Định danh và bước đầu nuôi trồng nấm cổ linh chi ở vùng bảy núi tỉnh an giang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP-TNTN ĐỊNH DANH VÀ BƯỚC ĐẦU NUÔI TRỒNG NẤM CỔ LINH CHI Ở VÙNG BẢY NÚI TỈNH AN GIANG HỒ THỊ THU BA An Giang, Tháng – 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP-TNTN ĐỊNH DANH VÀ BƯỚC ĐẦU NUÔI TRỒNG NẤM CỔ LINH CHI Ở VÙNG BẢY NÚI TỈNH AN GIANG HỒ THỊ THU BA An Giang, Tháng – 2019 Đề tài nghiên cứu khoa học “Định danh bước đầu nuôi trồng nấm cổ linh chi vùng Bảy Núi Tỉnh An Giang”, Hồ Thị Thu Ba công tác Khoa Nông Nghiệp-TNTN thực Hồ Thị Thu Ba báo cáo kết nghiên cứu hội đồng Khoa học Đào tạo Trường Đại học An Giang thông qua ngày Thư ký Phản biện Phản biện Chủ tịch Hội đồng LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành đề tài xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học Khoa Nông Nghiệp TNTN ln nhắc nhỡ động viên tơi hịan thành nghiên cứu Xin gửi lời cảm ơn đến phịng Thí nghiệm phòng Quản lý Khoa học HTQT trường Đại học An Giang tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin trân trọng cảm ơn An Giang ngày 10 tháng năm 2019 Người thực Hồ Thị Thu Ba i TÓM TẮT Đề tài “Định danh bước đầu nuôi trồng nấm cổ linh chi vùng Bảy Núi tỉnh An Giang” đề tài tiến hành thử nghiệm tiến tới xây dựng quy trình trồng nấm cổ linh chi bao gồm làm meo giống cấp 1, cấp lựa chọn chất ni trồng thích hợp để nấm tạo thể đạt suất cao Đề tài thực phịng thí nghiệm trường Đại học An Giang từ tháng năm 2018 đến tháng năm 2019 Kết đề tài phân lập thành công nấm cổ linh chi từ tự nhiên bước đầu xác định lồi Ganoderma applanatum thơng qua trình tự 18S rRNA quan sát hình thái Mơi trường nhân giống cấp tốt cho nấm Rapper với tốc độ lan tơ nhanh so sánh với loài linh chi khác, môi trường gạo lức môi trường nhân giống cấp tối ưu môi trường tạo thể thích hợp mơi trường với tỉ lệ phối trộn 90% mạt cưa cao su + 5% cám + 5% bắp Từ khóa: Ganoderma applanatum, mơi trường nhân giống, thu thập, định danh ii ABSTRACT The thesis “Identification and evaluate culture media for producing Ganoderma sp in the Bay Nui region, An Giang province” was performed to carry out first stage medium, secondary stage medium and media for giving primordia with high yield This thesis was performed at laboratory of An Giang university from 5/2018 to 05/2019 Theses obtain results as follows: This fungus was isolated successfully and it could be Ganoderma applanatum by comparing 18S rRNA sequences and observating the morphological characteristics The best first stage medium for G applanatum was Rapper which showed the speed of mycelin growth so faster than others Ganoderma sp, the best secondary stage medium was brown rice and the medium was good for giving primordia with high yield was 90% rubber sawdust + 5% rice bran + 5% corn flour Key word: Ganoderma applanatum, identification iii propagation medium, collecting, LỜI CAM KẾT Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu chúng tơi Các số liệu cơng trình nghiên cứu có xuất xứ rõ ràng Những kết luận khoa học cơng trình nghiên cứu chưa cơng bố cơng trình khác An Giang ngày 10 tháng năm 2019 Người thực Hồ Thị Thu Ba iv MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii ABSTRACT iii LỜI CAM KẾT iiiv MỤC LỤC v DANH SÁCH BẢNG vii DANH SÁCH HÌNH viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iixx CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.2 Nội dung nghiên cứu 1.3 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu ………………………………….2 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu ………………… ……………….…………2 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu ……………………… ………… ………… CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Phân loại nấm 2.1.1 Phân loại nấm ăn nấm dƣợc liệu 2.1.2 Giá trị y dược nấm linh chi 2.1.3 Nấm cổ linh chi …………………………………………….………4 2.2 Định danh nấm 2.2.1 Định danh thông qua hình thái 2.2.2 Định danh kĩ thuật sinh học phân tử 2.3 Công nghệ trồng nấm ……………………………………………….…7 2.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc… …………………….11 2.4.1 Nghiên cứu nước 11 2.4.2 Nghiên cứu nước 12 v CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 14 3.1.1 Thời gian địa điểm 14 3.1.2 Nguyên vật liệu 14 3.1.3 Hóa chất 14 3.1.4 Thiết bị dụng cụ 14 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 3.2.1 Nội dung 1: Phân lập định danh đối tượng nghiên cứu 14 3.2.2 Nội dung 2: Khảo sát số môi trường nhân nuôi nấm 17 3.3 Xử lí số liệu 20 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Kết phân lập định danh 21 4.1.1 Kết phân lập nấm cổ linh chi 21 4.1.2 Kết định danh nấm cổ linh chi 21 4.2 Kết lựa chọn môi trƣờng nuôi trồng 25 4.2.1 Khảo sát môi trường nhân giống cấp 25 4.2.2 Khảo sát môi trường nhân giống cấp 28 4.2.3 Khảo sát môi trường nuôi trồng …… …………………… …… 29 4.2.4 Đánh giá hiệu suất sinh học 32 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ CHƢƠNG 41 vi DANH SÁCH BẢNG Bảng Thành phần phản ứng PCR thể tích 25µL 16 Bảng Kết khảo sát môi trường nhân giống cấp 26 Bảng Kết khảo sát môi trường nhân giống cấp 28 Bảng Thời gian lan tơ môi trường nuôi trồng 30 Bảng Đánh giá khối lượng nấm thu môi trường nuôi trồng 33 vii Khoa học quốc gia quốc t g phản bi n khoa học, trang: 247- 250 g ỷ y u (Proceedings), h i ngh có S.Bhosle, K.Ranadive, G.Bapat, S.Garad, G.Deshpande, J.Vaidya (2010) Taxonmy and Diversity of Ganoderma from the Western parts of Maharashtra (India), Mycosphere, 1(3), 249-262 Van de Peer Y, Chapelle S and De Wachter R (1996) A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA Nucleic Acids Res 1996 Sep 1;24(17):3381-91 V.Z.Ivan, N.E.Oleg, P.W.Solomon (2012) A Survey of species of genus Trametes Fr Higher Basidiomycetes) with Estimation oF their medicinal source potential,International Journal of Medicinal Mushrooms, 14(3), 307-319 Võ Th Ph g Kh h Bằng v i chủng nấ Ph m Thành Hổ (1998) Lai nấ h g Le i e e C h g h p từ Nh t T p chí Di truy n học ng d ng, p1 Wagner, H., S Bladt and V Rickl (1996) Plant drug analysis: a thin layer chromatography atlas 2nd edition Springer Berlin 384 pp White, T J., T D Bruns, S B Lee, and J W Taylor (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA Genes for phylogenetics In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press US 482pp 40 PHỤ CHƢƠNG PHỤ CHƢƠNG A: Các bảng số li u i Bảng A.1 K t thí nghi m khả Nghi m th c Lặp l i ng nhân giống cấp B h Ngày Ngày Ngày 1,5 2,3 4,1 2,2 3,9 1,2 2,2 4,2 1,6 3,6 1,3 1,9 3,8 0,9 1,9 3,7 0,8 1,8 1,2 2,2 3,9 1,1 2,4 3,6 10 1,4 2,3 3,7 0,8 2,3 3,8 0,7 2,4 3,7 2,5 3,5 1,1 3,6 1,2 1,9 3,4 0,6 1,8 3,6 0,7 1,7 3,6 0,8 2,1 3,5 0,8 3,7 10 0,9 3,5 PGA PSA 41 PSA + i 0,9 2,2 3,8 1,9 3,7 1,1 2,1 4 1,2 1,8 3,6 c dừa 0,9 3,5 0,8 1,7 3,5 0,8 1,8 3,6 0,7 1,9 3,4 0,9 2,2 3,9 10 1,1 2,3 3,8 1,1 1,9 3,8 0,9 1,8 3,9 1,2 4 0,8 1,7 3,7 0,7 1,6 3,1 0,7 1,9 0,8 1,8 3,5 0,9 2,1 3,6 1,1 3,6 10 0,9 2,1 3,5 1,2 2,4 4,4 1,1 2,3 4,5 0,9 2,2 4,3 1,6 4,1 1,3 2,6 4,7 1,4 2,8 4,7 PSA + c giá u xanh Rapper 42 1,5 2,6 4,5 1,8 2,9 4,6 1,9 2,4 4,2 10 1,5 2,3 4,5 i Bảng A.2 K t thí nghi m khả Nghi m th c Lặp l i Th i gi ng nhân giống cấp g y 50% 100% 16 15 16 17 17 18 19 8 17 18 10 17 11 10 11 12 13 11 11 10 Lúa G ol c 43 13 10 14 18 20 17 17 18 19 7 16 8 14 15 10 16 Bắp Bảng A.3 K t Nghi m th c h gi h i gi Lặp l i thí nghi m nuôi trồng Th i gi (ngày) 50% 100% 16 28 17 29 16 28 18 27 16 27 17 27 19 28 19 26 19 28 10 18 27 100% m 44 95% m cám 95% m bắp + 5% + 5% 90% m + 5% cám + % bắp 17 26 16 26 16 25 15 28 14 24 16 26 16 28 17 29 18 27 10 17 28 17 28 17 28 18 27 19 29 17 28 17 27 16 26 16 25 16 26 10 15 27 15 26 15 25 16 27 15 24 17 28 16 26 45 Bảng A.4 Khối Nghi m th c 14 24 14 25 14 24 10 16 26 ng nấ h c nghi m th c nuôi trồng Lặp l i Khối 8.8 10.5 10.3 10.5 10.4 11 9.9 9.5 9.1 10 10.8 9.4 9.7 10.6 11.5 11.2 10.9 10 9.8 100% m 95% m + 5% 46 ng nấm (gram) 95% m 90% m % bắp + 5% ắp + 5% + 12 10 12.1 10.8 10.7 11.1 10.3 10.2 11.1 9.6 9.6 10.3 10 10.2 11.8 12 11.6 12.2 10.5 10.8 10.7 11.5 11.3 10 11.1 47 PHỤ CHƢƠNG B: K t thống kê Bảng B.1 Bả g ANOVA h h h g i h ghi m (ngày th 4) Đ t Tổng bình h g Trung bình h h g F-value P-Value Giữa nhóm 2,259 0,5648 11,18 Trong nhóm 45 2,273 0,05051 Tổng 49 4,532 Nguồn bi ng Bảng B.2 Ki nh LSD m Nghi m th c Lặp l i Trung bình Nhóm Rapper 10 1,42 A PGA 10 1,2 PSA +nuoc dua 10 0,94 C PSA + Gia 10 0,91 C PSA 10 0,86 C Bảng B.3 Bả g ANOVA h tin c y 95% thí nghi m (ngày th 4) h h B g i h ghi m (ngày th 6) Đ t Tổng bình h g Trung bình h h g F-value P-Value Giữa nhóm 1,799 0,4498 8,88 Trong nhóm 45 2,28 0,05067 Tổng 49 4,079 Nguồn bi ng Bảng B.4 Ki m nh LSD m tin c y 95% thí nghi m (ngày th 6) Nghi m th c Lặp l i Trung bình Nhóm Rapper 10 2,45 A PGA 10 2,12 B PSA +nuoc dua 10 2,07 BC PSA + Gia 10 1,99 BC 48 PSA 10 Bảng B.5 Bả g ANOVA h 1,89 h h g C i h ghi m (ngày th 8) Đ t Tổng bình h g Trung bình h h g F-value P-Value Giữa nhóm 4,889 1,2222 29,01 Trong nhóm 45 1,896 0,04213 Tổng 49 6,785 Nguồn bi ng Bảng B.6 Ki nh LSD m Nghi m th c Lặp l i Trung bình Nhóm Rapper 10 4,45 A PGA 10 3,85 B PSA +nuoc dua 10 3,68 BC PSA + Gia 10 3,67 BC PSA 10 3,59 C Bảng B.7 Bả g ANOVA h tin c y 95% thí nghi m (ngày th 8) h h g i h ghi % Đ t Tổng bình h g Trung bình h h g F-value P-Value Giữa nhóm 28,07 14,0333 17,79 Trong nhóm 27 21,3 0,7889 Tổng 29 49,37 Nguồn bi ng Bảng B.8 Ki nh LSD m tin c y 95% thí nghi Nghi m th c Lặp l i Trung bình Nhóm Lúa 10 7,5 A Bắp 10 7,4 A G ol c 10 5,4 B Bảng B.9 Bả g ANOVA h Nguồn bi ng Đ t h h g i h Tổng bình 49 ghi % Trung bình % F-value P-Value h g h h Giữa nhóm 194,4 97,2 Trong nhóm 27 58,4 2,163 Tổng 29 252,8 nh LSD m Bảng B.10 Ki tin c y 95% thí nghi g 44,94 Nghi m th c Lặp l i Trung bình Nhóm Lúa 10 17 A Bắp 10 17 A G ol c 10 11,6 B Bảng B.11 Bả g ANOVA h h h g i h % ghi % Đ t Tổng bình h g Trung bình h h g F-value P-Value Giữa nhóm 28,48 9,492 7,22 0,001 Trong nhóm 36 47,3 1,314 Tổng 39 75,77 Nguồn bi ng Bảng B.12 Ki nh LSD m Nghi m th c Lặp l i Trung bình Nhóm MC 10 17,5 A MC – Bap 10 16,8 AB MC – Cam 10 16,2 BC MC – Cam – Bap 10 15,2 C Bảng B.13 Bả g ANOVA h % tin c y 95% thí nghi h h g i h ghi % Đ t Tổng bình h g Trung bình h h g F-value P-Value Giữa nhóm 22,4 7,467 4,63 0,008 Trong nhóm 36 58 1,611 Nguồn bi ng 50 Tổng 39 80,4 Bảng B.14 Ki nh LSD m Nghi m th c Lặp l i Trung bình Nhóm MC 10 27,5 A MC – Bap 10 27,1 A MC – Cam 10 26,7 A MC – Cam – Bap 10 25,5 Bảng B.15 Bả g ANOVA h tin c y 95% thí nghi h h g % B i hố ng nấm Đ t Tổng bình h g Trung bình h h g F-value P-Value Giữa nhóm 8,865 2,955 5,61 0,003 Trong nhóm 36 18,966 0,5268 Tổng 39 27,831 Nguồn bi ng Bảng B.16 Ki nh LSD m Nghi m th c Lặp l i Trung bình Nhóm MC 10 10,08 A MC – Bap 10 10,39 A MC – Cam 10 10,72 AB MC – Cam – Bap 10 11,3 B tin c y 95% khối 51 ng nấm PHỤ CHƢƠNG C: Thành ph i h ng m t số hất i h ng g o l c, g o trắng bắp (µg/g) Thành ph n dinh ng G ol c G o trắng Bắp Carbohydrate 23000 28600 74000 Protein 7,1 – 13,3 5,6 – 13,3 4500 Chất béo 1,8 – 0,2 – 1,1 2170 - 4430 Chấ 0,2 – 2,6 0,1 – 0,6 2100 - 26770 Vitamin A 0,1 0,09 Vitamin B1 2,1 – 4,5 – 1,8 Vitamin B2 0,4 – 0,9 0,1 – 0,4 0,55 Vitamin B12 0,005 0,0016 Vitamin E 13 0,77 Biotin 0,06 – 0,13 0,006 – 0,09 Inositon 1194 – 1220 100 – 125 Calcium 65 – 400 46 – 385 70 Chlor 203 – 275 163 – 372 Iron – 54 – 27 27 Manganese 13 – 42 10 – 33 Phosphorus 2500 – 4400 420 – 860 3000 Potassium 1200 – 30400 140 – 1200 270 Bảng C.1 Thành ph 52 Sodium 31 – 176 22 – 85 350 Zinc 15 – 22 – 21 (nguồn: Sule Enyisi I et al., 2014; Wu et al., 2013) i h Bảng C.2 Thành ph Thành ph i h ng ng cám g o bắp (µg/g) Cám g o Bắp Carbohydrate 494000 74000 Protein 165000 4500 Chất béo 213000 2170 - 4430 Chấ 114000 2100 - 26770 Vitamin A 0,09 Vitamin B1 30 Vitamin B2 0,55 Biotin 55000 Inositon 9820 Calcium 800 70 Iron 110 27 Manganese 286 Phosphorus 21000 3000 Potassium 19000 270 Sodium 203 350 Zinc 64 (nguồn: CRTRI, 1995 Wu et al.,2013) 53 PHỤ CHƢƠNG D: Trình t nấm cổ linh chi CGRAAAGGGGGTTTTTTGTTGATGGGTGKACTGGCTTTCCAGSAGGGCCGCCCTG CTCTCCATCTACACCTGKGCACTTACTGTGGGTTTACGGGTCGTGAAACGGGCTC GYTYKTCGGGCTTGTYGAGCGCACTTGTTGCCTGCGTTTATCACAAACTCTRTAA AGTATCATAATGTGTATTGCGATGTAACGCATCTATATACAACTTTCAGCAACGG ATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCACGAAATGCGATAAGTAATGTGA ATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTA TTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAATCTACAAACTTCTT ATGGGGCTTGTAGGCTTGGACTTGGAGGCTTGTCGGTCCYTTTACAAGGTCGGCT CCYCTTAAATGCATTAGCTTGGTTCCTTGCGGATCGGCTTGTCGGTGTGATAATGT CTACGCCGCGACCGTGAAGCGTGTTTGGGCGAGCTTCTAATCGTCTCGTTACAGA GACAACCTTTATGACCTCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCCGCTGAACTTA AGCATATCATAAGCGGAGRAGAAAAT 54 ... ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP-TNTN ĐỊNH DANH VÀ BƯỚC ĐẦU NUÔI TRỒNG NẤM CỔ LINH CHI Ở VÙNG BẢY NÚI TỈNH AN GIANG HỒ THỊ THU BA An Giang, Tháng – 2019 Đề tài nghiên cứu khoa học “Định danh bước... Thời gian địa điểm 18 Th i gian: từ tháng 05 Đ i 19 n tháng 05 : Đ nh danh phân l p t i khu thí nghi g Đ i học An Giang 3.1.2 Nguyên vật liệu Mẫu nấm cổ linh chi h c từ vùng Bảy núi, An Giang 3.1.3... GenBank DNA th i gian nhanh Hình Hình dạng bào tử sợi nấm cổ linh chi X100 Hình Sợi nấm cổ linh chi nhuộm với xanh Methylen vật kính X40 Định danh thơng qua hình thái Mơ tả v nấm cổ linh chi