Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số hyponex bổ sung đến sự hình thành và phát triển của chồi lan phalaenopsis và lan dendrobium

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm LỜI MỞ ĐẦU I Đặt vấn đề Enzyme sử dụng từ lâu Khoảng 5.000 năm trước công nguyên Jerico, người ta biết đến kỹ thuật làm bánh mì Trong thành cổ Babylon, nấu rượu vang, sản xuất dấm, tương, chao… mức độ khác nhau, trình sinh học xưa lịch sử phát triển văn minh nhân loại Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ Công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều sử dụng hầu hết lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm khối lượng enzyme sản xuất giới đạt khoảng 300.000 với giá trị 500 triệu USD, phân phối lĩnh vực khác Phần lớn enzyme sản xuất quy mô công nghiệp thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm enzyme thủy phân sử dụng cho việc thủy phân chất tự nhiên Qua nhiều năm, việc sử dụng vi sinh vật nguồn cung cấp enzyme cải thiện đáng kể hiệu sản xuất, sản phẩm tạo nhiều giá thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng lên đáng kể, làm giảm tác động xấu tới môi trường II Lý chọn đề tài Trong loài vi sinh vật sử dụng làm nguồn cung cấp enzyme, vi khuẩn Bacillus subtilis ví dụ điển hình nhà khoa học nghiên cứu nhiều Các enzyme ngoại bào vi khuẩn đưa vào sản xuất ứng dụng rộng rãi qui mô công nghiệp chúng có đặc tính hẳn khả sinh tổng hợp enzyme mạnh so với enzyme ngoại bào vi sinh vật khác Ở nước ta, việc nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme ngoại bào từ Bacillus subtilis tiến hành số sở nghiên cứu, nhà máy -1- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm sản xuất qui mô công nghiệp đóng góp phần lợi ích vào kinh tế quốc dân III Mục đích đề tài Để tìm hiểu số vấn đề như: • Tổng quan enzyme ngoại bào vi sinh vật • Các enzyme ngoại bào vi khuẩn Bacillus subtilis • Các điều kiện hoạt động enzyme ngoại bào trình sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật • Qui trình tách chiết enzyme ngoại bào Bacillus subtilis • Khả ứng dụng chúng vào đời sống sản xuất qui mô công nghiệp Đó sở tính cấp thiết mà tiến hành đề tài nghiên cứu: “Tổng quan enzyme ngoại bào Bacillus subtilis” IV Đối tượng phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: vi khuẩn Bacillus subtilis Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu tổng quan enzyme ngoại bào Bacillus subtilis V Phương pháp nghiên cứu Đọc tài liệu tham khảo nghiên cứu nước nước vi khuẩn Bacillus subtilis Tổng hợp, phân tích cơng trình nghiên cứu, tài liệu khoa học vi khuẩn Bacillus subtilis số enzyme ngoại bào vi khuẩn nhằm giải mục đích đề Đua kết luận kiến nghị sau trình thực đề tài -2- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME NGOẠI BÀO CỦA VI SINH VẬT 1.1 Khái niệm enzyme ngoại bào 1.1.1 Định nghĩa Enzyme ngoại bào (exoenzyme) enzyme vi sinh vật sinh tổng hợp sau tiết ngồi tế bào tham gia vào q trình thủy phân (dị hóa) hợp chất hữu bên ngồi môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Các trình dị hóa ngồi tế bào chủ yếu cung cấp nguyên liệu cho trình sinh tổng hợp tế bào Vì thực tế bên ngồi mơi trường xung quanh, hợp chất làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật tồn phát triển hợp chất cao phân tử vận chuyển qua màng tế bào nên cần có enzyme để xúc tác phản ứng dị hóa hợp chất cao phân tử thành hợp chất có phân tử lượng thấp qua màng tế bào Các enzyme tổng hợp tham gia phản ứng ngồi tế bào có đặc điểm riêng có vi sinh vật 1.1.2 Phân loại Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ thống phân loại enzyme thành nhóm chính, nhóm cịn có nhóm phụ, phân nhóm phụ: • Nhóm 1: Oxydroreductase nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử • Nhóm 2: Transpherase nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị • Nhóm 3: Hydrolase nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (sự phân giải có mặt H2O tham gia) -3- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm • Nhóm 4: Lyase nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo thành phân tử không cần H2O tham gia; loại H2O tạo thành nối đôi kết hợp phân tử H2O vào nối đơi • Nhóm 5: Isomerase nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa • Nhóm 6: Lygase nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng xúc tác cho phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu lượng ATP nucleoside triphosphate khác Trong đó, enzyme ngoại bào vi sinh vật phần lớn enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase Phương trình phản ứng: R1 – R2 +H2O Ví dụ: Tinh bột + H2O α-amylase R1OH + R2H Dextrin + Maltose + Glucose Các enzyme ngoại bào vi sinh vật gồm loại phổ biến enzyme: amylase, cellulase, protease pectinase… 1.1.3 Đặc điểm - tính chất Enzyme ngoại bào vi sinh vật có đặc điểm tính chất enzyme xúc tác phản ứng sinh hóa: • Về chất enzyme protein nên có đầy đủ tính chất protein, có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến vài trăm ngàn dalton (Da) Do phân tử lượng lớn nên chúng qua màng tế bào • Vì có chất protein, enzyme có tính chất lưỡng tính (do có nhóm -COOH -NH2 cấu tạo phân tử) Trong môi trường kiềm acid chúng bị phân ly sau: Kiềm Protein -COOH Protein -COO- + H+ Acid Acid Protein -NH+ + H+ Protein -NH2 Kiềm -4- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm • Enzyme tan nước tạo thành dung dịch dạng keo chúng tan dung dịch muối lỗng, glycerin dung mơi hữu hữu cực khác Khi hòa tan enzyme vào nước, phân tử lưỡng cực nước kết hợp với ion, nhóm ion nhóm phân cực phân tử enzyme tạo thành lớp vỏ hydrate Lượng nước hydrate hóa lớn có vai trị quan trọng phản ứng sinh hóa • Enzyme khơng bền dễ dàng bị biến tính tác dụng nhiệt độ cao Enzyme bị biến tính khả xúc tác Mức độ giảm hoạt tính enzyme tương ứng với mức độ biến tính protein chế phẩm Kiềm, acid mạnh kim loại nặng làm cho enzyme biến tính Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme chịu nhiệt độ cao đến 110oC như: α-amylase từ vi khuẩn ưa nhiệt Bacillus amyloliquefciens Bacillus lichenniformis chịu nhiệt độ 110oC Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật khả chịu nhiệt tốt cịn có khả chịu ngưỡng pH khác pH acid, pH trung tính pH kiềm Ví dụ: protease acid, protease kiềm protease trung tính thu nhận từ vi khuẩn Bacillus; Aspergillus niger sinh tổng hợp α-amylase chịu pH acid 2,1… • Enzyme có trung tâm hoạt động chiếm tỷ lệ thể tích tương đối nhỏ phân tử, nằm túi khe, gần phân tử enzyme Trong trung tâm hoạt động enzyme ngoại bào khơng có coenzyme (trừ enzyme lipase enzyme hai cấu tử) enzyme amylase, protease, cellulase, pectinase hemicellulase… chúng cần có ion kim loại để ổn định khả xúc tác α-amylase có chứa ion Ca2+ • Là enzyme chun biệt hóa cao có khả xúc tác với độ đặc hiệu với chất • Q trình tổng hợp phân hủy enzyme tuân theo qui luật cảm ứng chất Quá trình xảy trường hợp chất có kích thước lớn kích thước thành màng nguyên sinh chất Muốn sử dụng chất này, vi sinh vật phải phân hủy chúng thành chất có kích thước nhỏ để xâm nhập vào tế bào thơng qua thành màng tế bào Như vậy, có mặt chất môi trường, tế bào vi sinh vật sinh tổng -5- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm hợp lượng enzyme lớn gấp nhiều lần so với mức bình thường khơng có chất để phân hủy chất Enzyme sinh tổng hợp trường hợp gọi enzyme cảm ứng Những chất đưa vào mơi trường, kích thích thúc đẩy nhanh q trình sinh tổng hợp enzyme cảm ứng để phân hủy chúng gọi chất cảm ứng • Là enzyme cảm ứng với chất nên trình tổng hợp enzyme phức tạp kiểm soát chặt chẽ Cơ chất cảm ứng thường coi yếu tố quan trọng dùng để điều khiển trình sinh tổng hợp enzyme Khi cho chất với lượng tăng dần khả tổng hợp enzyme cảm ứng tăng dần Nếu tiếp tục tăng dần lượng chất đến mức độ q trình chậm lại chí giảm tượng tăng áp suất thẩm thấu chất gây Như vậy, muốn điều khiển kiểm sốt q trình cần phải ý hai điểm: − Thứ nhất, muốn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme cảm ứng phải cho chất mà enzyme phân hủy vào mơi trường, ví dụ: sinh tổng hợp amylase bổ sung vào mơi trường tinh bột; protease bổ sung protein; pectinase bổ sung pectin cellulase bổ sung cellulose… − Thứ hai, tác động cảm ứng đạt hiệu cao liều lượng định Vượt liều lượng này, khả sinh tổng hợp giảm Do đó, cho nhiều chất, khả sinh tổng hợp cao • Enzyme tham gia xúc tác phản ứng thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hồn tồn lượng dự trữ hợp chất hóa học Quá trình thực theo chuỗi phản ứng, chuỗi phản ứng xúc tác loại enzyme cuối tạo thành CO2, H2O, số chất khác giải phóng lượng Trong chuỗi phản ứng, sản phẩm phản ứng trước chất cho phản ứng sau • Enzyme thực số phản ứng, phản ứng xảy ngồi tế bào -6- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm • Phản ứng enzyme phản ứng tiêu hao lượng Trong đó, phản ứng hóa học xúc tác chất xúc tác hóa học thường địi hỏi lượng lớn Ví dụ: Trong q trình thủy phân sucrose thành fructose glucose − Khi khơng có xúc tác: lượng hoạt hóa 32.000 cal/phân tử gam − Khi xúc tác acid: lượng hoạt hóa 25.000 cal/phân tử gam Phương trình phản ứng: Sucrose Acid Fructose + Glucose − Khi xúc tác enzyme saccharase: lượng hoạt hóa 9.000 cal/phân tử gam Phương trình phản ứng: Sucrose Saccharase Fructose + Glucose • Enzyme chịu điều khiển gen điều kiện phản ứng Gen định việc tổng hợp loại enzyme Mỗi enzyme định phản ứng sinh hóa • Enzyme khơng tham gia vào thành phần sản phẩm sau phản ứng • Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà phản ứng xảy điều kiện khơng có enzyme • Khơng làm vị trí cân phản ứng mà làm tăng tốc độ phản ứng • Có nhiều ưu điểm so với enzyme thu nhận từ tế bào động vật thực vật như: sản xuất thu nhận dễ dàng, môi trường lên men rẻ tiền, suất sinh học cao, cải biến công nghệ gen dễ, thành phần enzyme dễ dàng dự đốn kiểm sốt, khơng chứa chất độc gây hại cho người chất phenolic từ thực vật chất nội sinh gây ức chế protease động vật, giá thành chế phẩm enzyme ngoại bào từ vi sinh vật rẻ nhiều so với chế phẩm enzyme động vật thực vật Đặc điểm dễ nhận thấy giới động vật hay thực vật loài cung cấp loại enzyme đó, ví dụ -7- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm từ malt thu nhận enzyme amylase, dứa (khóm, thơm) thu nhận enzyme bromelin, đu đủ thu nhận enzyme papain, enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngược lại; từ lồi vi sinh vật thu nhận nhiều enzyme số lượng enzyme vi sinh vật phong phú đa dạng Tốc độ sinh sản vi sinh vật mạnh thời gian ngắn thu nhận khối lượng enzyme lớn Chúng có hoạt tính cao có khả chuyển hóa khối lượng vật chất lớn Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào điều kiện địa lý, thời tiết ni, trồng động vật thực vật Có thể sản xuất theo qui mơ cơng nghiệp kiểm sốt trình sản xuất 1.2 Một số enzyme ngoại bào vi sinh vật Nguồn enzyme ngoại bào vi sinh vật vô phong phú đa dạng Sau số loại enzyme quan trọng vi sinh vật nghiên cứu ứng dụng rộng rãi đời sống sản xuất công nghiệp 1.2.1 Enzyme amylase Amylase hệ enzyme phổ biến nhiều sinh vật Các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác cho phản ứng phân giải liên kết nội phân tử nhóm polysaccharide với tham gia nước: Phương trình phản ứng: R.R.’ + H – OH Amylase OH – RH + R’OH Có loại enzyme amylase xếp vào nhóm: Endoamylase (enzyme nội phân) exoamylase (enzyme ngoại phân) Endoamylase gồm có α-amylase nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh chia thành loại: khử trực tiếp Pullulanase (αdextrin 6-glucosidase); khử gián tiếp oligo-1,6-glucosidase hay dextrinase tới hạn transglucosidase Các enzyme thủy phân liên kết bên chuỗi polysaccharide Exoamylase gồm có β-amylase glucoamylase (amyloglucosidase hay γamylase) Đây enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử chuỗi polysaccharide -8- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm 1.2.1.1 Đặc tính chế xúc tác enzyme α-amylase (1,4-α-glucan glucanhydrolase) α-amylase từ nguồn khác có thành phần amino acid khác nhau, loại α-amylase có tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-amylase protein giàu tyrosine (Tyr), tryptophan (Trp), acid glutamic (Glu) acid aspartic (Asp) Các acid glutamic acid aspartic chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme: α-amylase có methionine (Met) có khoảng - 10 gốc cysteine (Cys) Trọng lượng phân tử α-amylase từ nguồn khác không giống Trọng lượng phân tử α-amylase có nguồn gốc từ thực vật khoảng 45.000 - 60.000 Da, α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn 24.000 100.000 Da, từ nấm mốc: 45.000 - 50.000 Da (Knir, 1956; Fisher Stein, 1960) α-amylase có chứa nhóm -COOH NH3 trung tâm hoạt động α-amylase kết tủa dung dịch (NH4)2SO4 25 - 30%, α-amylase dễ tan nước, dung dịch muối tan ethanol loãng kết tủa ethanol 60% Protein α-amylase có tính acid yếu có tính chất globuline Điểm đẳng điện nằm vùng pH khoảng 4,2 - 5,7 (Bernfeld P, 1951) Giá trị pH tối ưu α-amylase phụ thuộc vào nguồn enzyme, thường vùng acid yếu, 4,8 6,9 Tuy nhiên có ngoại lệ, chẳng hạn αamylase từ Bacillus acidocadarius có pH tối ưu 3,5 enzyme từ Bacillus licheniformis lại có pH tối ưu 9,0 Nhiệt độ tối ưu tùy thuộc vào nguồn enzyme, thường vào khoảng 60 -70oC, tới 80 - 90oC số loại vi khuẩn chịu nhiệt α-amylase metaloenzyme (enzyme kim) Trong phân tử αamylase có chứa - 30 nguyên tử gam Ca/mol, khơng - ngun tử gam Ca/mol Ca2+ tham gia vào hình thành ổn định cấu trúc bậc enzyme, trì hoạt động enzyme (Modolova, 1965) Do đó, Ca2+ cịn có vai trị trì tồn độ bền cực lớn enzyme bị tác động tác nhân gây biến tính tác động enzyme phân giải protein Nếu phân tử -9- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm α-amylase bị loại bỏ hết Ca2+ hồn tồn bị hết khả thủy phân chất Theo Wallerstein (1969), ion Ca2+ có tác dụng ổn định hoạt tính α-amylase có tác dụng nồng độ thấp Với nồng độ ion Ca2+ 0,1 nguyên tử gam/lít có tác dụng làm giảm số vận tốc vô hoạt K malt đại mạch xuống 1500 lần điều kiện pH 4,0; nấm mốc số giảm 13 lần Khi nồng độ tăng 0,3 nguyên tử gam/lít tác dụng giảm rõ rệt α-amylase bền với nhiệt độ enzyme khác Người ta cho đặc tính α-amylase có liên quan tới hàm lượng Ca2+ phân tử (α-amylase vi khuẩn ưa nhiệt có chứa nhiều Ca2+ nấm mốc khoảng - lần nên bền nhiệt hơn) Tất amylase bị kìm hãm kim loại nặng Cu2+, Ag+, Hg2+ ion thuộc nhóm halogen có tác dụng bất hoạt α-amylase theo thứ tự Cl - < Br - < F - < I - Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+ Sn2+ khơng ảnh hưởng đến α-amylase Hình 1.1 Cấu trúc không gian α-amylase Cơ chế tác dụng: α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase) từ nguồn khác có nhiều điềm giống α-amylase có khả phân cắt liên kết α-1,4-glucoside nằm phía bên phân tử chất (tinh bột glycogen) cách ngẫu nhiên, không theo trật tự α-amylase không - 10 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm 2.2.3.1 Thu nhận tách chiết enzyme α-amylase Bacillus subtilis Trong số ngành cơng nghiệp nhiều địi hỏi phải có chế phẩm có độ tinh khiết cao Trong thập kỷ 70 kỷ xuất lĩnh vực khác sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết Trong trình sinh tổng hợp amylase đồng thời xảy trình sinh tổng hợp protease Trong trường hợp cần loại bỏ protease khỏi chế phẩm amylase người ta cho amylase hấp phụ lên tinh bột, cơng trình nêu chế phẩm Patent Mỹ Trong Patent người ta nêu lên việc ứng dụng calci acetate với tỷ lệ từ 10% (W/V) calci acetate góp phần hoạt hóa enzyme Sau bổ sung dung mơi hữu với nồng độ khoảng từ 0,6 - 1,0 Vdung môi/Vban đầu amylase bị kết tủa bổ sung dung môi Theo Molodova (1966) để loại bỏ protease khỏi α-amylase nấm mốc Aspergillus Rhizopus sử dụng hạt trao đổi anion, sử dụng nhựa phenolformadehyde, polystiren dẫn xuất cellulose… Người ta thu nhận 90% α-amylase Quá trình thu nhận làm sau: • Chế phẩm enzyme thơ thu sau lên men phải xử lý sơ phương pháp hóa học điều chỉnh pH, thêm chất ổn định 0,1% CaCl2 so với dịch lên men để tạo kết tủa dẫn đến lắng cặn hoạt hóa enzyme lọc để loại bỏ tạp chất Việc làm hoạt tính enzyme khoảng 2% Q trình lọc bỏ tạp chất gặp khó khăn sinh khối tế bào lớn bịt kín lỗ loc khiến tốc độ lọc chậm dần thời gian lọc dài dẫn đến tổn thất enzyme lớn, lọc người ta bổ sung bột trợ lọc, lọc màng sử dụng máy li tâm có tốc độ cao 5000 - 6000 vịng/phút, 96 - 97% sinh khối tách Bổ sung chất trợ lọc như: diatomit Nhật, filtroperlit Liên Xơ (cũ) • Sau có chế phẩm enzyme dạng lỏng người ta tiến hành cô đặc Thông thường người ta hay cô chân không nhiệt độ thấp 28 – 30oC để tránh tượng bất hoạt enzyme giai đoạn thuận lợi chế phẩm nuôi cấy phương pháp bề mặt chế phẩm có nồng độ chất khơ cao so với chế phẩm enzyme nuôi cấy phương pháp chìm Trong trường hợp thực đặc chế phẩm enzyme nuôi cấy phương - 59 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm pháp chìm thường hay dẫn đến số biến đổi hóa học, bất lợi cho hoạt động enzyme làm ảnh hưởng đến tính bền vững enzyme Trong vấn đề Vexelov (1970) có nhiều thành tựu, ơng đặc enzyme phương pháp đóng băng nhiều lần • Ngày với thành tựu công nghệ màng siêu lọc, phương pháp cô đặc dịch lên men thực đơn giản hơn, hiệu Để ứng dụng phương pháp có hiệu người ta làm enzyme, chọn nguyên liệu kích thước màng cho phù hợp Phương pháp cô đặc enzyme mà làm cho chế phẩm hơn, hoạt tính enzyme bị giảm khơng đáng kể q trình lọc • Sau có chế phẩm enzyme cô đặc người ta tiến hành sấy phun để thu enzyme khô nhiệt độ 120 - 130oC giảm nhiệt độ xuống khoảng 60 - 65oC Trước sấy phun thêm chất NaCl nồng độ 200 mg/l CaSO4, MgSO4 nồng độ 30 - 60 mg/l Trong q trình sấy phun hoạt tính enzyme giảm khoảng 10% Đây phương pháp hữu hiệu để sản xuất chế phẩm enzyme kỹ thuật Tuy nhiên để sấy phun có hiệu việc xử lý chế phẩm trước sấy phun việc quan trọng Độ ẩm chế phẩm thu yếu tố định tác dụng độ bền vững enzyme Chế phẩm thu bảo quản năm, sấy phun đơn giản hạ giá thành sản phẩm • Để thu nhận chế phẩm có độ tinh khiết cao người ta tiến hành sau: kết tủa dung môi hữu aceton, ethanol, muối trung tính để tách enzyme khỏi dung dịch, sau tách α-amylase khỏi hỗn hợp enzyme kết tủa màng siêu lọc, phương pháp hấp phụ enzyme tinh bột Sắc ký trao đổi ion dùng phương pháp đẳng điện, kết tinh sấy khô Kvesitadze (1984) đưa bảng trình làm kết tinh αamylase Bacillus subtilis sau: − Lọc chế phẩm − Hấp phụ tinh bột − Muối tách M/30 Na2HPO4 − Tẩy màu nhựa Đayrut A2 − Kết tủa (NH4)2SO4 đến 70% bão hịa - 60 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm − Hòa tan kết tủa calci acetate M/500 − Thêm aceton 00C đến 60% bão hòa − Hòa tan kết tủa calci acetate 0,01M − Chỉnh pH đến 6,0 − Bảo quản lạnh − Kết tinh • Tuy nhiên, theo nghiên cứu gần đây, trình kết tủa enzyme lại dùng cồn 96% Theo Nguyễn Thanh Thủy (2007) khảo sát tỷ lệ tủa enzyme α-amylase cồn 96% tủa (NH4)2SO4 cho kết sau: Bảng 2.6 Ảnh hưởng tỷ lệ cồn 96% lên khả tủa α-amylase Hiệu Protein Hiệu suất (mg/100ml thu hồi chế phẩm protein tươi) (%) 1:1 10,462 ± 0,232 10,78 4366,90 ± 190,003 8,698 1:2 15,963 ± 0,568 16,45 44056,08 ± 80,497 87,751 1:3 21,756 ± 0,232 22,42 45607,75 ± 185,067 90,842 1:4 23,127 ± 0,154 23,83 44284,27 ± 109,698 88,206 1:5 23,696 ± 0,154 24,42 43219,40 ± 270,422 86,085 Tỷ lệ enzyme/cồn 96% Hoạt tính (UI/100ml chế phẩm tươi) suất thu hồi hoạt tính (%) (trích Nguyễn Thanh Thủy, 2007) − Theo bảng 2.6 tỷ lệ 1:1, nồng độ cồn thấp tủa lượng nhỏ protein (α-amylase) nên hoạt tính α-amylase thấp Nhưng tỷ lệ 4:1 5:1, lượng protein thu nhận cao hơn, song hoạt tính thấp tỷ lệ 3:1 hai tỷ lệ nồng độ cồn cao làm protein bị biến tính nên hoạt tính α-amylase giảm - 61 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm Bảng 2.7 Ảnh hưởng (NH4)2SO4 lên khả tủa α-amylase Protein Độ bão (mg/100ml hòa (%) chế phẩm tươi) Hiệu suất Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt tính (UI/100ml thu hồi chế phẩm tươi) hoạt tính (%) 50 14,805 ± 0,118 15,02 31835,132 ± 205,852 55 15,846 ± 0,101 16,08 60 16,683 ± 0,195 16,53 37575,282 ± 20,283 72,86 65 16,683 ± 0,108 16,92 37281,175 ± 123,378 72.29 70 19,037 ± 0,166 19,31 36926,219 ± 126,669 71,60 36916,077 ± 73,132 61,73 71,58 (trích Nguyễn Thanh Thủy, 2007) − Theo bảng 2.7 tủa (NH4)2SO4 60% độ bão hịa, αamylase có hoạt tính cao Ở độ bão hịa 70%, hoạt tính α-amylase giảm, nồng độ muối cao làm biến tính protein − Từ kết trên, tác giả kết luận kết tủa cồn 96% tỷ lệ enzyme/cồn 1:3 hoạt tính α-amylase thu hồi cao kết tủa (NH4)2SO4 Như vậy, trình tách làm enzyme trình phức tạp, địi hỏi trang thiết bị đại, hóa chất tinh khiết tốn Người ta đề nghị số ngành sử dụng enzyme không cần tinh khiết sử dụng enzyme thơ công nghệ thuộc da sản xuất rượu bia… Ngày thị trường tồn nhiều chế phẩm enzyme Trong ngành công nghiệp sản xuất bia người ta sử dụng nhiều loại enzyme kỹ thuật Hãng Novo - Nordish Đan Mạch đưa vào thị trường Việt Nam loại chế phẩm enzyme cho nhiều ngành cơng nghiệp có ngành cơng nghệp sản xuất bia - 62 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm 2.2.3.2 Thu nhận tách chiết enzyme protease Bacillus subtilis a) Thu nhận enzyme protease Bacillus subtilis • Kết thúc q trình ni cấy ta thu nhận dịch enzyme protease thô Để đảm bảo cho dịch enzyme protease thô không bị hoạt tính nhanh người ta thường sấy khơ dịch máy sấy chân không Độ ẩm cần đạt sau trình sấy kết thúc nhỏ 10% Để đảm bảo hoạt tính enzyme khơng thay đổi người ta thường sấy nhiệt độ 38 - 40oC • Tùy theo mục đích sử dụng ta dùng chế phẩm thơ khơng qua q trình tinh Trong trường hợp cần thiết phải tiến hành làm enzyme Để sản xuất enzyme tinh khiết người phải tiến hành sau: − Tồn khối lượng enzyme protease thơ nghiền nhỏ Mục đích q trình nghiền vừa phá vỡ thành tế bào, vừa làm nhỏ thành phần chế phẩm thô Khi thành tế bào phá vỡ, enzyme nội bào dễ dàng thoát khỏi tế bào Phần lớn enzyme protease ngoại bào tổng hợp thoát khỏi tế bào thấm vào thành phần môi trường Khi nghiền nhỏ, enzyme thoát khỏi thành phần dễ dàng Khi nghiền người ta thường sử dụng chất trợ nghiền cát thạch anh bột thủy tinh Đây chất vô không tham gia vào phản ứng tăng khả ma sát, trước sử dụng cát thạch anh bột thủy tinh phải rửa sạch, sấy khô nhiệt độ lớn 100oC để loại bỏ nước tiêu diệt vi sinh vật b) Tách chiết enzyme protease Bacillus subtilis • Sau nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzyme protease Các loại enzyme thủy phân có khả tan nước nên dùng nước dung mơi hịa tan Cứ phần chế phẩm enzyme thô, cho - phần nước, khuấy nhẹ sau lọc lấy dịch • Q trình kết tủa enzyme nhờ tác nhân gây tủa như: cồn 96%, sulphate ammon, muối (NH4)2SO4… Khi tiến hành tủa, phải làm lạnh dung dịch enzyme thô tác nhân kết tủa để tránh làm hoạt tính enzyme Khi đổ chất kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải tiến hành từ từ để tránh tượng biến tính - 63 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm • Trong q trình kết tủa người ta dùng cồn sulphate ammon với liều lượng sau: phần dung dịch enzyme thô 2,5 lần cồn sulphate ammon • Khi cho chất kết tủa vào dung dịch enzyme thô, tiến hành khuấy nhẹ, sau để yên điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ - 7oC) theo thời gian, enzyme kết tủa lắng xuống đáy, tiến hành gạn lọc thu nhận tủa (độ ẩm lớn 70% trọng lượng) • Ở trạng thái enzyme dễ bị biến tính nhiều nước Để dễ bảo quản, sấy kết tủa enzyme protease 40oC độ ẩm cuối đạt - 8% trọng lượng (thiết bị sấy thường dùng máy sấy phun sương) • Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme protease dạng kết tủa hồn tồn chưa mặt hóa học cịn chứa số enzyme ngồi enzyme khác lẫn vào - 64 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG ENZYME NGOẠI BÀO CỦA BACILLUS SUBTILIS 3.1 Ứng dụng thực phẩm 3.1.1 Trong công nghệ sản xuất bia Bia loại giải khát mát bổ, có nồng độ cồn thấp, có độ mịn xốp có hương vị đặc trưng Hương liệu bia chất chiết từ nguyên liệu, cồn CO2 sản phẩm lên men khác tạo nên Đặc biệt, CO2 bão hòa bia có tác dụng giải khát tốt Nhờ ưu điểm mà bia sản xuất khắp nơi tồn giới Hiện giới có khoảng 25 nước sản xuất bia với sản lượng tỷ lít năm Trong có Mỹ, Cộng Hịa Liên Bang (CHLB) Đức, Trung Quốc năm sản xuất 10 tỷ lít, sản lượng tính theo đầu người năm 1984 Đan Mạch 182 lít/năm, CHLB Đức, Hà Lan 146 lít/năm Ở Việt Nam, năm gần đây, sản lượng bia tăng lên nhanh chóng Nếu 10 năm trước, nước ta có nhà máy bia Hà Nội Sài Gịn ước tính có hàng trăm nhà máy, xí nghiệp phân xưởng sản xuất bia lớn, nhỏ có quy mơ cơng nghiệp Năm 1994, theo thống kê bình qn đầu người lít/năm Từ xa xưa cơng nghệ sản xuất bia hầu khắp nước giới dùng malt, khác với sản xuất rượu, malt chủ yếu tác nhân đường hóa sản xuất bia malt vừa tác nhân đường hóa, vừa nguyên liệu sản xuất Sản xuất bia theo sơ đồ công nghệ thông thường hệ enzyme tạo trình nảy mầm cần thiết để xử lý nguyên liệu bột chuyển chất chiết sang trạng thái hòa tan giai đoạn nấu Các enzyme tạo q trình nảy mầm có ý nghĩa quan trọng công nghệ sản xuất bia enzyme amylase dịch hóa đường hóa tinh bột Enzyme protease phân giải protein đại mạch đến polysaccharide khơng - 65 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm phải tinh bột, hòa tan màng nội nhũ hạt ngũ cốc, làm cho enzyme amylase protease dễ dàng tác dụng đến chất tương ứng Mỗi trình kể cần tiến hành đến mức độ xác định để ổn định việc lọc dịch đường hóa, lên men dịch đường, làm lọc bia; tạo tính chấ,t mùi vị lý hóa xác định cho bia Những enzyme có nguồn khác dùng thay enzyme malt cần phù hợp với enzyme malt đặc tính tác dụng phải trội hoạt lực, cho phép giảm quy mơ sản xuất chế phẩm enzyme, so với quy mô sản xuất malt Ở Liên Xơ (cũ) cơng trình nghiên cứu có hệ thống ứng dụng chế phẩm enzyme từ vi sinh vật với mục đích thay phần đáng kể malt đại mạch chưa nảy mầm tiến hành sớm nước khác Người ta thay 86 - 100% malt đại mạch chưa nảy mầm Có sử dụng hỗn hợp enzyme α-amylase Asp oryzae Bacillus subtilis Trên giới có nhiều nước quan tâm đến việc sản xuất bia từ đại mạch chưa nảy mầm nguyên liệu khác thay gạo, ngô, khoai tây sắn… Nhiều công trình nghiên cứu vấn đề báo cáo hội nghị quốc tế lần thứ 13 14 Hiệp hội ngành bia châu Âu EBC năm 1971 1973 Khi phân tích thành tựu cơng nghiệp bia người ta dự báo việc thay hoàn toàn malt Đại mạch chưa nảy mầm enzyme vi sinh vật Từ năm 1960, Liên Xô sản xuất quy mô công nghiệp chế phẩm enzyme ứng dụng sản xuất bia Jigulevxkoe, Amilorizin Px, Xitorozenin Px amilosubtilin G10x Bia Jigulevxkoe thay 50% malt đại mạch chưa nảy mầm Giá trị công nghệ chỗ đảm bảo khả thu bia phẩm chất cao lượng lớn nguyên liệu chưa nảy mầm enzyme từ vi sinh vật Mục đích người ta sử dụng chế phẩm α-amylase (chủ yếu amylase từ vi khuẩn) để dịch hóa tinh bột làm tăng khả chuyển hóa tinh bột thành đường, đặc biệt dùng loại hạt mầm để thay malt đại mạch Loại α-amylase thường dùng từ Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis Baciillus liquefaciens Dịch đường hóa sản xuất bia cần - 66 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm đảm bảo tỉ lệ thành phần maltose dextrin, đơn tích lũy nhiều đường đơn Do vậy, người ta dùng bổ sung nguồn enzyme βamylase nấm mốc Asp oryzae giai đoạn đường hóa Ngồi ra, chế phẩm sử dụng sản xuất số bia cho người mắc bệnh tiểu đường hay người cần ăn kiêng Người ta sử dụng enzyme glucoamylase q trình đường hóa, nhằm giảm lượng đường sản phẩm cuối Chế phẩm dùng sản xuất bia hỗn hợp enzyme chứa α-amylase β-amylase (hay α-amylase có khả đường hóa cao) enzyme protease pentosanase, β-glucanase Amylase Bacillus subtilis tốt nấm mốc có độ bền nhiệt khả dịch hóa cao Đồng thời sử dụng bổ sung cách hợp lý α-amylase nấm mốc nâng cao mức độ lên men dịch đường Protease phải có khả proteinase lẫn peptidase để tác dụng lên polypeptide đại mạch chuyển vào dịch đường hợp chất đạm khó tan, polypeptide amino acid với khối lượng đủ đảm bảo hoạt động sống bình thường nấm men, cho hoàn chỉnh vị bia cho tạo bọt Protease sử dụng công nghiệp bia, phần lớn enzyme trung tính Các enzyme β-glucanase pentosanase, hịa tan màng tế bào nội nhũ đại mạch có khả lên men nhanh dịch đường Neutrase chế phẩm protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis Neutrase chứa protease trung tính, hầu hết chế phẩm thương mại khác chứa lẫn protease kiềm Neutrase khơng chứa α-amylase Loại enzyme có nhiệt độ thích hợp vùng 45 – 55oC pH 5,5 - 7,5 3.1.2 Trong công nghệ chế biến thủy sản Đã có nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng enzyme protease Bacillus subtilis chế biến thủy sản như: sản xuất bột đạm thủy phân từ thịt cá mối Kết nghiên cứu cho thấy enzyme protease Bacillus subtilis thủy phân mạnh mẽ thịt cá mối hồn tồn sử dụng enzyme sản xuất bột đạm thủy phân Khi bổ sung protease Bacillus subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp thịt cá mối thủy phân 50oC, pH tự nhiên thịt cá hỗn hợp thủy phân có tiêu cảm quan hóa học - 67 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm tốt Ðể ức chế trình gây thối vi sinh vật trình thủy phân bổ sung vào hỗn hợp thủy phân muối ăn với nồng độ 3% sorbitol với nồng độ 4% hay ethanol với nồng độ 8% Sản xuất nước mắm ngắn ngày nghiên cứu ứng dụng vào sản xuất chế phẩm protease thu nhận từ vi khuẩn Để tăng trình thủy phân rút ngắn thời gian chế biến nước mắm người ta tiến hành tạo nhiệt độ thích hợp cho protease hoạt động khoảng 50oC giảm độ mặn ban đầu khối cá làm tăng diện tích tiếp xúc protease với cá cách xay nhuyễn cá… Khi cho muối vào chượp cá nhiệt độ thủy phân 43 - 45oC làm giảm hoạt độ protease thủy phân cá Ở điều kiện thích hợp, việc bổ sung protease giúp rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm từ - tháng xuống 30 - 40 ngày Nước mắm ngắn ngày có hàm lượng đạm cao, nhiên hương vị, độ ngon nước mắm dài ngày Người ta khắc phục nhược điểm cách pha trộn nước mắm ngắn ngày với nước mắm dài ngày bổ sung thêm hương vị vào nước mắm ngắn ngày Ngồi nhiệt độ thích hợp, độ xay nhuyễn cá bổ sung muối phù hợp làm giảm đáng kể thời gian lên men sản xuất nước mắm đảm bảo chất lượng nước mắm thành phẩm Ngoài ra, enzyme α-amylase sử dụng sản xuất siro fructose, sản xuất bánh kẹo, bổ sung α-amylase protease vào thức ăn chăn nuôi nhằm tăng khả tiêu hóa hệ số sử dụng thức ăn… 3.2 Ứng dụng cơng nghiệp thuộc da Q trình chế biến da bao gồm số công đoạn ngâm ướt, tẩy lông, làm mềm da thuộc da Thông thường phương pháp thuộc da thường dùng hóa chất độc hại natri sulfide, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường nước thải nhà máy thải sông Việc sử dụng enzyme để thay hóa chất thành cơng việc nâng cao chất lượng da làm giảm ô nhiễm mơi trường Enzyme protease có khả làm mềm da nhờ thủy phân phần protein da, chủ yếu collagen, thành phần làm cho da bị cứng Kết loại bỏ khỏi da chất nhớt làm cho da có độ mềm dẻo định, tính chất hồn thiện sau thuộc da Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease phân lập từ quan tiêu hóa động vật - 68 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm Hiện nay, việc đưa protease tách từ vi khuẩn (Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis), nấm mốc (Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus) xạ khuẩn vào công nghiệp thuộc da đem lại nhiều kết chiếm vị trí quan trọng 3.3 Ứng dụng công nghiệp dệt Proteinase vi sinh vật sử dụng để làm tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo tạo dung dịch casein, gelatin) để sợi bóng, dễ nhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serine làm dính bết sợi tơ tự nhiên, làm bong tách rời loại tơ tằm, làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng 3.3 Ứng dụng công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa Protease thành phần thiếu tất loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng gia đình đến chất làm kính giả kem đánh Việc ứng dụng enzyme vào chất tẩy rửa nhiều bột giặt Các protease thích hợp để bổ sung vào chất tẩy rửa thường có tính đặc hiệu chất rộng để dễ dàng loại bỏ vết bẩn thức ăn, máu chất thể người tiết Một tiêu chuẩn quan trọng khác protease dùng chất tẩy rửa hoạt động tốt điều kiện nhiệt độ pH cao phải thích hợp với tác nhân oxy hóa chất kìm hãm có thành phần chất tẩy rửa Tham số đóng vai trị chìa khóa cho việc bổ sung protease vào chất tẩy rửa pI chúng Một protease phù hợp pI trùng với pH dung dịch chất tẩy rửa Subtilisin đáp ứng đầy đủ yêu cầu khắt khe Chất tẩy rửa có chứa enzyme vi khuẩn sản xuất vào năm 1956 với tên BIO-40 thu nhận từ Bacillus subtilis Đến năm 1963, Novo Industry A/S giới thiệu alcalase tên thương mại BIOTEX chiết xuất từ Bacillus licheniformis Và đến gần đây, tất protease bổ sung vào chất tẩy dùng thị trường serine protease sản xuất từ chủng Bacillus (Rao cộng sự, 1998; Thangam, 2002), chủ yếu từ Bacillus subtilis Trên giới, năm người ta sử dụng 89% enzyme cho ngành công nghiệp tẩy rửa Trong hai cơng ty lớn Novo Nordisk Genencor - 69 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm Internatinal năm cung cấp cho toàn cầu 95% lượng enzyme protease (Gupta cộng sự, 2002) 3.4 Ứng dụng xử lý ô nhiễm môi trường Việc ứng dụng enzyme ngoại bào vi sinh vật nói chung vi khuẩn Bacillus subtilis nói riêng nghiên cứu với nhiều triển vọng có ứng dụng định việc xử lý ô nhiễm môi trường Phương pháp xử lý enzyme trung gian hai phương pháp truyền thống, bao gồm quy trình hố học sở hoạt động chất xúc tác có chất sinh học Enzyme hoạt động chất nhiễm đặc biệt khó xử lý để loại chúng cách kết tủa chuyển chúng thành dạng khác Ngồi chúng làm thay đổi đặc tính chất thải đưa chúng dạng dễ xử lý chuyển thành sản phẩm có giá trị Phương pháp xử lý enzyme so với phương pháp xử lý thơng thường có ưu điểm sau: • Được áp dụng hợp chất sinh học khó xử lý • Tác dụng vùng nồng độ chất ô nhiễm cao thấp • Một số enzyme riêng biệt có tác dụng phạm vi pH rộng, nhiệt độ độ mặn • Không gây biến động bất thường • Không gây cản trở phá vỡ cân sinh thái Protease thủy phân protein có chất thải, để sản xuất dung dịch đặc chất rắn khơ có giá trị dinh dưỡng cho cá vật nuôi Protease thủy phân protein không tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng hấp thụ lên chất rắn, cắt chuỗi polypeptit tạo thành liên kết lỏng bề mặt Sau đó, q trình hồ tan phần rắn xảy với tốc độ chậm phụ thuộc vào khuếch tán enzyme lên bề mặt chất tạo phần nhỏ Chính tính chất mà protease sử dụng, mặt để tận dụng phế thải từ nguồn protein để phế thải không cịn tác nhân - 70 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm gây ô nhiễm môi trường, mặt khác để xử lý Các phế thải protein tồn đọng dạng chảy thành dạng dung dịch rửa trơi khơng cịn mùi thối Lơng tạo nên 5% trọng lượng thể gia cầm coi nguồn protein cao tạo nên cấu trúc keratin cứng phá huỷ hồn tồn Lơng hồ tan sau xử lý với NaOH, làm tan học enzyme thuỷ phân, protease kiềm từ Bacillus subtilis tạo thành sản phẩm có dạng bột, màu xám với hàm lượng protein cao sử dụng làm thức ăn Các enzyme amylase có ý nghĩa quan trọng việc phân hủy phế thải chứa nguồn tinh bột từ làng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sản ngô khoai, sắn Từ phế thải lương thực này, nhờ amylase dùng để sản xuất ethanol Cũng nhờ enzyme đường hoá α-amylase glucoamylase, từ phế thải lương thực chứa tinh bột dây chuyền, quy trình chế biến thức ăn sản xuất màng bao gói có tính chất phân huỷ quang học sinh học α-amylase trước tiên dùng để phá vỡ phân tử tinh bột mạch dài để tạo thành mảnh nhỏ Tiếp theo glucoamylase tác dụng tạo thành glucose thông qua q trình đường hố (hơn 90% tinh bột chuyển thành đường) Glucose lên men thành acid lactic nhờ chủng vi sinh vật sản sinh acid lactic Acid lactic cuối thu lại, tinh dùng để sản xuất màng bao gói kiểu Sản phẩm cuối chứa 95% acid lactic 5% chất thải an tồn với mơi trường Ở nước ta, việc nghiên cứu sử dụng enzyme vi khuẩn amylase để xử lý nước thải làng nghề làm bún, bánh đa có kết đáng kể - 71 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua q trình thực đề tài này, tơi rút số kết luận sau: • Bacillus subtilis có nhiều ưu điểm lồi vi sinh vật khác dễ nuôi cấy, sinh trưởng tốt, phát triển nhanh, khơng sinh độc tố an tồn đưa vào sản xuất sử dụng chế phẩm từ lồi vi khuẩn này, có khả kháng khuẩn cao chịu ảnh hưởng bất lợi từ môi trường • Bacillus subtilis có khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào enzyme ý ứng dụng vào đời sống sản xuất công nghiệp enzyme amylase protease • Bacillus subtilis có khả sinh lượng enzyme ngoại bào lớn • Các enzyme ngoại bào Bacillus subtilis có đặc tính vượt trội hẳn enzyme vi sinh vật khác khả chịu nhiệt độ tương đối cao, pH hoạt động từ trung tính đến kiềm, khả thủy phân chất mạnh mẽ • Qui trình tách chiết thu nhận enzyme ngoại bào tương đối dễ dàng, tận dụng nguồn chất từ phế thải phụ phẩm làm giảm giá thành chế phẩm, tăng lợi nhuận, làm giảm đáng kể việc thải bỏ chất thải hữu vào môi trường • Các enzyme ngoại bào Bacillus subtilis ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác như: ngành cơng nghiệp thực phẩm điển hình ngành cơng nghiệp sản xuất bia, sản xuất nước mắm bột đạm thủy phân từ cá ; ngành công nghiệp dệt; ngành công nghiệp thuộc da; công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa và ứng dụng lĩnh vực xử lý ô nhiễm môi trường - 72 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm 4.2 Kiến nghị Cần nghiên cứu làm thực nghiệm nghiên cứu Bacillus subtilis như: • Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả sinh tổng hợp mạnh enzyme ngoại bào • Khảo sát hoạt tính khả thủy phân chất khác từ chủng phân lập tuyển chọn • Tối ưu hóa điều kiện ni cấy để thu nhận enzyme ngoại bào có hoạt độ cao • Đưa vào sản xuất enzyme ngoại bào từ chủng Bacillus subtilis ứng dụng vào thực tiễn vào sản xuất đời sống • Nghiên cứu điều kiện bảo quản tối ưu để chế phẩm enzyme khơng bị giảm hoạt tính trình bảo quản sử dụng lâu - 73 - ... chất mà enzyme phân hủy vào mơi trường, ví dụ: sinh tổng hợp amylase bổ sung vào mơi trường tinh bột; protease bổ sung protein; pectinase bổ sung pectin cellulase bổ sung cellulose… − Thứ hai,... amin + Ảnh hưởng nguồn khoáng dinh dưỡng: nguyên tố đa lượng vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng tổng hợp enzyme amylase vi sinh vật Mg2+ ảnh hưởng đến độ bền enzyme; phosphore ảnh hưởng. .. Đối tượng nghiên cứu: vi khuẩn Bacillus subtilis Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu tổng quan enzyme ngoại bào Bacillus subtilis V Phương pháp nghiên cứu Đọc tài liệu tham khảo nghiên cứu nước nước