Tinh sạch prodigiosin từ dịch nuôi cấy serratia marcescens trong môi trường peptone glycerol

Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hồi Hương – Khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường Trường Đại Học Công Nghệ Tp.Hồ Chí Minh Những kết có đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án hồn tồn trung thực Tơi xin chịu trách nhiệm hồn tồn đồ án tốt ngiệp TP.HCM, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực Vũ Hoàng Minh Ngọc i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, bậc sinh thành nuôi nấn, dạy dỗ dành cho lời khuyên nhủ bổ ích, định hướng đến điều tốt đẹp sống Em xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Cơng nghệ Tp.HCM hết lịng truyền đạt tảng kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em khoảng thời gian học tập thực đồ án tốt nghiệp Đặc biệt, em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hồi Hương, người thầy đáng kính, tận tâm hướng dẫn em nội dung, phương pháp kỹ tiến hành thí nghiệm để em hồn thành đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn cô Đỗ Thị Tuyến cung cấp vi khuẩn thị tạo điều kiện giúp em thực quét phổ UV/VIS Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành thầy Nguyễn Trung Dũng tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đồ án phịng thí nghiệm Khoa Mơi trường Công nghệ sinh học, Trường Đại học Kỹ thuật Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh Em xin cảm ơn quý thầy cô hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án tốt nghiệp em Xin cảm ơn anh chị, bạn em động viên giúp đỡ khoảng thời gian em thực đồ án tốt nghiệp trường Em xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực Vũ Hoàng Minh Ngọc ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮC iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH v DANH MỤC CÁC BẢNG vii Tính cấp thiết đề tài viii Mục đích nghiên cứu viii Nhiệm vụ nghiên cứu viii Các kết đạt đề tài viii Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan sắc tố có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật có hoạt tính sinh học 1.1.1 Khái niệm .1 1.1.2 Phân loại .3 1.2 Tổng quan Prodigiosin .3 1.2.1 Nguồn gốc prodigiosin 1.2.2 Cấu trúc đặc điểm prodigiosin .4 1.2.3 Cơ chế tổng hợp prodigiosin 1.3 Hoạt động sinh học prodigiosin 12 1.3.1 Khả kháng khuẩn .12 1.3.2 Khả kháng nấm 12 1.3.3 Khả diệt sâu .12 1.3.4 Hoạt động ức chế miễn dịch 12 1.3.5 Hoạt động kháng tế bào .14 1.4 Yếu tố ảnh hưởng tổng hợp đến prodigiosin 14 1.5 Thu nhận tinh định lượng prodigiosin 16 Chương II: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 19 i Đồ án tốt nghiệp 2.1.1 Thời gian .19 2.1.2 Địa điểm 19 2.2 Vật liệu - hóa chất - thiết bị 19 2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia mascescens 19 2.2.2 Nguồn vi khuẩn thị .19 2.2.3 Mơi trường ni cấy hóa chất 19 2.2.4 Dụng cụ, thiết bị 20 2.3 Bố trí thí nghiệm 21 2.3.1 Mục đích 21 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Phương pháp xử lý canh trường sau lên men 22 Hiệu suất trích ly lỏng – lỏng prodigiosin tổng hợp mơi trường PG 22 2.4.2 Phương pháp tách chiết prodigiosin 25 2.4.3 Phương pháp kiểm tra hợp chất sau tách chiết 26 2.4.4 Phương pháp tinh prodigiosin sắc ký cột 26 2.4.5 Phương pháp LC/MS/MS: 27 2.4.6 Phương pháp Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 27 2.4.7 Phương pháp khảo sát điều kiện bảo quản 29 Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .31 3.1 Kết xử lý canh trường sau lên men 31 3.1.1 Xử lý nhiệt 31 Hiệu suất trích ly lỏng – lỏng prodigiosin tổng hợp môi trường PG 33 3.1.2 Xử lý acid: 33 3.2 Kết kiểm tra hợp chất trước sau trích lý lỏng – lỏng 36 3.3 Kết tinh prodigiosin Sắc ký cột 39 3.4 Kết khảo sát LC/MS/MS STSTLLL STSSKC 47 3.5 Khả kháng khuẩn STSTLLL STSSKC 47 ii Đồ án tốt nghiệp 3.6 Sự ảnh hưởng điều kiện bảo quản lên prodigiosin .54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .59 PHỤ LUC 75 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮC STLLL: sau trích ly lỏng lỏng SSKC: sau sắc ký cột PG: peptone glycerol iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc prodigiosin (Krishna, 2008) 12 Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 13 Hình 1.3 So sánh cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno cộng sự, 2001) 16 Hình 1.4: Con đường đề xuất cho trình sinh tổng hợp prodigiosin 19 Hình 1.5: Hoạt tính kháng khuẩn prodigiosin (Ramina Samira, 2009) A Đối với Staphylococcus aureus; B Đối với Echerichia coli 20 Hình 2.1 : Sơ đồ thí nghiệm khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất thứ cấp 31 Hình 2.2 sơ đồ trích ly thơ prodigiosin từ canh trường ni cấy 33 Hình 2.3: Cách đục giếng thạch thí nghiệm kháng khuẩn 37 Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm hiệu suất trích ly lỏng lỏng sau xử lý nhiệt canh trường 650C 39 Hình 3.1: Kết sau 24h cấy trang mẫu đun 650C khơng pha lỗng 42 Hình 3.2 Khả tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens SH1 43 thời điểm giờ, 24 pH pH 43 Hình 3.3: Nồng độ prodigiosin canh trường xử lí acid thời điểm 44 Hình 3.3: Kết sau sắc ký cột hệ dung môi Methanol:chloroform:acetone (2:3:4, v:v) 50 Hình 3.4: Kết thử nghiệm Biuret cho màu tím dãy sắc tố sử dụng dung môi Methanol:chloroform:acetone (2:3:4, v:v) 51 Hình 3.5: Kết sau sắc ký cột hệ dung môi Petrolium ether : Aceton (7:3 ; v:v) 52 Hình 3.6: Kết thử nghiệm Biuret cho màu tím dãy sắc tố với pha động dung môi Petrolium ether : Aceton (7:3 ; v:v) 52 Hình 3.8: Kết chạy TLC cho phân đoạn 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10+11 A) trước phun thuốc thử Dragendorff B) sau phun thuốc thử Dragendorff 54 v Đồ án tốt nghiệp Hình 3.9: Kết chạy TLC cho phân đoạn 1+2+3, 4+5, 6, 7, 8+9, 10+11 A) trước phun thuốc thử Dragendorff B) sau phun thuốc thử Dragendorff 56 Hình 3.10 : kết quét khối phổ LC/MS/MS : A) mẫu STLLL, B) mẫu SSKC 60 Hình 3.11: Kết đối kháng mẫu STLLL chủng thị 61 Hình 3.12: Khả ức chế tăng trưởng S.aureus E.coli mẫu STLLL 62 Hình 3.13: Kết đối kháng mẫu SSKC chủng thị A,B) SSKC đối 63 Hình 3.14: Khả ức chế tăng trưởng S.aureus E.coli mẫu SSKC 64 Hình 3.15: Kết đối kháng đối chứng dương chloramphenicol 30µg/ml chủng thị.A) S.aureus B) E.coli 66 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Danh sách số sắc tố sản xuất vi sinh vật Bảng 1.2: Xác định cấu trúc số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Bảng 1.2: Ảnh hưởng prodigiosin đến khả tồn tế bào miễn dịch (Hwanmook cộng sự, 2003) 16 Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát điều kiện bảo quản (trong ngày) 34 Bảng 3.1: Số tế bào sống sót giá trị OD qua mức nhiệt độ xử lý canh trường sau lên men 36 Bảng 3.2: Độ hấp thụ sắc tố OD 499nm, độ hấp thụ tế bào OD 620nm 40 Bảng 3.3: Lượng prodigiosin/tế bào chủng SH1 41 Bảng 3.4: Kết giá trị OD535 hiệu chỉnh sau trích ly lỏng lỏng 41 Bảng 3.5: Định tính hợp chất STLT STLLL 42 Bảng 3.5: Tóm tắc phân đoạn sau sắc ký cột 49 Bảng 3.7: Khả kháng khuẩn STSTLLL VÀ STSSKC: 55 Bảng 3.8: Kết đo OD535 xử lý thông kê kết quét UV-VIS: 61 vii Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Prodigiosin sắc tố đỏ có chất alkaloid khảo sát chủ yếu lên men Serratia marcescens môi trường peptone glycerol Serratia marcescens lên men môi trường huyền phù đậu phộng lại khó tinh hơn, mơi trừng chứa nhiều chất béo, dễ bị oxi hóa gây biến đổi hợp chất prodigiosin ban đâu Dựa sở mà người thực đề tài chọn hướng cho đồ án tốt nghiệp : “Tinh prodigiosin từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens môi trường peptone glycerol” Mục đích nghiên cứu Thiết lập quy trình ni tăng sinh prodigiosin từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens môi trường nuôi cấy pepton glycerol Nhiệm vụ nghiên cứu - Xử lý dịch nuôi cấy sau lên men - Khảo sát điều kiện bào quản sau trích ly rắn, sau trích ly lỏng lỏng (STLLL) sau sắc ký cột (SSKC) - Khảo sát hoạt tính sinh học sản phẩm sau trích ly lỏng lỏng sắc ký cột - Đề nghị quy trình sản xuất thu hồi prodigiosin Các kết đạt đề tài - Tìm cách xử lý canh trường sau lên men để đảm bảo an toàn sinh học - Quy trình trích ly thu nhận prodigiosin - Kết khảo sát tính sinh học cho sắc tố sau trích ly sau tinh sắc ký cột có khả kháng khuẩn - Tìm điều kiện bảo quản tối ưu cho prodigiosin viii Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ Thành phần mơi trường nutrient agar (Gram/Lít) Beef extract 3,00 Peptone 5,00 Agar 18,00 Môi trường Peptone glycerone agar Peptone 5,00 gram/lít Glycerone 10,00 ml/lít Agar 18,00 gram/lít Mơi trường Peptone glycerone broth Peptone 5,00 gram/lít Glycerone 10,00 ml/lít 75 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Canh trường lên men vi khuẩn Serrtia marcescens SH1 sau xử lý nhiệt Hình 2: Sau q trình trích ly lỏng- lỏng với hệ dung mơi petroleum ether: nước muồi bảo hịa (2:3, v:v) 76 Đồ án tốt nghiệp Hình 3: Thí nghiệm hiệu suất STLLL, giai đoạn chuẩn bị mẫu đo OD535 Hình 4: Quá trình tinh sắc ký cột cho mẫu STLLL với dung môi Nhexan:ethyl acetate (2:1,v:v) 77 Đồ án tốt nghiệp Hình 5: Kết quét UV-VIS cho mẫu SSKC phân đoạn thứ Hình 6: Máy quét quang phổ UV-VIS 78 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC SỐ LIỆU THỐNG KÊ Nghiệm xử lý nhiệt độ cho canh trường sau lên men: + Nồng độ prodigiosin mg/ml DATA; INPUT NONGDO $ GIATRIOD; CARDS; 10_1_DC 8.433 10_1_DC 8.370 10_1_DC 8.451 10_1_50 10.878 10_1_50 10.823 10_1_50 10.914 10_1_65 11.560 10_1_65 11.532 10_1_65 11.632 10_1_80 10.169 10_1_80 10.105 10_1_80 10.205 10_2_DC 9.261 10_2_DC 8.534 10_2_DC 8.988 10_2_50 11.988 10_2_50 11.351 10_2_50 11.170 10_2_65 13.805 10_2_65 14.260 10_2_65 13.169 10_2_80 10.443 10_2_80 9.988 10_2_80 11.079 ; PROC ANOVA; CLASS NONGDO; MODEL GIATRIOD = NONGDO; MEANS NONGDO / LSD; MEANS NONGDO / LSD ALPHA = 0.05; TITLE ‘OD’; RUN; Class Level Information Class NONGDO Levels Values 10_1_50 10_1_65 10_1_80 10_1_DC 10_2_50 10_2_65 10_2_80 10_2_DC 79 Đồ án tốt nghiệp Dependent Variable: GIATRIOD Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Model 58.16197533 8.30885362 71.53 Error 16 1.85841600 0.11615100 Corrected Total 23 60.02039133 R-Square Coeff Var Root MSE GIATRIOD Mean 0.969037 3.181318 0.340809 10.71283 Source DF Anova SS Mean Square F Value NONGDO 58.16197533 8.30885362 71.53 Pr > F F F Model 11 5068503.222 460773.020 806.60 F DOPHALOANG 11 5068503.222 460773.020 806.60 F Đồ án tốt nghiệp Model 22.60998292 7.53666097 Error 14.17754400 1.77219300 Corrected Total 11 R-Square 0.614610 Source DF NHIETDO 4.25 0.0451 36.78752692 Coeff Var 10.31800 Anova SS 22.60998292 Root MSE 1.331237 Mean Square 7.53666097 PRODI Mean 12.90208 F Value 4.25 Pr > F 0.0451 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 1.772193 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 2.5065 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NHIETDO A A A A A 14.744 Mau100_6 13.139 Mau100_3 12.844 Mau10_65 10.881 Mau10_37 B B B B B Thí nghiệm kháng khuẩn: S.aureus: DATA; INPUT MAU $ SOLIEU; CARDS; SKC1 0.800 SKC1 0.900 SKC1 0.500 TLLL1 1.000 TLLL1 0.800 TLLL1 0.600 SKC2 0.600 SKC2 0.500 SKC2 0.400 TLLL2 0.500 TLLL2 0.400 TLLL2 0.400 SKC3 0.400 SKC3 0.500 SKC3 0.300 84 Đồ án tốt nghiệp TLLL3 0.400 TLLL3 0.400 TLLL3 0.000 SKC4 0.200 SKC4 0.400 SKC4 0.400 TLLL4 0.200 TLLL4 0.000 TLLL4 0.000 SKC5 0.000 SKC5 0.000 SKC5 0.000 TLLL5 0.000 TLLL5 0.000 TLLL5 0.000 SKC6 0.000 SKC6 0.000 SKC6 0.000 TLLL6 0.000 TLLL6 0.000 TLLL6 0.000 ; PROC ANOVA; CLASS MAU; MODEL SOLIEU = MAU; MEANS MAU / LSD; MEANS MAU / LSD ALPHA = 0.05; TITLE ‘KHANG TOT NHAT’; RUN; KHANG TOT NHAT Class Levels MAU 12 19:42 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information 14 Values SKC1 SKC2 SKC3 SKC4 SKC5 SKC6 TLLL1 TLLL2 TLLL3 TLLL4 TLLL5 TLLL6 Dependent Variable: SOLIEU Source Model Error Corrected Total Sum of Squares Mean Square 2.76555556 0.25141414 0.37333333 0.01555556 35 3.13888889 DF 11 24 R-Square 0.881062 Source MAU DF 11 Coeff Var 42.35839 Root MSE 0.124722 Anova SS 2.76555556 Mean Square 0.25141414 F Value 16.16 SOLIEU Mean 0.294444 F Value 16.16 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 0.015556 Critical Value of t 2.06390 Least Significant Difference 0.2102 85 Pr > F F F Model 11 9.62475556 0.87497778 72.56 F