ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ SINH HỌC BỆNH THÁN THƯ (COLLETOTRICHUM OBICULARE 104T) TRÊN CÂY DƯA LEO (CUCUMIS SATIVUS CV. TSUYATARO) CỦA MỘT SỐ DÒNG ACTINOMYCETES NỘI SINH

Tạp chí Khoa học 2010:15b 186-196 Trường Đại học Cần Thơ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ SINH HỌC BỆNH THÁN THƯ (COLLETOTRICHUM OBICULARE 104T) TRÊN CÂY DƯA LEO (CUCUMIS SATIVUS CV TSUYATARO) CỦA MỘT SỐ DÒNG ACTINOMYCETES NỘI SINH Trần Sỹ Hiếu1, Tomonori Shiraishi2 Kazuhiro Toyoda2 ABSTRACT This study was carried out in order to evaluate tolerant characteristics to some stress conditions; protection capacity (Yoshida, 2009) against anthracnose (Colletotrichum orbiculare); and to examine Pathogenesis-related genes expression in cucumber plants The three strains was evaluated tolerance capacity at different temeperature regimes (23, 30, 35 and 40oC); in media supplemented with 0.5 and M NaCl; and at different pH conditions (pH 4, and 8) Bio-control activities was evaluated by spot challenge of C obiculare on true leaf surface of seedlings pretreated with Actinomyces strains Results showed that A12 and A19 strain could adapt well to high temperature condition (35-40oC) A12 and A16 strain can adapt well to supplemention of NaCl 1M All three strains can response well to both pH levels (4 and 8) Among the three candidates, A12 strain exerted the greatest protection effect which was reflected by significant declining (p< 0.01) of both lesion area and lesion number A12 strain at OD660=2 was determined to be the best concentration to be applied Result of PR gene expression reflected that, PAL gene was expressed clearer in true leaves pretreated with A12 strain in comparison to that expressed in the other strains and control Keywords: Actinomycetes, Streptomyces, Colletotrichum obiculare 104T Title: Evaluation of some endophytic Actinomycetes strains as biological control agents against anthracnose (Colletotrichum obiculare strain 104T) on cucumber (Cucumis sativus cv Tsuyataro) TÓM TẮT Đề tài thực nhằm đánh giá khả chống chịu với số điều kiện stress, khả phòng trừ bệnh thán thư (Colletotrichum orbiculare) dưa leo khảo sát biểu gene liên quan đến hình thành bệnh (Yoshida, 2009) Ba dòng nấm đánh giá chế độ nhiệt độ (23, 30, 35 40oC), môi trường bổ sung NaCl (0,5 1M) pH (4 8) Khả kiểm soát sinh học ba dòng Actinomyces đánh giá cách nhỏ giọt dịch chứa C orbiculare lên bề mặt thật xử lý trước với Actnomycetes Kết cho thấy hai dòng A12 A19 đáp ứng tốt với nhiệt độ 35 40oC Dòng A12 A16 đáp ứng tốt với nghiệm thức bổ sung 1M NaCl Cả ba dòng sinh trưởng tốt mức pH Trong số ba dòng đánh giá, A12 cho thấy khả phòng trị hiệu quả, làm giảm rõ rệt (p< 0.01) số lượng diện tích vết bệnh so với đối chứng Dòng A12 mức OD660=2 cho kết phòng trị tốt Kết biểu gene liên quan đến gây bệnh cho thấy thật xử lý với dòng A12 có mức biểu gen PAL cao so với đối chứng dòng khác Từ khóa: Actinomycetes, Streptomyces pactum, Colletotrichum obiculare dòng 104T Bộ môn Khoa Học Cây Trồng, Khoa Nông Nghiệp &Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ Graduate School of Natural Science and Technology, Okayama University, Japan 186 Tạp chí Khoa học 2010:15b 186-196 Trường Đại học Cần Thơ ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiều nghiên cứu cho thấy loài sinh vật nội sinh (endophytic microorganism) đem lại nhiều lợi ích cho trồng (Downing and Thomson, 2000; Strobel, 2003) Một số loài nấm vi khuẩn nội sinh phân lập đánh giá tiềm phòng trừ sinh học, có nhiều loài thương mại hóa sử dụng rộng rãi Trichoderma, Bacillus Benhamou et al (1996) cho biết Bacillus pumilus dòng SE34 phòng trừ bệnh thối rể đậu nấm Fusarium oxysporum f sp Pisi Ngoài ra, Varma et al (1999) xác định hiệu thúc đẩy sinh trưởng nhiều loài trồng loài nấm nội sinh Piriformospora indica Các loài vi sinh vật nội sinh vừa giúp phòng trừ bệnh vừa thúc đẩy sinh trưởng ký chủ, chúng hoàn toàn xem xét để phát triển thành tác nhân phòng trừ sinh học và/hoặc thúc đẩy sinh trưởng Một số tác giả nghiên cứu nhiều chủng Actinomycetes nội sinh bên nhiều loại trồng (Coombs and Franco, 2003; Shimizu et al., 2000) phát triển thành tác nhân phòng trừ sinh học Trong số loài Actinomycetes nội sinh, Streptomyces áp dụng rộng rãi toàn giới phòng trừ nhiều loại bệnh phát sinh từ đất Một điểm đáng ý Streptomyces nói riêng Actinomyces nói chung chúng có khả đối kháng mạnh (intense antagonist) thông qua việc sản xuất nhiều hoạt chất kháng nấm (El-Tarabilya and Sivasithamparam, 2006) Trong số loài gây bệnh họ bầu bí, Colletotrichum orbiculare (C lagenarium), gây bệnh thán thư, xem loài gây bệnh đáng ngại (Kim and Chung, 2004; Meera et al., 1995) Để kiểm soát bệnh này, biện pháp phổ biến dùng loại thuốc trừ nấm Azoxystrobin, Benomyl, Captan, TPN Mancozeb (Shimizu et al., 2000) Tuy nhiên, loại thuốc lại gây quan ngại số vấn đề ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe nguy bùng nổ kháng thuốc Do đó, để giải vấn đề trên, nhu cầu phát triển ứng dụng tác nhân phòng trừ sinh học trở nên cấp thiết Trong đề tài này, khả phòng trừ bệnh thán thư (Colletotrichum orbiculare) dưa leo ba dòng Actinomyces đánh giá Ngoài ra, số đặc tính chống chịu dòng khảo sát Mục đích thí nghiệm cuối đề tài nhằm xác định biểu số gene liên quan đến hình thành bệnh (pathogenesis related –PR gene) dưa leo xử lý với Actinomycetes PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương tiện  Giống dưa leo: Tsuyataro (Cucumis sativus cv Tsuyataro)  Loài gây bệnh: Colletotrichum orbiculare 104T Các dòng Actinomyces sử dụng nghiên cứu A12 (Actinomadura nitrigenes), A16 (Streptomyces pactum) A19(Streptomyces thermocarboxydus) thu thập Yoshida (2009) (Hình 1) 187 Tạp chí Khoa học 2010:15b 186-196 Trường Đại học Cần Thơ Actinomadura Streptomyces pactum Streptomyces thermocarboxydus nitrigenes Hình 1: Các dòng nấm Actinomyces A12, A16 A19 sử dụng nghiên cứu 2.2 Phương pháp Đề tài thực phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử Bệnh Học Thực Vật (Laboratory of Molecular Biology Plant Pathology), Khoa Nông Nghiệp, trường đại học Okayama, Nhật Bản, bao gồm ba thí nghiệm thực theo trình tự 2.2.1 Đánh giá khả chống chịu ba dòng Actinomyces số điều kiện môi trường bất lợi Có ba yếu tố môi trường đánh giá: ảnh hưởng nhiệt độ, hàm lượng muối (NaCl) pH Trong thí nghiệm nhiệt độ, ba dòng Actinomyces nuôi cấy môi trường IMA-2 dạng lỏng, sau ủ điều kiện nhiệt độ khác nhau: 23; 30; 35 40oC Tương tự yếu tố nhiệt độ, thí nghiệm ảnh hưởng muối có nghiệm thức bổ sung 0,5 1M NaCl Đối với yếu tố pH, tác động môi trường acid (pH=4) base (pH=8) khảo sát Thể nuôi cấy lỏng hai thí nghiệm pH muối ủ nhiệt độ 30 oC ngày Các thí nghiệm lập lại ba lần, lần lập lại tương ứng với hai bình tam giác chứa 50 ml môi trường nuôi cấy IMA-2 2.2.2 Đánh giá hiệu kiểm soát sinh học ba dòng Actinomyces thật dưa leo Ba dòng Actinomyces nuôi môi trường IMA-2 điều kiện nhiệt độ 30oC, 120 rpm (round per minute) ngày Sau đó, dịch treo Actinomycetes dùng để lây nhiễm với hạt dưa leo nảy mầm 15 phút Nồng độ dịch treo điều chỉnh mức OD660=1 trước lây nhiễm Hạt giống dưa leo khử trùng ethanol 70% (1 phút) NaClO 5% (5 phút) trước ủ nẩy mầm nhiệt độ 26oC Hạt sau lây nhiễm gieo vào chậu có chứa hỗn hợp than bùn-vermiculite (1:1) Sau tuần lưu phòng tăng trưởng (26oC), thật cắt lây nhiễm với dịch treo C lagenarium (106 cfu), thật lây nhiễm với 11 giọt (mỗi giọt 10 l) Lá sau lây nhiễm đặt môi trường ẩm độ cao tuần Diện tích số lượng vết bệnh xuất bề mặt xác định phần mềm Assess 2.0 (APS – American Plant Pathology Society) đếm Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với lần lập lại, lần lập lại có cho nghiệm thức lây nhiễm với Actinomycetes Một thí nghiệm khác tương tự thực để xác định nồng độ lây nhiễm tốt dòng A12 188 Tạp chí Khoa học 2010:15b 186-196 Trường Đại học Cần Thơ 2.2.3 Biểu (gene expression) số gene liên quan đến gây bệnh (Pahtogenesis relate-PR gene) bên dưa leo lây nhiễm với dòng Actinomyces Hạt nảy mầm lây nhiễm tương tự thí nghiệm (nồng độ dịch treo Actinomycetes chỉnh OD660=1) Sau tuần lưu phòng thí nghiệm, RNA tổng mầm thật ly trích theo quy trình mô tả công ty Invitrogen Mẫu nghiền nitơ lỏng trước phá vách tế bào dung dịch Trizol (Invitrogen Inc.) RNA tổng trích hỗn hợp Isopropanol High Salt Precipitation Solution (Wako Chem.) với tỷ lệ 1:1 sau ly tâm 12.000 vòng cDNA (complimentary DNA) phiên mã ngược (reverse transcript) từ RNA tổng thu với enzyme AMV Rnase (Takara Inc., Japan) Sau đó, số gene thường trú (housekeeping gene) PR khuếch đại phản ứng PCR với đoạn mồi mô tả Shoresh et al (2004) Các gene khuếch đại bao gồm: EF1α (housekeeping); Glu (1,3- glucanase); Chit (Chitinase); PAL (Phenyl alanine ammonia-lyase); POX (peroxidase); LOX (lipoxygenase) Sau khuếch đại, sản phẩm PCR tiến hành điện di (electrophoresis) với gel agarose 1.5% nhuộm với Ethidium bromide Mức độ biểu gene khảo sát đánh giá thông qua độ sáng vạch thể hình điện di Tất thí nghiệm (ngoại trừ thí nghiệm khảo sát chống chịu thuốc trừ nấm) đề cập phân tích biến lượng (ANOVA) để phát khác biệt nghiệm thức phần mềm SPSS version 16 Các giá trị trung bình so sánh phép thử Duncan mức ý nghĩa 5% 1% KẾT QUẢ 3.1 Đánh giá khả chống chịu ba dòng Actinomycetes số điều kiện môi trường bất lợi 3.1.1 Sự chống chịu điều kiện môi trường bất lợi Sự chống chịu nhiệt độ Đối với dòng A12, sinh trưởng nghiệm thức 40oC ngày thấp so với nghiệm thức nhiệt độ khác (23, 30, 35oC), đặc biệt ngày thứ thứ 4, khác biệt có ý nghĩa mức 5% (Hình 2) Tuy nhiên, ngày thứ thứ 6, tốc độ sinh trưởng nghiệm thức khác giảm (giảm xuống nghiệm thức 30oC) dẫn đến khác biệt ý nghĩa nghiệm thức 40oC nghiệm thức khác Có thể thấy rằng, dòng A12 chống chịu tốt dãy nhiệt độ từ 23-40oC, ngày đầu nuôi cấy sinh trưởng nhiệt độ 40 oC thấp so với điều kiện nhiệt độ lại Sự sinh trưởng dòng A16 ngày cho thấy, nhiệt độ 40oC, số OD660 thấp đáng kể so với nghiệm thức nhiệt độ lại Qua kết luận dòng A16 chống chịu nhiệt độ cao (40oC), nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng dòng A16 khoảng từ 23 đến 35oC Ngược lại, kết cho thấy dòng A19 phát triển tốt nhiệt độ tương đối cao, 35-40oC Điều thấy rõ ngày nuôi cấy thứ 4, có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê nghiệm thức nhiệt độ 189 Tạp chí Khoa học 2010:15b 186-196 Trường Đại học Cần Thơ (A) (B) (C) Hình 2: Tác động nhiệt độ lên sinh trưởng ba dòng Actynomycetes, A12 (A); A16 (B); A19 (C) Chú thích: Các giá trị biểu diễn đồ thị giá trị trung bình ba lần lập lại Các đường dọc cột biểu thị cho sai số chuẩn (SE) Sự chống chịu muối Vì thí nghiệm thực nhằm xác định xem ba dòng Actinomycetes có đáp ứng với tác động môi trường có nồng độ muối cao hay không, khả chống chịu muối dòng không so sánh với kết thống kê Hình cho thấy, so sánh với sinh trưởng môi trường IMA-2 không bổ sung muối (đối chứng), dòng A12 đáp ứng tốt với nghiệm thức bổ sung 1M NaCl Tương tự, dòng A16 cho thấy khả sinh trưởng tốt điều kiện có hàm lượng muối cao hai nghiệm thức bổ sung 190 Tạp chí Khoa học 2010:15b 186-196 Trường Đại học Cần Thơ 0,5 M NaCl Trái lại, dòng A19 đáp ứng với mức bổ sung 0,5 M NaCl Hình 3: Tác động muối (NaCl) đến sinh trưởng ba dòng Actinomyces Chú thích: Các giá trị biểu diễn đồ thị giá trị trung bình ba lần lập lại Các đường dọc cột biểu thị cho sai số chuẩn (SE) Sự chống chịu với điều kiện acid base Tương tự thí nghiệm chống chịu muối, đáp ứng ba dòng Actinomyctes điều kiện pH khác không so sánh trình thống kê số liệu, thay vào so sánh tác động mức pH môi trường khác dòng Actinomycetes Kết thí nghiệm cho thấy khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê số OD660 mức độ pH môi trường dòng (Hình 4) Nói cách khác, ba dòng Actinomycetes khảo sát có khả đáp ứng tốt với hai điều kiện môi trường acid (pH=4) base (pH=8) Hình 4: Tác động pH đến sinh trưởng ba dòng Actinomyces Chú thích: Các giá trị biểu diễn đồ thị giá trị trung bình ba lần lập lại Các đường dọc cột biểu thị cho sai số chuẩn (SE) 3.2 Đánh giá hiệu kiểm soát sinh học ba dòng Actinomyces thật dưa leo Bảy ngày sau lây nhiễm với C Obiculare, quan sát thấy trung bình có vết bệnh diện thật không xử lý, trung bình tổng diện tích vết bệnh 140 mm2 Trái lại, xử lý trước với dòng Actinomyces, mở rộng vết bệnh bị chặn lại (Hình 5) mức độ khác dòng khác Việc xử lý hạt nảy mầm với dòng A16 A19 làm giảm diện tích số vết bệnh Tuy nhiên, hiệu đạt 191 Tạp chí Khoa học 2010:15b 186-196 Trường Đại học Cần Thơ thấp so với xử lý với dòng A12 khác biệt ý nghĩa thống kê so với đối chứng không xử lý Kết cho thấy, hiệu đạt cao với dòng A12, diện tích số vết bệnh giảm rõ rệt (p[...]...Tạp chí Khoa học 2010:15b 186-196 Trường Đại học Cần Thơ Meera M.S., M.B Shivanna, K Kageyama, and M Hyakumachi 1995 Responses of cucumber cultivars to induction of systemic resistance against anthracnose by plant growth promoting fungi Eur J Plant Pathol 101:421-430 Shimizu M., Y Nakagawa, Y Sato , T Furumai, Y Igarashi, H Onaka, R Yoshida, and H Kunoh 2000 Studies on Endophytic Actinomycetes (I)