Định danh xây dựng qui trình nhân giống và nuôi trồng hai loài bình vôi stephania sp đặc thù của vùng núi an giang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN ĐỊNH DANH, XÂY DỰNG QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG VÀ NI TRỒNG HAI LỒI BÌNH VƠI (Stephania sp.) ĐẶC THÙ CỦA VÙNG NÚI AN GIANG NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN AN GIANG, THÁNG 12 – NĂM 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA: NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN ĐỊNH DANH, XÂY DỰNG QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG VÀ NI TRỒNG HAI LỒI BÌNH VƠI (Stephania sp.) ĐẶC THÙ CỦA VÙNG NÚI AN GIANG NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN AN GIANG, THÁNG 12 – NĂM 2017 CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG Đề tài nghiên cứu khoa học “Định danh, xây dựng qui trình nhân giống ni trồng hai lồi Bình vơi (Stephania sp.) đặc thù vùng núi An Giang”, tác giả Nguyễn Thị Mỹ Duyên, công tác Khoa Nông nghiệp – Tài nguyên Thiên nhiên thực Tác giả báo cáo kết nghiên cứu đƣợc Hội đồng Khoa học Đào tạo Trƣờng Đại học An Giang thông qua ngày 15/7/2017 Thư ký ………………………………… Phản biện Phản biện ……………………… ……………………… Chủ tịch hội đồng …………………………………… i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn BGH Trƣờng Đại học An Giang, Hội đồng khoa học Trƣờng, Phòng QLKH & HTQT, Phòng kế hoạch & Tài vụ Trƣờng Đại học An Giang Ban chủ nhiệm Khoa Nông Nghiệp & TNTN hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Chi Cục Kiểm Lâm tỉnh An Giang hỗ trợ cung cấp mẫu Bình Vơi nhƣ nhận chuyển giao sản phẩm đề tài Chân thành cám ơn Tiến Sĩ Trần Nghĩa Khang hỗ trợ phần giải trình tự gen Và xin cám ơn chân thành đến em sinh viên lớp DH11SH Trƣờng Đại học An Giang cộng tác giúp hồn thành cơng trình nghiên cứu Rất cảm ơn Quý Thầy, Cô đồng nghiệp Khoa Nông Nghiệp & TNTN tận tình chia hỗ trợ giúp tơi hoàn thành đề tài nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! ii TÓM LƯỢC Đề tài nghiên cứu “Định danh, xây dựng qui trình nhân giống ni trồng hai lồi Bình vơi (Stephania sp.) đặc thù vùng núi An Giang” đƣợc thực gồm hai phần Phần thứ nhất, xác định hai lồi Bình vơi đặc thù An Giang phƣơng pháp đánh giá dựa hình thái kết hợp với việc giải trình tự đoạn gen vùng ITS Phần thứ hai, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống, ni trồng hai lồi Bình vơi để hƣớng dẫn cho ngƣời dân vùng núi biết cách trồng trọt khai thác hợp lý Với phƣơng pháp đánh giá kết hợp hình thái kiểu gen (dựa trình tự đoạn gen vùng ITS) xác định đƣợc lồi Bình vơi diện An Giang Stephania kwangsiensis Bình vơi Stephania cephalantha thuộc họ Tiết dê (Menispemaceae) Qua thí nghiệm khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến nẩy mầm hạt Bình vơi cho thấy tỷ lệ hạt nẩy mầm hạt Bình vơi Stephania kwangsiensis tốt sử dụng hạt tƣơi sau tuần gieo đạt 43,33% Đồng thời, Bình vơi Stephania kwangsiensis (nhân giống từ gieo hạt) phát triển tốt đất cát bổ sung phân hữu cơ, bổ sung phân HCSH Bình Điền cho trọng lƣợng củ đạt đến 205,56 g Bên cạnh đó, tiến hành giâm cành trồng lồi Bình vơi thu thập đƣợc nhận thấy Bình vơi (Stephania kwangsiensis) có sức sống mạnh, đạt tỷ lệ sống cao (78%) phát triển tốt lồi Bình vơi (Stephania cephalantha) sau tuần giâm cành Khơng có khác biệt giá thể nhƣ loại đoạn thân cành giâm lồi bình vơi Khi trồng lồi Bình vơi (nhân giống từ giâm cành) ngồi vƣờn cho thấy Bình vơi Bình vơi sinh trƣởng tốt thời điểm tháng sau trồng Sau đến 12 tháng sau trồng, Bình vơi có tỷ lệ chết thấp, phát triển tốt, củ to Bình vơi So sánh bình vơi BV1 (Stephania kwangsiensis) đƣợc nhân giống từ hạt từ giâm cành sau 12 tháng trồng, nhân giống từ hạt có sức sống tốt cho suất cao so với từ giâm cành Từ khóa: Bình vơi, định danh, giâm cành, gieo hạt, kỹ thuật PCR, trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer) iii ABSTRACT The research “Indentification, establishment of the protocol for propagation and planting of two specific Stephania sp in An Giang” was implemented include two parts The first, species identification of Stephania in An Giang by morphological evaluation in combination with the ITS gene sequencing The second, researching propagation and plating techniques of two Stephania sp so that guide the farmers how to cultivate and exploit rationally The species identification based on morphology characters and ITS genotype combinations have determined two species of the genus Stephania in An Giang were Stephania kwangsiensis and Stephania cephalantha, the members of the family Menispemaceae Experiments were conducted to survey some factors that affect on germination of Stephania seed showed that the germination rate of Stephania kwangsiensis seed was the best when using fresh seeds, achieved 43,33% after weeks sowing In addition, seedlings of Stephania kwangsiensis was propagated by seed which grew well on sandy soil adding organic fertilizer, supplemented fertilizer HCSH Binh Dien gave the tuber weight to 205,56 g Besides that, the cutting and planting of Stephania kwangsiensis and Stephania cephalantha were collected, they pointed out that cuttings of Stephania kwangsiensis have strong vitality, high survival percentage (78%) and better development than Stephania cephalantha after weeks cuttings There are no differences in planting substrate and the position of the branch cuttings of two species Stephania When growing two species Stephania (propagation from branch cuttings) in the garden, both Stephania kwangsiensis and Stephania cephalantha grow well at months after planting Then up to 12 months after planting, Stephania kwangsiensis has a low mortality rate, grows well, bulbs bigger than Stephania cephalantha Comparison between BV1 (Stephania kwangsiensis) was propagated from seeds and branch cuttings after 12 months of planting, the seedlings from seed have good vitality and higher productivity Keywords: Stephania, identification, cuttings, sowing, Polymerase Chain Reaction, ITS ((Internal Transcribed Spacer) iv LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu cơng trình nghiên cứu có xuất xứ rõ ràng Những kết luận khoa học cơng trình nghiên cứu chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Long Xun, ngày 27 tháng 12 năm 2017 Người thực Nguyễn Thị Mỹ Duyên v MỤC LỤC Trang CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG i LỜI CẢM ƠN ii TÓM LƢỢC iii ABSTRACT iv LỜI CAM KẾT v MỤC LỤC vi DANH SÁCH BẢNG ix DANH SÁCH HÌNH xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii Chƣơng 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cần thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Đối tƣợng nghiên cứu 1.4 Nội dung nghiên cứu 1.5 Những đóng góp đề tài 1.5.1 Đóng góp mặt khoa học 1.5.2 Đóng góp cơng tác đào tạo 1.5.3 Đóng góp phát triển kinh tế xã hội Chƣơng 2: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Giới thiệu Bình vơi 2.1.1 Phân loại phân bố 2.1.2 Các lồi Bình vơi 2.1.3 Bình vơi - thực vật rừng nguy cấp, q 2.1.4 Đặc tính thực vật 2.1.5 Thành phần hóa học giá trị sử dụng y học 14 2.1.6 Kỹ thuật trồng chăm sóc Bình vơi 15 2.2 Ứng dụng PCR (Polymerase chain reaction) kỹ thuật ITS (Internal transcribed spacer) xác định đa dạng di truyền định danh loài 16 2.2.1 Phƣơng pháp PCR 16 vi 2.2.2 Các thành phần nhân tố ảnh hƣởng phản ứng PCR 17 2.2.3 Phƣơng pháp định danh loài kỹ thuật ITS 18 2.2.4 Phƣơng pháp giải trình tự DNA 19 2.3 Kỹ thuật nhân giống trồng 20 2.3.1 Phƣơng pháp nhân giống hạt 20 2.3.2 Phƣơng pháp giâm cành 22 2.4 Tình hình nghiên cứu nƣớc 23 2.4.1 Trên giới 23 2.4.2 Ở Việt Nam 25 Chƣơng 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Thời gian địa điểm 28 3.2 Vật liệu phƣơng tiện nghiên cứu 28 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 28 3.2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 28 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 3.3.1 Định danh hai lồi Bình vôi nghiên cứu 30 3.3.2 Bố trí thí nghiệm nhân giống trồng Bình vơi 35 3.4 Phân tích liệu 42 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Định danh loài 43 4.1.1 Định danh lồi dựa hình thái 43 4.1.2 Định danh loài phƣơng pháp sinh học phân tử - Kỹ thuật ITS 45 4.2 Bố trí thí nghiệm nhân giống trồng Bình vơi 49 4.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nảy mầm hạt Bình vơi Stephania kwangsiensis sau thu hoạch 49 4.2.2 Thí nghiệm 2: Sự sinh trƣởng phát triển Bình vơi Stephania kwangsiensis nhân giống từ hạt nghiệm thức phân hữu khác 50 4.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả sống cành giâm lồi Bình vơi thí nghiệm 53 4.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả sinh trƣởng phát triển lồi Bình vơi đƣợc nhân giống từ đoạn thân 57 vii 4.2.5 So sánh sinh trƣởng phát triển Bình vơi (Stephania kwangsiensis) đƣợc nhân giống giống từ hạt cành giâm 61 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 63 5.1 Kết luận 63 5.2 Khyến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 71 viii Đoạn cành giâm Bình vơi - Từ thân, mang – mắt mầm - Giá thể: đất cát + tro trấu (tỉ lệ 1:1) Trồng từ giâm cành vƣờn (2 tháng tuổi) - Đất cát + phân HCVS ANVI (250 gram/gốc) Cây Bình vơi tạo củ - tháng sau trồng Thu hoạch củ (12 tháng sau trồng, kích thƣớc củ đạt tối đa 10,50 x 4,30 cm) Hình 21 Quy trình trồng Bình vơi Stephania kwangsiensis từ đoạn thân 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Agbo, C.U., & Obi, I.U (2007) Variability in propagation potentials of stem cuttings of different physiological ages of Gongronema latifolia Benth World Journal of Agricultural Sciences, 3(5), 576-581 Antony, V.C., Pridgeon, A.M, Albert, V.A, & Chase, M.W (1997) Phylogenetics of the slipper orchids (Cypripedioideae, Orchidaceae): Nuclear rDNA ITS sequences Plant Systematics and Evolution, Vol.208, 197-223 Aun Chea, Sotheara Hout, Sok-Siya Bun, Nino Tabatadze, Monique Gasquet, Nadine Azas, Riad Elias, & Guy Balansard (2007) Antimalarial activity of alkaloids isolated from Stephania rotunda Journal of Ethnopharmacology (J Ethnopharmacol), 112 (1), 132-137 Baldwin, B.G (1992) Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: An example from the Compositaogy Molecular Phylogenetics and Evolution Vol 1, 3-16 Baldwin, B.G., Michael J Sanderson, J Mark Porter, Martin F Wojciechowski, Christopher S Campbell and Michael J Donoghue (1995) The its Region of Nuclear Ribosomal DNA: A Valuable Source of Evidence on Angiosperm Phylogeny Annals of the Missouri Botanical Garden, Vol 82, No (1995), 247-277 Bộ Khoa học Công nghệ, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (2007) Sách đỏ Việt Nam, Phần II- Thực vật Hà Nội: Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ Bruns T.D., White T.J., & Taylor J.W (1991) Fungal molecular systematics Annu Rev ecol Syst., 22, 525-564 Bùi Chí Bửu, & Nguyễn Thị Lang (2008) Di truyền phân tử Hồ Chí Minh: Nhà xuất Nông nghiệp Chao-Lin Kuo, Jun-Yi Chang, Hung-Chi Chang, Sushim Kumar Gupta, Hsiao-Sung Chan, Emily Chin-Fun Chen, & Hsin-Sheng Tsay (2011) In vitro production of benzylisoquinoline from Stephania tetrandra through callus culture under the influence of different additives Botanical Studies, 52(2011), 285-294 Chi Bình vơi (k.n) Truy https://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_B%C3%ACnh_v%C3%B4i cập từ Chính phủ nƣớc Cộng hịa xã hội chủ nghĩa Việt Nam (2006) Nghiêm cấm, hạn chế khai thác sử dụng loài động thực vật hoang dã Nghị định 32/2006/CPNĐ, ngày 30 tháng 03 năm 2006 Chính phủ nƣớc Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam (2007) Chương trình nghiên cứu khoa học cơng nghệ trọng điểm quốc gia phát triển cơng nghiệp hóa dược đến năm 2020 Quyết định số 61/2007/QĐ-TTg, ngày 07 tháng 05 năm 2007 Chuan-ming FC, Yan Qin, Feng Luan Tang, Yun Ping Shi, Zhi Guo Zhao, & Ning Zhen Huang (2012) Genetic diversity of Stephanie kwangsiensis H.S Lo and Salvia prionitis Hance after transplanted and micropropagated Advanced materials research, Vols 518-523, pp 5460-5467 66 Dƣơng Thị Vĩnh Thạch (k.n) Các yếu tố liên quan đến nảy mầm hạt (k.n) Truy cập từ http://timtailieu.vn/tai-lieu/cac-yeu-to-lien-quan-den-su-nay-mamcua-hat-25746/ Đỗ Tất Lợi (2009) Những thuốc vị thuốc Việt Nam Hà Nội: Nhà xuất Y học, 428-472 Hoàng Văn Thủy, Nguyễn Quốc Huy, & Phạm Thanh Kỳ (2016) Stephanin crebanin phân lập từ củ loài Stephania venosa (Bl.) Spreng thu hái Bà RịaVũng Tàu Tạp chí Dược học, 477(2016), 40-42 Huỳnh Đào Lân (2005) Điều tra đánh giá vùng nguyên liệu Bình vơi đề xuất cơng nghệ chiết xuất chất rotudin làm thuốc an thần gây ngủ Nghệ An Kỷ yếu kết nghiên cứu phát triển KH-CN Nghệ An 2001 – 2005, 214-216 Huỳnh Thị Thu Huệ, Đặng Văn Hạnh, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, & Lê Trần Bình (2000) Tách dịng gen 18s rRNA từ Bình vơi (Stephania) phục vụ cho nghiên cứu phân loại học phân tử Những vấn đề nghiên cứu sinh học: Báo cáo Khoa học Hội nghị Sinh học quốc gia, trang 94-97 lhami Gỹlỗin, Riad Elias, Akỗahan Gepdiremen, Aun Chea, & Fevzi Topal (2010) Antioxidant activity of bisbenzylisoquinoline alkaloids from Stephania rotunda: cepharanthine and fangchinoline Journal of enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 25(1), 44-53 Khuất Hữu Thanh (2006) Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen Hà Nội: Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 141-146 Kim, S.K., Crawford, D.J., & Esselman, E J (1999) ITS sequences and phylogenetics relationships in Bidens and Coreopsis (Asteraceae) Syst Bot., 24, 480-491 Lã Đình Mỡi, Ninh Khắc Bản, Đặng Thị An, Vũ Thị Mỵ, & Phạm Hoàng Ngọc (2003) Một vài kết nghiên cứu Bình vơi (Stephania) Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống: Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, nghiên cứu sinh học, nông nghiệp, y học, trang 685-688 Lã Đình Mỡi, Trần Minh Hợi, Dƣơng Đức Huyền, Trần Huy Thái, & Ninh Khắc Bản (2005) Tài nguyên thực vật Việt Nam - Những chứa hợp chất có hoạt chất sinh học Hà Nội: Nhà xuất Nông nghiệp Le, T.H., Blair, D., & McManus, D.P (2002) Mitochondrial genomes of parasitic flatworms, Trends Parasitol, 18, 206-213 Lê Minh Hà (2016) Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất rotundin Bình vơi trồng qui mơ sản xuất thử, áp dụng tỉnh Thái Bình Truy cập từ http://www.vast.ac.vn/cac-de-tai-nghien-cuu-khoa-hoc-vaphat-trien-cong-nghe?option=com_detai&view=detai&id=1066 Lê Thị Tình, Dƣơng Danh Cơng, & Phạm Hữu Hân (2010) Giáo trình mơ đun sản xuất giống hom cành Truy cập từ http://nongnghiep.vn/Upload/File/2013/6/24/goc_GT%20mo%20dun%2003%2 0-%20San%20xuat%20cay%20giong%20%20bang%20hom.pdf Lê Văn Hiểu (2006) Khảo sát đa dạng di truyền nấm Rhizoctonia solani gây bệnh vải Việt Nam Truy cập từ sở liệu Trƣờng Đại học Nông Lâm, Hồ Chí Minh, Việt Nam 67 Mã Chí Thành, & Trần Hùng (2011) Phân lập hai protoberberin alkaloid từ lồi Bình vơi Cam bốt Stephania cambodia Gagnep Menispermaceae Tạp chí Y học, Tp Hồ Chí Minh, Tập 15-số Ngô Quang Đại (1999) Sản xuất thuốc giảm đau từ củ Bình vơi Hà nội: Viện Hố học Cơng nghiệp Hà nội Ngô Thu Vân, Đặng Thị Lệ Thủy, & Trần Hùng (1988) Nghiên cứu bước đầu thành phần alkaloid lồi Bình vơi mọc Lâm Đồng Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu Y Dƣợc, Nhà xuất Y học, trang 97-99 Nguyễn Dung (2012) Bình vơi Truy cập từ http://duoclieuvn.blogspot.com/2012/03/binh-voi-stephania-spp-ho-tiet-de.html Nguyễn Đức Thành (2014) Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật Tạp chí Sinh học, 36(3), 265-294 Nguyễn Hồng Quan, Lê Thị Tình, & Phạm Hữu Hân (2010) Giáo trình mơ đun sản xuất giống từ hạt Truy cập từ http://nongnghiep.vn/Upload/File/2013/6/24/goc_GT%20mo%20dun%2002%2 0-%20San%20xuat%20cay%20giong%20bang%20hat.pdf Nguyễn Quốc Huy (2014) Nghiên cứu thực vật, thành phần hóa học, số tác dụng sinh học số loài thuộc chi Stephania Lour Việt Nam (Bản tóm tắt) Bản tóm tắt đƣợc truy cập từ http://www.hup.edu.vn/cpbdv/psdh/noidung/Lists/NghienCuuSinh/View_Detai l.aspx?ItemID=15 Nguyễn Quốc Huy, & Phạm Thanh Kỳ (2009) L-tetrahydropalmatin, Oxostephanin Dehydrocrebanin phân lập từ củ Bình vơi Stephania dielsiana Y.C.Wu Tạp chí Dược liệu, số 14(1), tr 23-27 Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh Kỳ, & Trần Văn Ơn (2009) Đặc điểm thực vật lồi Bình vơi thuộc chi Stephania Lour thu hái Ba Vì (Hà Nội) Sapa (Lào Cai), Tạp chí Dược học, 404(49), 33-38 Nguyễn Thị Lang, & Bùi Chí Bửu (2005) Sinh học phân tử: Giới thiệu phương pháp ứng dụng Hồ Chí Minh: Nhà xuất Nơng nghiệp Nguyễn Thị Lang, & Bùi Chí Bửu (2012) Cơng nghệ gen Hồ Chí Minh: Nhà xuất Nơng nghiệp Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2010) Nghiên cứu đa dạng sinh học giống hoa lan (Orchids) rừng có giá trị tỉnh An Giang phương pháp ITS (internal transcribed spacer) Luận văn Thạc sĩ Công nghệ Sinh học – Trƣờng ĐH Cần Thơ Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2014) Sự ảnh hƣởng auxin cytokinin đến khả tạo nhân chồi bình vơi (Stephania rotunda Lour.) Tạp chí Khoa học Trường Đại học An Giang, 2(1), 48-54 Nguyễn Thị Mỹ Duyên, Trƣơng Trọng Ngôn, & Trần Nhân Dũng (2010) Nghiên cứu phả hệ giống loài hoa lan (Orchidaceae) dựa phân tích trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (3A): 973979 68 Nguyễn Thị Thanh Nga (2012) Đánh giá đa dạng di truyền số dược liệu Việt nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) kỹ thuật DNA mã vạch Luận văn Thạc sĩ ngành Di truyền học - Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên Nguyễn Tiến Quảng (2015) Chi Bình vơi - Stephania Truy cập từ http://faunaandfloraofvietnam.blogspot.com/2015/11/chi-binh-voistephania.html Nguyễn Tiến Vững (2000) Nghiên cứu thực vật, hóa học tác dụng sinh học số loài thuộc chi Stephania Lour Việt Nam Truy cập từ http://luanan.nlv.gov.vn/luanan?a=d&d=TTbFabDAcxdG2000.1.142# Phạm Thanh Kỳ, Vũ Xuân Giang, & Nguyễn Tiến Vững (2007) Nghiên cứu alkaloid lồi Bình vôi Stephania viridiflavens H S Lo et M Yang Tạp chí Thơng tin y dược, 4(2007), 31-35 Phạm Thị Kim, & Bùi Minh Đức (1983) Dùng Bình vơi điều trị bệnh Hà Nội: Nhà xuất bản: Học viện Quân y Hà Nội Raucher, J.T., Doyle, J.J., & Brown, H.D (2002) Internal transcribed spacer repeatspecific primers and the analysis of hybridization in the Glycine tomentella (Leguminosae) polyploid complex Mol Ecol., 11, 2691-2702 Ritland, C.E., Ritland, R.K., & Straus, N.A (1993) Variation in the ribosomal internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) among eight taxa of the Mimulus guttatus species complex Mo.l Biol Evol., 10, 1273-1288 Rogers, S.O., & Bendich, A.J.B (1988) Extraction of DNA from plant tissues Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, A6:l-10 Semwal Deepak Kumar, & Rawat Usha (2009) Antimicrobial hasubanalactam alkaloid from Stephania glabra Planta Med., 75, pp 378-380 Senthamarai, R., Ismail, A.M., Shri Vijaya Kiurbha T., & Balasubramanian, P (2012) Pharmacognostical and phytochemical studies on leaves of Stephania japonica Linn Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 4(3):14571464 Sok-Siya Bun, Michele Laget, Aun Chea, Hot Bun, Evelyne Ollivier, & Riad Elias (2009) Cytotoxic activity of alkaloids isolated from Stephania rotunda in vitro cytotoxic activity of cepharanthine Phytother Res., 23, pp 587-590 Stephania kwangsiensis H S Lo (k.n) Truy http://duoclieutuelinh.vn/stephania-kwangsiensis-h-s-lo.html Thái cập từ Nguyễn Ngọc (2012) Bình vơi Truy cập từ http://tieuluanduoclieu.blogspot.com/2012/03/binh-voi-stephania-spp-ho-tietde_7.html Trần Hùng (1989) Bước đầu nghiên cứu lồi Bình vơi tỉnh phía Nam Bày viết đƣợc trình bày Hội thảo quốc gia thuốc, lần II, Hồ Chí Minh, Việt Nam Trần Trọng Biên, Nguyễn Quốc Huy, & Nguyễn Văn Hân (2016) Cải tiến phƣơng pháp chiết xuất rotundin từ củ Bình vơi Stephania brachyandra Diels Tạp chí Dược học, 488(2016), 26-30 Trịnh Đình Đạt (2006) Cơng nghệ Sinh học - Công nghệ di truyền (Tập 4) Hà Nội: Nhà xuất Giáo dục 69 Trịnh Ngọc Nam, & Nguyễn Văn Vinh (2011) Nghiên cứu nhân giống in vitro khảo sát hợp chất alkaloid rotundine từ Bình vơi (Stephania rotunda Lour) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 49 (4), 51-58 Thuy, T.T, Franke, K., Porzel, A., Wessjohann, L., & Tran Van Sung (2006) Quaternary protoberberine alkaloids from Stephania rotunda Journal of Chemistry, Vol 44 (2), 259 – 264 Thuy, T.T., Porzel, A., Franke, K., Wessjohann, L., & Sung, T.V (2005) Isoquinolone and protoberberine alkaloids from Stephania rotunda Pharmazie, 60, 701-705 Vander Stappen, J., Van Campenhout, S., Gama Lopez, S., & Volcgert, G (1998) Sequencing of the internal transcribed spacer region ITS1 as a molecular tool in detectingvariation in the Stylosanthes guianensis species complex Theoretical Applied Genetics 96: 869-877 Viện dƣợc liệu (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (Tập 1,2) Hà Nội: Nhà xuất Khọc học Kỹ thuật Viện dƣợc liệu (2005) Bảo tồn nhân trồng 65 lồi thuốc q, Sinh học Việt Nam Truy cập từ http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=News&file=article&si d=296 Võ Văn Chi (1999) Cây thuốc An Giang Ủy ban Khoa học- Kỹ thuật An Giang Võ Văn Chi (2004) Từ điển thực vật thơng dụng (Tập 2) Hồ Chí Minh: Nhà xuất Y học Võ Văn Chi (2012) Từ điển thuốc Việt Nam (Tập 1) Hà nội: Nhà xuất Y học Vũ Mạnh Hải (2006) Kỹ thuật vườn ươm phương pháp nhân giống ăn Truy cập từ http://www.cuctrongtrot.gov.vn/DetailInfomation.aspx?InfomationID=IN00002 170 Wei Wang, Heng-Chang Wang, & Zhi-Duan Chen (2007) Phylogeny and morphological evolution of tribe Menispermeae (Menispermaceae) inferred from chloroplast and nuclear sequences Perspectives in Plant Ecology, Evolution and Systematics, (2007), 141-154 White, T.J., Burns, T., Lee, S., & Taylor, J (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky J.J, WhiteT.J eds PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications, New York Academic press, 315-322 Zi-Gang Zhang, Ai-Ping meng, Heng-Chang Wang, & Jian-Qiang (2013) A new species of Stephania (Menispermaceae) from South Guangxi, China A Journal for Botanical Nomenclature, 22(3), 379-382 Yao, H., Song, J., Liu, C., Luo, K et al (2010) Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals PLoS ONE, 5(10): e13102 doi:10.1371/journal.pone.0013102 70 PHỤ LỤC PHẦN I: CHUYỂN GIAO VÀ GÂY TRỒNG CÂY BÌNH VƠI (NGẢI TƯỢNG) Từ nghiên cứu tạo số lượng lớn giống Bình Vơi để chuyển giao cho người dân địa phương gây trồng phát triển giống trồng Từ năm 2015 đến nay, Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường Đại học An Giang phối hợp với Chi Cục Kiểm Lâm An Giang chuyển giao giống Bình Vơi trồng mơ hình trồng dược liệu xã Lê Trì, huyện Tri Tơn xã Vọng Đông, huyện Thoại Sơn Bước đầu người dân chưa quen, đến phát triển tốt bắt đầu có hoa, kết hạt Hình pc1 Cây Bình Vơi gây trồng vườn dược liệu xã Vọng Đông, huyện Thoại Sơn, An Giang 71 PHẦN II: Các mẫu PCR sau tinh đưa vào máy giải trình tự ABI 3130, thu trình tự nucleotide lồi Bình Vơi Các chuỗi trình tự phân tích phần mềm Bio Edit Version 7.0 Hình pc2 Kết giải trình tự xem chương trình BioEdit 72 PHẦN III: BỐ TRÍ CÁC THÍ NGHIỆM Thí nghiệm 1: Khảo sát nảy mầm hạt Bình vơi Stephania kwangsiensis sau thu hoạch Bảng pc1: Phân tích ANOVA tỷ lệ nảy mầm hạt Bình vơi tuần sau gieo Nguồn biến động SS df MS F tính P Nghiệm thức 1497,0245 374,2561 3,73* 0,0416 Sai số 1004,1149 10 100,4115 Tổng 2501,1390 14 CV = 51,33% *: khác biệt ý nghĩa mức 5% Bảng pc2: Phân tích ANOVA tỷ lệ nảy mầm hạt Bình vơi tuần sau gieo Nguồn biến động SS df MS F tính P Nghiệm thức 2202,6154 550,6539 5,27* 0,0151 Sai số 1044,2971 10 104,4297 Tổng 3246,9125 14 CV = 43,73% *: khác biệt ý nghĩa mức 5% Thí nghiệm 2: Sự sinh trưởng phát triển Bình vơi Stephania kwangsiensis nhân giống từ hạt nghiệm thức phân hữu khác Bảng pc3: Phân tích ANOVA chiều cao Bình vơi tháng sau trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Nghiệm thức 32,1493 10,7164 2,52ns 0,0971 Lặp lại 28,5061 5,7012 1,34ns 0,3000 Sai số 63,7144 15 4,2476 Tổng 124,3698 23 CV = 30,58% ns: khác biệt khơng ý nghĩa Bảng pc4: Phân tích ANOVA chiều cao Bình vơi tháng sau trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Nghiệm thức 80711,1379 26903,7126 6,77** 0,0042 Lặp lại 12253,3875 2450,6775 0,62ns 0,6892 Sai số 59617,2158 15 3974,4811 Tổng 152581,7413 23 CV = 68,52% 73 **: khác biệt ý nghĩa mức 1% ns: khác biệt không ý nghĩa Bảng pc5: Phân tích ANOVA chiều cao Bình vơi tháng sau trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Nghiệm thức 50263,0113 16754,3371 3,85* 0,0317 Lặp lại 25772,6896 5154,5379 1,18ns 0,3626 Sai số 65293,0938 15 4352,8729 Tổng 141328,7946 23 CV = 50,09% *: khác biệt ý nghĩa mức 5% ns: khác biệt không ý nghĩa Bảng pc6: Phân tích ANOVA chiều cao Bình vơi 12 tháng sau trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Nghiệm thức 28428,9336 9476,3112 0,76ns 0,5358 Lặp lại 162290,4297 32458,0859 2,59ns 0,0700 Sai số 187938,8057 15 12529,2537 Tổng 378658,1691 23 CV = 36,86% ns: khác biệt khơng ý nghĩa Bảng pc7: Phân tích ANOVA số Bình vơi tháng sau trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Nghiệm thức 166,3333 55,4444 7,86** 0,0022 Lặp lại 34,2083 6,8417 0,97ns 0,4669 Sai số 105,7917 15 7,0528 Tổng 306,3333 23 CV = 32,85% **: khác biệt ý nghĩa mức 1% ns: khác biệt khơng ý nghĩa Bảng pc8: Phân tích ANOVA số Bình vơi tháng sau trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Nghiệm thức 1336,7083 445,5694 6,32** 0,0055 Lặp lại 170,9583 34,1917 0,49ns 0,7820 Sai số 1056,7917 15 70,4528 Tổng 2564,4583 23 CV = 37,79% 74 Khác biệt ý nghĩa mức 1% ns: khác biệt khơng ý nghĩa Bảng pc9: Phân tích ANOVA dài củ Bình vơi 12 tháng sau trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Nghiệm thức 136,5078 45,5026 1,67ns 0,2149 Lặp lại 71,1068 14,2214 0,52ns 0,7550 Sai số 407,5078 15 27,1672 Tổng 615,1224 23 CV = 46,12% ns: khác biệt không ý nghĩa Bảng pc10: Phân tích ANOVA rộng củ Bình vơi 12 tháng sau trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Nghiệm thức 14,0286 4,6762 3,83* 0,0321 Lặp lại 9,9193 1,9839 1,63ns 0,2133 Sai số 18,2995 15 1,2200 Tổng 42,2474 23 CV = 17,82% *: khác biệt ý nghĩa mức 5% ns: khác biệt không ý nghĩa Bảng pc11: Phân tích ANOVA trọng lượng củ Bình vơi Nguồn biến động SS df MS F tính P Nghiệm thức 23948,9475 7982,9825 1,29ns 0,3155 Lặp lại 21578,8846 4315,7769 0,69ns 0,6354 Sai số 93161,0813 15 6210,7388 Tổng 138688,9133 23 CV = 44,96% ns: khác biệt không ý nghĩa Bảng pc12: Số Bình vơi hình thành hoa đực hoa Thời gian hoa (tháng) Nghiệm thức 10 B1 1M 1M 1M 3M 1M 1M + 1M + 1M + 1M + B2 + 1FM 1FM 1FM 1FM 1FM 1M 1M + 1M + 1M + 1M + B3 1FM 1FM 1FM 1FM B4 FM FM 3M + 3M + 3M + 5M + Trung bình 1M 75 Tổng 12 3M 2M + M + 1FM FM 2M + M + 1FM FM FM 4M + M + + 2FM 2FM 4FM 4FM 4FM 2FM Tỷ lệ hoa đực, hoa FM M: 14,58% FM: 8,33% Ghi chú: M: hoa đực; FM: hoa Thí nghiệm 3: Khảo sát khả sống cành giâm loại Bình vơi thí nghiệm Bảng pc13: Phân tích ANOVA tỷ lệ sống cành giâm Bình vơi sau tuần Nguồn biến động SS df MS F tính P Bình vơi (A) 4730,1103 4730,1103 18,86** 0,0001 Giá thể (B) 238,1649 79,3883 0,32ns 0,8133 AxB 583,1786 194,3929 0,78ns 0,5165 Sai số 8024,2929 32 250,7592 Tổng 13575,7468 39 CV = 26,05% **: khác biệt ý nghĩa mức 1% ns: khác biệt không ý nghĩa Bảng pc14: Phân tích ANOVA tỷ lệ sống cành giâm Bình vơi sau tuần Nguồn biến động SS df MS F tính P Bình vơi (A) 6681,2609 6681,2609 32,35** < 0001 Giá thể (B) 250,3259 83,4420 0,40ns 0,7511 ns 0,2355 AxB 924,1760 308,0587 Sai số 6608,4926 32 206,5154 Tổng 14464,2554 39 1,49 CV = 26,72% **: khác biệt ý nghĩa mức 1% ns: khác biệt khơng ý nghĩa Bảng pc15: Phân tích ANOVA số chồi trung bình cành giâm sau tuần Nguồn biến động SS df MS F tính ns P Bình vơi (A) 0,6126 0,6126 2,40 0,1312 Giá thể (B) 3,5422 1,1807 4,63** 0,0085 AxB 0,6797 0,2266 Sai số 8,168 32 0,2553 Tổng 13,0024 39 CV = 28,09% **: khác biệt ý nghĩa mức 1% 76 0,89 ns 0,4580 ns: khác biệt không ý nghĩa Bảng pc16: Phân tích ANOVA chiều cao chồi cành giâm sau tuần Nguồn biến động SS df MS F tính P Bình vơi (A) 1020,1 1020,1 6,82* 0,0136 Giá thể (B) 1114,15 371,383 2,48ns 0,0786 AxB 1068,35 356,117 2,38ns 0,0879 Sai số 4786,5 32 149,578 Tổng 7989,1 39 CV = 89,6% *: khác biệt ý nghĩa mức 5% ns: khác biệt không ý nghĩa Bảng pc17: Phân tích ANOVA số cành giâm sau tuần Nguồn biến động SS df MS F tính P Bình vơi (A) 57,6 57,6 16,82** 0,0003 Giá thể (B) 27,7 9,2333 2,70ns 0,0624 ns 0,1028 AxB 23 7,6667 Sai số 109,6 32 3,425 Tổng 217,9 39 2,24 CV = 41,59% **: khác biệt ý nghĩa mức 1% ns: khác biệt khơng ý nghĩa Thí nghiệm 4: Khảo sát khả sinh trưởng phát triển lồi Bình vơi đươc nhân giống từ đoạn thân Bảng pc18: Phân tích ANOVA tỷ lệ chết sau tháng trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Lặp lại 5586,3373 1117,2675 2,03ns 0,1092 Bình vơi (A) 701,5543 701,5543 1,27ns 0,2698 Mức phân bón (B) 543,6353 271,8177 0,49ns 0,6164 AxB 3191,8063 1595,9031 2,90ns 0,0739 Sai số 13773,3116 25 Tổng 23796,6449 35 550,9325 CV = 89,38% ns: khác biệt không ý nghĩa 77 Bảng pc19: Phân tích ANOVA tỷ lệ chết sau 12 tháng trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Lặp lại 7797,3658 1559,4732 1,79ns 0,1510 Bình vơi (A) 5129,8459 5129,8459 5,90* 0,0227 Mức phân bón (B) 3796,0860 1898,0430 2,18ns 0,1339 AxB 3180,5045 1590,2522 1,83ns 0,1816 Sai số 21750,5466 25 Tổng 41654,3487 35 870,0219 CV = 47,80% *: khác biệt ý nghĩa mức 5% ns: khác biệt không ý nghĩa Bảng pc20: Phân tích ANOVA chiều cao Bình vơi tháng sau trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Lặp lại 39,2739 7,8548 0,67ns 0,6498 Bình vơi (A) 7,7885 7,7885 0,66ns 0,4227 Mức phân bón (B) 50,1935 25,0967 2,14ns 0,1386 AxB 7,3746 3,6873 0,31ns 0,7330 Sai số 293,0508 25 11,7220 Tổng 397,6813 35 CV = 90,99% ns: khác biệt không ý nghĩa Bảng pc21: Phân tích ANOVA chiều cao Bình vơi tháng sau trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Lặp lại 921,3501 184,2700 1,07ns 0,3993 Bình vơi (A) 309,4772 309,4772 1,80ns 0,1917 Mức phân bón (B) 2084,9346 1042,4673 6,07** 0,0071 AxB 1038,1145 519,0572 3,02ns 0,0668 Sai số 4296,2015 25 171,8481 Tổng 8650,0780 35 CV = 87,49% **: khác biệt ý nghĩa mức 1% ns: khác biệt không ý nghĩa 78 Bảng pc22: Phân tích ANOVA chiều cao Bình vơi tháng sau trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Lặp lại 35528,8579 7105,7716 0,86ns 0,5242 Bình vơi (A) 85726,96001 85726,9601 10,32** 0,0036 Mức phân bón (B) 82031,9510 41015,9755 4,94* 0,0156 AxB 22464,9218 11232,4609 1,35 0,2769 Sai số 207659,8067 25 Tổng 433412,4974 35 8306,3923 CV = 76,16% **: khác biệt ý nghĩa mức 1% *: khác biệt ý nghĩa mức 5% ns: khác biệt khơng ý nghĩa Bảng pc23: Phân tích ANOVA chiều cao Bình vơi 12 tháng sau trồng Nguồn biến động SS df MS F tính P Lặp lại 48686,1507 9737,2301 0,71ns 0,6234 Bình vơi (A) 66465,3750 66465,3750 4,84ns 0,0397 Mức phân bón (B) 67227,0694 33613,5347 2,45ns 0,1119 AxB 15050,0417 15050,0417 1,10ns 0,3075 Sai số 274525,1893 20 Tổng 436640,8067 29 13726,2595 CV = 57,42% ns: khác biệt không ý nghĩa 79 ... “Định danh, xây dựng qui trình nhân giống ni trồng hai lồi Bình vơi (Stephania sp. ) đặc thù vùng núi An Giang? ?? đƣợc thực gồm hai phần Phần thứ nhất, xác định hai lồi Bình vơi đặc thù An Giang phƣơng... HỌC AN GIANG KHOA: NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN ĐỊNH DANH, XÂY DỰNG QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG VÀ NI TRỒNG HAI LỒI BÌNH VƠI (Stephania sp. ) ĐẶC THÙ CỦA VÙNG NÚI AN GIANG NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN AN. .. Stephania excentrica H.S.Lo Stephania hainanensis H.S.Lo Stephania dielsiana Y.C (Củ dòm) Stephania kwangsiensis H.S.Lo (Bình vơi Quảng Tây) Stephania longa Lour Stephania hernandiifolia Willd Trong