PCR)
Phương pháp PCR nhằm mục đích khuyếch đại in vitro một đoạn DNA khi biết trình tự hai đầu. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là nhờ sự xúc tác của enzyme DNA polymerase chịu nhiệt để khuyếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro trong môi trường có các dNTP và cặp mồi đặc hiệu [48].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi là Cặp 1: h-tPA-NdeI
F2, h-tPA-XhoI R3; Cặp 2: h-tPA-BamHI F2, h-tPA-XhoI R4.
Các thành phần của PCR: đoạn DNA khuôn (cDNA mã hóa h-tPA được tạo dòng trong vector pUC18), hai cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15- 30 nucleotide, bốn loại dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), DNA polymerase.
PCR bao gồm các giai đoạn:
– Giai đoạn biến tính: DNA được biến tính ở nhiệt độ khoảng 94oC- 95oC trong thời gian một vài phút, khi đó các liên kết hydro bị đứt và sợi DNA dạng sợi kép thành hai sợi đơn;
– Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ từ 40oC- 65oC trong khoảng 30 giây đến 1 phút, hai đoạn mồi chuyên biệt sẽ bắt cặp với sợi DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung ở hai đầu đoạn DNA cần nhân. Nhiệt độ của bước gắn mồi tùy thuộc vào từng loại mồi cụ thể, được tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi;
– Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ phản ứng được nâng lên 70oC- 80oC (trung bình khoảng 720C) trong khoảng thời gian thích hợp (tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần tổng hợp), enzyme Taq polymerase hoạt động và quá trình tổng hợp DNA diễn ra;
Quy trình phản ứng được thực hiện trên máy PCR GeneAmp PCR System 9700 với thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng 5 phần Phụ lục, chu trình nhiệt phản ứng như sau:
Chu trình nhiệt trên máy GenAmp PCR System 9700 như sau:
94oC 94oC 60oC 72oC 72oC 4oC 3’ 30’’ 30’’ 1’30’’ x30ck 10’
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó được tinh sạch DNA theo kit Wizard SV Gel and Clean-Up System.