Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng do nấm neoscytalidium dimidiatum trên thanh long của các chủng nấm trichoderma spp nội địa

Đánh giá khả phòng trừ bệnh đốm trắng nấm Neoscytalidium dimidiatum long chủng nấm Trichoderma spp nội địa i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài 2 Mục tiêu nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh đốm trắng long 1.1.1 Giới thiệu long 1.1.2 Bệnh hại thƣờng gặp long 1.2 Những nghiên cứu nấm Neoscytalidium dimidiatum biện pháp phòng trừ 1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc: 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc: 1.2.3 Các biện pháp phòng trừ bệnh đốm trắng long 11 1.3 Giới thiệu nấm Trichoderma spp 13 1.3.1 Phân loại 13 1.3.2 Các chủng nấm Trichoderma spp đƣợc phân lập 14 1.3.3 Đặc điểm hình thái 16 1.3.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 18 1.3.5 Cơ chế kiểm soát sinh học nấm Trichoderma phòng trừ nấm gây bệnh trồng 19 ii 1.3.6 Mối liên hệ khả đối kháng nấm gây bệnh thực vật hoạt động enzyme chitinase Trichoderma spp 24 1.3.7 Một số nghiên cứu ứng dụng nấm Trichoderma spp giới Việt Nam 25 1.4 Thực trạng phế phẩm Thanh long ứng dụng sản xuất phân hữu sinh học 27 1.4.1 Thực trạng nguồn phế phẩm long Việt Nam 27 1.4.2 Sản xuất sử dụng phân compost 28 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Thời gian nghiên cứu 34 2.2 Vật liệu 34 2.2.1.Nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh 34 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 34 2.2.3 Hóa chất 35 2.2.4 Các loại môi trƣờng 35 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 38 2.3.1 Sơ đồ tổng quát nội dung thí nghiệm 38 2.3.2 Phƣơng pháp quan sát hình thái sợi nấm 40 2.3.3 Phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng long 41 2.3.4 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm Trichoderma 42 2.3.5 Khảo sát khả đối kháng chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng long 44 2.3.6 Thử nghiệm khả phòng trừ bệnh đốm trắng long điều kiện chậu 45 iii 2.3.7 Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh chế phẩm Trichoderma đồng ruộng 46 2.3.8 Thử nghiệm ủ phân compost từ cành long nấm Trichoderma 48 2.3.9 Phƣơng pháp xử lý số liệu 52 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 Kết phân lập nấm gây bệnh đốm trắng long 53 3.2 Phân lập chủng Trichoderma spp nội địa để phòng trừ bệnh đốm trắng long 55 3.2.1 Đặc điểm hình thái chủng Trichoderma phân lập 56 3.2.2 Đặc điểm sinh trƣởng 67 3.2.3 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm Trichoderma spp sau ngày nuôi cấy 69 3.3 Khảo sát khả đối kháng chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng long 74 3.4 Kết định danh chủng Trichoderma T3 78 3.5 Kết nhân sinh khối nấm Trichoderma asperellum 79 3.6 Thử nghiệm khả phòng trừ bệnh đốm trắng long chế phẩm nấm Trichoderma asperellum T3 điều kiện chậu 80 3.7 Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh chế phẩm Trichoderma asperellum T3 đồng ruộng 83 3.8 Thử nghiệm ủ phân compost từ cành long chủng nấm Trichoderma asperellum 86 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 90 4.1 Kết luận 90 4.2 Kiến nghị 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO 92 PHỤ LỤC Phụ lục A Bảng số liệu thô A.1 Tốc độ tăng tƣởng chủng Trichoderma spp sau ngày iv A.2 Đƣờng kính trung bình vịng phân giải cellulose (cm) chủng Trichoderma sau ngày A.3 Đƣờng kính trung bình vịng phân giải chitin (cm) chủng Trichoderma sau ngày A.4 Tỉ lệ đối (%) kháng chủng Trichoderma spp sau ngày đối kháng invitro A.5 Tỉ lệ đối (%) kháng chủng Trichoderma spp sau ngày đối kháng invitro A.6 Tỉ lệ đối (%) kháng chủng Trichoderma spp sau ngày đối kháng invitro 10 A.7 Tỉ lệ đối (%) kháng chủng Trichoderma spp sau ngày đối kháng invitro 12 Phụ lục B: Hình ảnh 15 B.1 Hình thái đại thể chủng nấm Trichoderma spp sau ngày nuôi cấy môi trƣờng PDA 15 B.2 Đƣờng kính vịng phân giải cellulose (cm) chitin (cm) chủng Trichoderma sau ngày 17 B.3 Kết khảo sát khả sinh đối kháng chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng long 23 B.4 Lơ thí nghiệm lơ đối chứng thử nghiệm hiệu lực phịng trừ bệnh chế phẩm Trichoderma đồng ruộng 28 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc chủng Trichoderma 14 Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trình làm phân hữu hiếu khí 31 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động chế phẩm Trichederma asperellum 47 Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái chủng nấm phân lập đƣợc nấm Neoscytalidium dimidiatum theo mô tả Crous & Slippes (2006) 54 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái chủng Trichoderma phân lập 56 Bảng 3.3 Đƣờng kính tản nấm Trichodema spp (cm) sau ngày nuôi cấy 67 Bảng 3.4 Đƣờng kính vịng phân giải cellulose chủng Trichodema spp 69 Bảng 3.5 Đƣờng kính vịng phân giải chitin chủng Trichodema spp 71 Bảng 3.6 Tỉ lệ đối kháng (%) chủng Trichoderma spp với nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum 74 Bảng 3.7 Chiều dài khối lƣợng long công thức sau 30 ngày thử nghiệm 82 ản Tình hình ệnh đốm trắng long công thức 86 Bảng 3.9 Kết phân tích hàm lƣợng car on, hàm lƣợng nitơ tổng nguyên liệu an đầu 15 ngày sau ủ 86 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái vi thể Trichoderma harzianum 13 Hình 1.2 Hình thái đại thể số chủng Trichoderma spp 16 Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh khuẩn nấm gây bệnh Rhizoctonia solan 21 Hình 1.4 Ức chế phát triển nấm Pythiumultimum chất kháng sinh đƣợc tiết từ Trichoderma harzianum 23 Hình 1.5 Các mắt xích β-D-Glucose cellulose 29 Hình 1.6 Hợp chất cao phân tử Cellulose 29 Hình 3.1 Hình thái đại thể chủng nấm gây bệnh đốm trắng sau ngày nuôi cấy môi trƣờng PDA 53 Hình 3.2 Hình thái vi thể chủng nấm bệnh: (a) Sợi nấm, (b) Bào tử 54 Hình 3.3 Hình thái đại thể chủng nấm Trichoderma T3, T22 T26 sau ngày nuôi cấy môi trƣờng PDA 69 Hình 3.4 Đƣờng kính vịng phân giải cellulose chủng Trichoderma.T22, TC15 TC6 71 Hình 3.5 Đƣờng kính vịng phân giải chitin chủng Trichoderma T22, T3 TC7 73 Hình 3.6 Đĩa nấm đối chứng Neoscytalidium dimidiatum 2,4,6,7NSC 77 Hình 3.7 Kết đối kháng chủng nấm Trichoderma T3 với nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum đĩa petri 2,4,6,7 NSC 77 Hình 3.8 Sợi nấm Trichoderma T3 cơng nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100X 78 vii Hình 3.9 Kết giải trình tự gen 18S 78 Hình 3.10 Kết tra cứu BLAST SEARCH chủng nấm Trichoderma T3 78 Hình 3.11 Chế phẩm Trichoderma asperellum thô 80 Hình 3.12 Thử nghiệm khả phịng trừ bệnh đốm trắng long điều kiện chậu 80 Hình 3.13 Kết thử nghiệm điều kiện chậu 81 n Tỷ lệ ệnh long công thức ngày sau tƣới 82 Hình 3.15 Sinh viên thử nghiệm hiệu chế phẩm Trichoderma asperellum đồng ruộng 84 Hình 3.16 Cây long cơng thức đối chứng thí nghiệm 85 Hình 3.17 Cành long bị nhiễm bệnh cơng thức đối chứng (a) thí nghiệm (b) 85 Hình 3.18 Thanh long trƣớc ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm 87 Hình 3.19 Thanh long công thức đối chứng 15 ngày sau ủ 87 Hình 3.20 Thanh long cơng thức thí nghiệm 15 ngày sau ủ 88 Hình 3.21 Kết kiểm tra diện nấm bệnh công thức đối chứng 89 Hình 3.22 Kết kiểm tra diện nấm bệnh cơng thức thí nghiệm 89 viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CMC: Carboxymethyl cellulose NT: nghiệm thức ĐC: Đối chứng PDA: Potato D-glucose Agar VSV: Vi sinh vật NSC: ngày sau cấy TÓM TẮT NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thanh long trồng có giá trị xuất có hiệu kinh tế cao tỉnh Bình Thuận, Long An Tiền Giang Trong năm gần đây, bệnh đốm trắng đem lại nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho ngƣời dân Việc phòng trừ bệnh chủ yếu dựa vào thuốc hóa học nhƣng hiệu không cao Hơn nữa, việc sử dụng liên tục hóa chất bảo vệ thực vật gây bệnh trở nên kháng thuốc, tăng tồn dƣ quả, giảm chất lƣợng, gây ô nhiễm môi trƣờng sống sức khỏe cộng đồng Vì vậy, xu hƣớng sử dụng chế phẩm có nguồn gốc sinh học thay dần thuốc hóa học đƣợc nghiên cứu ứng dụng ngày rộng rãi, đặc biệt sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ bệnh hại vấn đề đƣợc nhà chuyên môn, tổ chức nƣớc quốc tế đặc biệt quan tâm Đề tài nghiên cứu tập trung vào nội dung: (1) Phân lập tác nhân gây bệnh đốm trắng long, (2) Xác định khả sinh trƣởng chủng nấm Trichoderma spp, (3) Đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm Trichoderma spp, (4) Đánh giá khả đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây hại long với chủng nấm Trichoderma điều kiện invitro, (5) Đánh giá khả khả phòng trừ bệnh long điều kiện chậu, (6) Đánh giá khả phòng trừ bệnh long ngồi đồng ruộng (7) Xử lí phế phẩm long phƣơng pháp ủ compost Trong trình thực đề tài thu đƣợc số kết nhƣ sau: phân lập xác dịnh đƣợc tác nhân gây bệnh đốm trắng long Các chủng Trichoderma khảo sát hầu hết có khả sinh trƣởng mạnh, khả sinh enzyme cellulase chitinase từ mạnh đến mạnh nấm Trichoderma spp có khả đối kháng cao với nấm bệnh Trong số 27 chủng Trichoderma khảo sát, chủng Trichoderma asperellum T3 cho kết phòng trừ nấm bệnh tốt điều kiện chậu đồng ruộng Ngoài ra, kết cho thấy bổ sung thêm chế phẩm Trichoderma để ủ phế phẩm long, rút ngắn thời gian phân hủy cịn tiêu diệt nấm Neoscytalidium dimidiatum có cành long sau ủ compost 14 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N chung D E 53.230 TC11 D E 52.993 TC8 D E 52.273 T25 E 49.807 T7 15 Phụ lục B: Hình ảnh B.1 Hình thái đại thể chủng nấm Trichoderma spp sau ngày nuôi cấy ôi trường PDA 16 17 B.2 Đường kính vịng phân giải cellulose (cm) chitin (cm) chủng Trichoderma 2NSC Chủng nấm T1 T3 T7 T9 Đƣờng kính vịng phân giải cellulose (cm) Đƣờng kính vịng phân giải chitin (cm) 18 T11 T12 T13 T15 T21 19 T22 T23 T25 T26 TC1 20 TC2 TC3 TC5 TC6 TC7 21 TC8 TC9 TC10 TC11 TC13 22 TC15 TCC1 TCC6 23 B.3 Kết khảo sát khả sinh đối kháng chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng long Ch Kết đối kháng chủng nấm Trichoderma spp với nấm N dimidiatum ủn g T1 T3 T7 T9 T11 2NSC 4NSC 6NSC 7NSC 24 T12 T13 T15 T21 T22 T23 25 T25 T26 TC TC TC TC 26 TC TC TC TC TC 10 TC1 27 TC1 TC1 TC C1 TC C6 28 B.4 Lơ thí nghiệ đối chứng thử nghiệm hiệu lực phòng trừ bệnh chế phẩm Trichoderma asperellum đồng ruộng ... - Đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm Trichoderma spp - Đánh giá khả đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây hại long chủng nấm Trichoderma điều kiện invitro - Đánh giá khả khả phòng. .. nội địa có khả phòng trừ nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng long Nội dung nghiên cứu - Phân lập tác nhân gây bệnh đốm trắng long - Xác định khả sinh trƣởng chủng nấm Trichoderma spp. .. khả phòng trừ bệnh đốm trắng nấm Neoscytalidium dimidiatum long điều kiện chậu - Đánh giá khả phòng trừ bệnh đốm trắng nấm Neoscytalidium dimidiatum long đồng ruộng - Xử lí phế phẩm long phƣơng