoạt hóa plasminogen mô người là một trong những protein động vật

được tổng hợp trên nấm Aspergillus nidulans [51], S cerevisiae [35] và Aspergillus niger Đối với nấm A niger, hàm lượng h-tPA được tổng hợp khoảng 0,07mg/g

sinh khối và tăng lên 1,9mg khi bổ sung peptone Chất hoạt hóa plasminogen mô

người được tạo ra trong A niger bị cắt thành dạng hai sợi có trọng lượng phân tử

giống với dạng h-tPA hai sợi của khối u người, dạng hai sợi này thường xuất hiện sau 16h nuôi cấy tế bào Tuy nhiên, thông thường chỉ dưới 1% sản phẩm h-tPA tạo

ra trong A niger có hoạt tính, và dạng h-tPA hoạt hoá không bị mất khỏi dịch trong

suốt quá trình nuôi cấy Dạng h-tPA hoạt hoá không xuất hiện bề mặt trong giai đoạn tĩnh của bể nuôi cấy, có thể do quá trình tổng hợp không đúng hoặc do quá trình phân hủy protein đã xảy ra ở vùng phân hủy protein của protein h-tPA

Tế bào động vật có vú: Do yêu cầu đa số các sản phẩm protein tái tổ hợp

cần sự biến đổi về cấu trúc nên các tế bào prokaryote không đáp ứng được Các tế bào eukaryote bậc thấp như nấm men hay tế bào côn trùng cũng không đáp ứng được đối với các quá trình biến đổi tương tự ở động vật có vú như phân giải protein, liên kết các tiểu đơn vị hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác nhau như glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành các cầu nối disulfide hoặc phosphoryl hóa các gốc amino acid, cho nên hệ thống tế bào động vật có vú như tế bào trứng chuột đồng Trung Quốc (Chinese hamster ovary - CHO) và tế bào thận chuột chưa trưởng thành (baby hamster kidney - BHK) thường được lựa chọn để sản xuất các protein trị liệu cho người Khoảng 60% protein tái tổ hợp dùng làm dược phẩm được sản xuất từ các hệ thống tế bào vật chủ này

Tuy nhiên, việc sử dụng tế bào động vật làm tế bào chủ có một số nhược điểm như: Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật, vì thế, sản lượng của chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài thường gặp nhiều khó khăn hơn Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế bào dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật và kết quả là chúng rất dễ bị biến dạng và vỡ Trong khi đó nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ, và môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền

Do vậy giá thành sản xuất các sản phẩm sử dụng các hệ thống này khá cao Sự lựa chọn hệ thống biểu hiện trên có thể ảnh hưởng đến đặc tính, chất lượng và giá thành của sản phẩm cuối cùng [12]

Động - thực vật biến đổi gen: Hiện nay, động vật và thực vật biến đổi

gen cũng được đưa vào ứng dụng để sản xuất các protein trị liệu [24], [25], [32], [50] Động vật biến đổi gen được thiết kế sao cho có thể tiết protein vào các dịch thể dễ thu nhận như sữa (bò, cừu, dê ) Người ta đã tính toán và thấy rằng sử dụng các động vật biến đổi gen để tổng hợp các protein trị liệu tái tổ hợp sẽ có thể rẻ hơn bốn đến năm lần so với sử dụng các tế bào động vật có vú nuôi cấy Bên cạnh đó, thực vật, đặc biệt là ngô, cũng đã được nghiên cứu về khả năng sản xuất các protein tái tổ hợp Từ năm 1990, protein tái tổ hợp được sản xuất từ cây thuốc lá và khoai tây chuyển gen để phục vụ cho y- dược đã bắt đầu được thương mại hóa Mười lăm năm tiếp theo, các loại DNA tái tổ hợp được chuyển vào thực vật để thu nhận protein chữa bệnh như kháng sinh, sản phẩm máu, cytokine, hormone sinh trưởng, enzyme tái tổ hợp, vaccine người và động vật… [33] Thực vật có nhiều ưu điểm hơn so với động vật trong việc tạo ra các protein tái tổ hợp Giống như nấm men, thực vật có khả năng tự thực hiện nhiều khâu để tạo ra các protein phức tạp với chi phí cho trồng trọt khá thấp Sử dụng thực vật biến đổi gen không phát sinh các tranh cãi về đạo đức, cũng như có thể tránh được các nguy cơ liên quan đến các virus, động vật, các chất độc vi khuẩn Tuy nhiên, hệ thống biểu hiện là thực vật biến đổi gen vẫn còn một vài hạn chế Thứ nhất, sản lượng protein tái tổ hợp do hệ thống biểu hiện này sinh ra còn tương đối thấp Thứ hai, tác dụng trị liệu của cùng một sản phẩm protein có nguồn gốc thực vật và động vật là khác nhau Ví dụ, nhiều protein của người thường bị glycosyl hóa, nghĩa là sau khi được tạo ra, các protein thường được gắn thêm một số gốc đường đặc trưng để giúp chúng kiểm soát hoạt động chức năng một cách bình thường Các nhà nghiên cứu đã thao tác để vượt qua được hàng rào này bằng cách tạo ra các thực vật biến đổi gen có thể tiến hành quá trình glycosyl hóa protein Các thực vật biến đổi gen này mang các gen của người mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình gắn các phân

tử đường vào protein Một nhóm nghiên cứu ở Hà Lan đã tiến hành biến đổi vật chất di truyền của một cây thuốc lá và sau đó lai cây thuốc lá biến đổi gen này với một cây được thiết kế để sinh ra một loại kháng thể của chuột Kết quả là kháng thể này cũng có dạng glycosyl hóa, rất giống với kháng thể sinh ra bởi chuột hơn bất kỳ kháng thể thực vật nào được sinh ra trước đó Có thể thấy rõ rằng, khoa học hiện đại có vai trò rất to lớn trong việc hoàn thiện các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp

1.6 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu gen/ protein có giá trị sử dụng trong y dược, tiến tới biểu hiện sản xuất protein tái tổ hợp là rất cần thiết và mới được tiếp cận nghiên cứu ở nước ta trong thời gian gần đây Một số phòng thí nghiệm đã tiến hành phân lập, xác định trình tự một số gen từ các nguồn sinh vật khác nhau, trong đó có cả gen người để nghiên cứu ứng dụng sản xuất dược phẩm công nghệ sinh học Trong đó, Viện Công nghệ sinh học đã thành công trong nghiên cứu tổng hợp Trihobakin, protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư cũng như thành công trong việc tinh chế protein bất hoạt ribosome (RIP) phân lập từ cây mướp đắng [2], [3] Cũng tại Viện Công nghệ sinh học, gen mã hóa interleukin-2 của người, tác nhân điều biến miễn dịch, được sử dụng trong điều trị ung thư, HIV, các bệnh nhiễm trùng, dị ứng đã được tách dòng và biểu hiện [5], [6]; iterleukin-2 của người rh-LL2MM bị đột biến cũng được biểu hiện thành công [4] Ngoài ra, các nhà khoa học tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh cũng đã triểu khai tạo dòng biểu hiện mini-

proinsulin của người trong E coli [7] Bên cạnh đó, các nghiên cứu tạo vaccine tái

tổ hợp cũng được quan tâm nghiên cứu ở nhiều phòng thí nghiệm [1] Tuy nhiên, cho đến nay chưa có một công bố nào về nghiên cứu sản xuất h-tPA tái tổ hợp ở nước ta, vì vậy đề tài này sẽ làm tiền đề cho quá trình nghiên cứu và sản xuất chất hoạt hóa plasminogen tái tổ hợp

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 2.1.1 Vật liệu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vật liệu ban đầu là cDNA mã hóa h-tPA đã được chọn dòng trong vector pUC18 (pUC18/ h-tPA) trong nghiên cứu trước đây [10].

Vector biểu hiện gồm hai loại: pET21a(+) được mua từ Hãng Novagen (Mỹ) và pGEX6p1 được mua từ Hãng Pharmacia

Bản đồ hai vector được trình bày trong hình 2.1:

Hình 2.1 Bản đồ vector pET21a(+) và pGEX6p1

Chủng E.coli DH5α được mua từ Hãng Invitrogen (Mỹ) và chủng E.coli

BL21(DE3) pLysS Competent Cells từ Hãng Promega (Mỹ)

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được đặt mua từ nhiều hãng khác nhau Danh sách các hóa chất cần thiết, các dung dịch sử dụng và trình tự mồi được trình bày tương ứng ở các Bảng 1, 3 và 4 trong phần Phụ lục

2.1.3 Các thiết bị

Các thiết bị được sử dụng thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen và phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam được mua từ nhiều hãng khác nhau Các thiết bị thường sử dụng được liệt kê ở Bảng 2 phần Phụ lục

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Điện di DNA trên gel agarose

Mục đích: Điện di giúp phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau, từ đó xác định được sự có mặt các đoạn DNA quan tâm

Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên đặc tính tích điện của hầu hết các phân tử Các phân tử ở dạng ion khác nhau về mức độ ion hóa, kích thước phân tử có thể tách riêng biệt theo khả năng di động trong trường điện từ về hai cực âm (-) và dương (+) Các phân tử DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của máy điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp

Hóa chất điện di: agarose 0,8-1,5% (phụ thuộc vào kích thước phân tử DNA Ở đây, chúng tôi sử dụng agarose nồng độ 0,8% bởi nồng độ này phù hợp với kích thước của đoạn gen), dung dịch đệm TAE 1X

Quy trình điện di:

- Chuẩn bị gel agarose: hòa tan 0,8 gram agarose vào 100ml dung dịch TAE 1X, đun sôi cho dung dịch tan hoàn toàn Để nhiệt độ xuống khoảng 50- 60oC, đổ dung dịch agarose vào khay gel điện di có cài sẵn lược thích hợp Sau 30- 60 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra và đặt vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel từ 1- 2 mm [48]

- Mẫu DNA được trộn với 3- 5l đệm tra mẫu và được tra vào các giếng trên gel Chạy điện di với hiệu điện thế 100V, 60- 80mA trong khoảng 30 phút

- Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm 5 phút trong dung dịch EtBr nồng độ 0,5g/ml, sau đó rửa sạch bằng nước

- Quan sát và chụp ảnh trên máy Bio- Rad với tia UV có bước sóng 320nm

2.2.2 Điện di protein trên gel polyacyamide

Nguyên tắc: Các tiểu phần protein được xác định dựa vào tốc độ di chuyển khác nhau của các tiểu phần protein trong trường điện Ở một số điều kiện nhất định, protein ở dạng ion và có mức độ ion hóa khác nhau, nên có thể tách riêng biệt chúng theo khả năng di động trong trường điện từ về hai cực âm (-) và dương (+) Kết quả nhận được phổ các vạch protein khác nhau Phương pháp điện di là một phương pháp nghiên cứu sinh hóa thông dụng và rất tiện lợi Phương pháp điện di protein thường được tiến hành trên chất mang ở dạng gel là lưới polymer Lưới polymer làm chậm tốc độ di chuyển các phân tử protein theo khối lượng, kích thước, độ mang điện của chúng

Phương pháp điện di protein trên gen polyacrylamit có chứa SDS được tiến hành theo phương pháp của Laemmli [29] Thành phần gel được trình bày ở Bảng

11 phần Phụ lục Quy trình điện di như sau:

- Pha mẫu với Protein Sample Buffer 4X và biến tính mẫu ở 95oC trong 5 phút Dùng 10 l mẫu tra vào từng giếng và tiến hành điện di trên gel polyacrylamide 10% gồm gel cô 4% và gen tách 10%

- Đổ dung dịch chạy (Running buffer) SDS- Page 1x và chạy điện di: Chạy ở hiệu điện thế 110V trong 2- 3 giờ Theo dõi đến khi thấy màu dung dịch đệm mẫu bắt đầu thoát ra ngoài dung dịch đệm chạy thì kết thúc

- Bản gel được nhuộm trong dung dịch nhuộm (Comasive Brilliant Blue R250) trong khoảng từ 30 phút đến 1 giờ

- Tẩy gel bằng cách ngâm bản gel đã nhuộm vào dung dịch tẩy (acid acetic 7%, metanol 20%) đến khi bản gel màu trắng thì kết thúc quá trình tẩy Thời gian tẩy khoảng 30 phút Sau đó gel được bảo quản và chụp ảnh

2.2.3 Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction- PCR)

Phương pháp PCR nhằm mục đích khuyếch đại in vitro một đoạn DNA khi

biết trình tự hai đầu Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là nhờ sự xúc tác của enzyme

DNA polymerase chịu nhiệt để khuyếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro trong môi trường có các dNTP và cặp mồi đặc hiệu [48]

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi là Cặp 1: h-tPA-NdeI F2, h-tPA-XhoI R3; Cặp 2: h-tPA-BamHI F2, h-tPA-XhoI R4

Các thành phần của PCR: đoạn DNA khuôn (cDNA mã hóa h-tPA được tạo dòng trong vector pUC18), hai cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15- 30 nucleotide, bốn loại dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), DNA polymerase

PCR bao gồm các giai đoạn:

– Giai đoạn biến tính: DNA được biến tính ở nhiệt độ khoảng 94oC- 95oC trong thời gian một vài phút, khi đó các liên kết hydro bị đứt và sợi DNA dạng sợi kép thành hai sợi đơn;

– Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ từ 40oC- 65oC trong khoảng 30 giây đến 1 phút, hai đoạn mồi chuyên biệt sẽ bắt cặp với sợi DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung ở hai đầu đoạn DNA cần nhân Nhiệt độ của bước gắn mồi tùy thuộc vào từng loại mồi cụ thể, được tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi;

– Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ phản ứng được nâng lên 70oC- 80oC (trung bình khoảng 720C) trong khoảng thời gian thích hợp (tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần

tổng hợp), enzyme Taq polymerase hoạt động và quá trình tổng hợp DNA diễn ra;

Quy trình phản ứng được thực hiện trên máy PCR GeneAmp PCR System 9700 với thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng 5 phần Phụ lục, chu trình nhiệt phản ứng như sau:

Chu trình nhiệt trên máy GenAmp PCR System 9700 như sau:

94oC 94oC 60oC 72oC 72oC 4oC 3’ 30’’ 30’’ 1’30’’ x30ck 10’ 

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose

0,8%, sau đó được tinh sạch DNA theo kit Wizard SV Gel and Clean-Up System 2.2.4 Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế

Nguyên tắc: Enzyme hạn chế là một nuclease nội bào có khả năng nhận biết các đoạn DNA với các trình tự nucleotide nhất định, bám vào đoạn DNA đó và cắt cả hai sợi của phân tử DNA Enzyme hạn chế cắt DNA hình thành hai dạng đầu: tạo đầu bằng và tạo đầu dính

Đối với sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành cắt bằng hai cặp enzyme

BamHI/XhoI và NdeI/XhoI Vector pET21a(+) được xử lý bằng NdeI/XhoI và pGEX6p1 được cắt bằng BamHI/XhoI Thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng

6 phần Phụ lục Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp (thường ở 370C, 2 giờ) Sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel

agarose 0,8%;

Sau khi cắt bằng enzyme hạn chế, các vector được xử lý với phosphatase để loại nhóm phosphate ra khỏi đầu 5’ nhằm giảm quá trình nối lại của vector Thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng 7 phần Phụ lục Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 1h sau đó tiếp tục ủ ở 75oC trong 15 phút để loại CIP [48]

2.2.5 Ghép nối DNA

Nguyên tắc: Đoạn cDNA và vector được xử lý bằng cùng một loại enzyme hạn chế tạo đầu bổ sung, các đầu này có trình tự bắt cặp với nhau Dưới tác dụng của enzyme T4 DNA ligase, đoạn DNA quan tâm sẽ được gắn vào vector Thành phần

phản ứng ghép nối được trình bày ở Bảng 8 Phần Phụ lục

Hỗn hợp phản ứng được trộn đều và ủ 14- 24 giờ, ở 16oC Sản phẩm phản ứng

được biến nạp vào E coli và chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung Ampicillin

(Amp), nồng độ 50µg/ml [48]

2.2.6 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E coli bằng phương

pháp sốc nhiệt

Tùy từng mục đích khác nhau mà chúng tôi chuẩn bị các chủng vi khuẩn

khác nhau Chủng tế bào dùng tạo dòng là vi khuẩn E coli chủng DH5α Để biểu hiện, chúng tôi sử dụng vi khuẩn E coli chủng BL21 Quy trình chuẩn bị và biến

nạp đối với hai chủng là tương tự nhau [48]

2.2.6.1 Chuẩn bị tế bào khả biến E coli

- Chủng vi khuẩn lấy từ ống giữ chủng được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 37oC; Ngày hôm sau lấy 1 khuẩn lạc rời từ đĩa cấy ria, nuôi lắc 200vòng/phút (v/p) ở 37oC trong môi trường LB lỏng từ 1- 2h; Ngày tiếp theo cấy trải dịch nuôi ra đĩa chứa môi trường LB đặc Nuôi qua đêm ở 37oC;

- Chọn 1 khuẩn lạc từ đĩa, cấy chuyển vào 1,5 ml môi trường LB lỏng, nuôi qua đêm ở 37oC;

- Cấy chuyển 200l dịch nuôi sang 30 ml LB lỏng Nuôi lắc trong 3h ở 37oC; - Chuyển dịch nuôi sang ống ly tâm Giữ lạnh trên đá trong 10 phút;

- Ly tâm 4200 v/p trong 10 phút, ở 4oC Đổ bỏ dịch nổi; sau đó bổ sung 15 ml dung dịch CaCl2 0,1M Làm tan hết tủa tế bào trong dung dịch CaCl2 Ủ trên đá trong 40 phút;

- Ly tâm 4200 v/p trong 10 phút ở 4oC Đổ bỏ dịch nổi; bổ sung 1,5 ml dung dịch CaCl2 0,1 M Ly tâm nhẹ để hòa tan tủa tế bào vào dung dịch CaCl2;

- Chia ra các ống eppendorf và bổ sung 20 l glycerol 100% Búng nhẹ để trộn đều các thành phần với nhau (thao tác trong box) Giữ tế bào khả biến ở -80oC [48]

2.2.6.2 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli

- Tế bào khả biến E coli được giữ trên đá khoảng 30 phút, sau đó bổ sung 5l

của sản phẩm ghép nối vào ống tế bào khả biến (khoảng 100l) Giữ trong đá khoảng 15 phút;

- Sốc nhiệt ở 42oC trong 70 giây, sau đó chuyển ngay sang bình đá và giữ trong đá 5 phút;

- Bổ sung 300l môi trường LB lỏng; - Nuôi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1giờ;

- Cấy trải hết dịch tế bào trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50g/ml), nuôi ở 37oC qua đêm [48]

2.2.7 Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid

Nguyên tắc: Tách chiết plasmid dựa trên hai nguyên ngắc cơ bản là DNA

nhiễm sắc thể của E coli có kích thước lớn hơn rất nhiều so với DNA plasmid; do trọng lượng, kích thước khác nhau giữa các dạng DNA E coli mà hầu hết DNA

plasmid tách ra dưới dạng vòng đóng [48]

Hóa chất tách chiết DNA plasmid gồm: Sol I, Sol II, Sol III, dung dịch loại protein (hỗn hợp chloroform: isoamylalcohol = 24:1), dung dịch TE 0,01M, pH 8,0

Quy trình tách chiết DNA plasmid của E coli

- Nuôi cấy lắc qua đêm tế bào E coli trong 1,7ml môi trường LB (có kháng

sinh Amp nồng độ 50g/ml) ở 370C, 200 v/p; Ngày hôm sau, ly tâm dịch nuôi cấy trên ở 6.000 v/p, 7 phút; loại bỏ dịch;

- Hoà cặn tế bào vi khuẩn trong 150l dung dịch I để lạnh, voltex làm tan cặn tế bào, sau đó giữ trong đá 5 phút;

- Bổ sung 150l dung dịch II, đảo đầu ống Eppendorf nhẹ nhàng và giữ trên đá 10 phút;

- Thêm 150l dung dịch III để lạnh, đảo nhẹ và ủ trong đá từ 3 – 5 phút; - Thêm 500 l dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ thể tích 24:1) Đảo đều hỗn hợp;

- Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC Chiết và chuyển pha lỏng ở phía trên sang một ống eppendorf mới; Thêm 50 l CH3COONa 3 M (pH 5,2) và 1 ml cồn 100 % Đảo đều và giữ lạnh ở -200C trong 3 giờ;

- Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC để thu tủa DNA;

- Rửa cặn bằng 0,2ml cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút, làm khô và hoà cặn trong 40l TE 0,01M, giữ ở -20oC; Sau đó đổ bỏ cồn Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút;

- Hòa tan tủa DNA trong 50 l nước chứa RNase (0,01 mg/ml) Bảo quản DNA ở -20oC; Kiểm tra DNA bằng gel agarose 0,8 %

Các dòng mang vector tái tổ hợp sau khi được xác định sẽ được kiểm tra bằng enzyme hạn chế và PCR kiểm tra Thành phần cắt kiểm tra được nêu ở Bảng 9 phần Phụ lục Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 2h Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR kiểm tra giống với quá trình nhân gen Sản phẩm cắt và PCR kiểm tra được điện di trên gel agarose 0,8%

Thành phần PCR xác định trình tự được trình bày ở Bảng 10 phần Phụ lục Chu trình nhiệt trên máy GenAmp PCR System 9700 như sau:

96oC 96oC 50oC 60°C 4oC 1’ 10’’ 5’’ x25ck 4’ ∞

- Tiếp đó, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng phương pháp tủa cồn/EDTA:

- Bổ sung 4l EDTA 125mM có pH 8,0 và 60l cồn 100% Đảo nhẹ hỗn hợp và để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC Loại bỏ cồn

- Rửa tủa bằng 60l cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 10 phút và làm khô - Bổ sung 10l Hi–DiTM Formamide và biến tính ở 95oC trong 5 phút Các mẫu được cho vào các giếng của khay đựng mẫu Điện di trong ống vi mao quản 80 cm x 50 m chứa POP- 4TM

Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3100 Data Collection

v2.0, Seqscape v2.5 và BioEdit v7.0.5

2.2.9 Biểu hiện protein trong vi khuẩn E coli

Sau khi plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa h-tPA được biến nạp thành

công vào tế bào biểu hiện E.coli chủng BL21, protein tái tổ hợp được tiến hành biểu

hiện và kiểm tra theo các bước sau:

- Chọn một khuẩn lạc (E coli BL21) nuôi lắc ở 200 v/p trong 5ml LB lỏng có

bổ sung Amp (100g/ml) ở 37oC qua đêm;

- Ngày tiếp theo, hút 2ml dịch vi khuẩn trên vào 100 ml LB lỏng có bổ sung Amp (100g/ml) Tiếp tục nuôi lắc ở 200 v/p ở 37oC đến OD600= 0,6- 0,8;

- Cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG nồng độ 1mM (Tỷ lệ 100 l IPTG cho 100ml dịch nuôi) Để tế bào tiếp tục sinh trưởng trong 3h;

Kiểm trabiểu hiện: hút 1ml dung dịch nuôi cấy sang ống eppendoft mới Ly tâm thu tế bào và bổ sung 100 µl loading dye Voltex phá tế bào, biến tính protein trong 5 phút ở 95oC;

- Dùng 10l mẫu để điện di SDS-PAGE cùng với thang chuẩn protein và mẫu

đối chứng âm là dịch phá màng của E.coli BL21 và dịch phá màng E.coli BL21chứa

vector rỗng được cảm ứng IPTG;

- Phần dịch nuôi cấy còn lại được ly tâm thu tế bào Giữ tế bào ở -20oC chờ bước tinh chế protein

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA

3.1.1 Nhân đoạn cDNA mã hoá h-tPA bằng kỹ thuật PCR

Gen mã hóa h-tPA sử dụng trong nghiên cứu đã được tạo dòng trong vector pUC18 Để kiểm tra cDNA mã hóa h-tPA, chúng tôi đã tiến hành xác định trình tự cDNA mã hóa h-tPA trong vector pUC18 sử dụng cặp mồi M13, sau đó trình tự này được phân tích và so sánh với trình tự NM000930 trên Ngân hàng Gen Quốc Tế Kết quả phân tích và so sánh cho thấy, trình tự cDNA trong vector pUC18 có độ tương đồng tới 99% với trình tự so sánh, các điểm đột biến giữa h-tPA với trình tự NM000930 không làm thay đổi trình tự acid amin Trình tự bao gồm đầy đủ các thành phần cần thiết cho biểu hiện gen như mã mở đầu, mã kết thúc, đúng khung đọc

Sau khi xác định trình tự cDNA mã hóa h-tPA, chúng tôi đã tiến hành PCR với hai cặp mồi đặc hiệu và khuôn là vector pUC18 tái tổ hợp để tạo dòng cDNA này trong vector biểu Hai cặp mồi đã được chúng tôi thiết kế mang các trình tự nhận biết của enzyme hạn chế để sử dụng cho các quá trình ghép nối gen và kiểm tra sản phẩm Việc thiết kế thêm trình tự nhận biết của các enzyme hạn chế vào mồi tuân theo một số nguyên tắc như trình tự nhận biết chỉ có một vị trí trong vùng gắn đa vị của vector và không có mặt trong gen cần tạo dòng; số nucleotide phía ngoài trình tự nhận biết từ 3- 6 nucleotide nhằm bảo vệ các trình tự này và giúp các enzyme cắt tốt hơn Trong nghiên cứu này, đối với vector pGEX6p1 chúng tôi sử

dụng hai enzyme là BamHI và XhoI, vì chúng có mặt trong vùng cắt gắn đa vị của

vector biểu hiện pGEX6p1; đối với vector pET21a(+), chúng tôi đã sử dụng hai

enzyme NdeI và XhoI Các enzyme này đều không có điểm cắt trên cDNA mã hoá

h-tPA Trình tự hai cặp mồi như sau:

Cặp 1:

htPA-NdeI F2: 5’-GTG AAG CAC ATA TGG ATG CAA TGA AGA GAG G-3’ htPA-XhoI R3: 5’-GTG GTG CTC GAG CGG TCG CAT GTT GTC-3’