Tinh sạch prodigiosin từ dịch nuôicấy serratia marcescens trong môi trường peptone glycerol

Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hồi Hương – Khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường Trường Đại Học Công Nghệ Tp.Hồ Chí Minh Những kết có đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án hồn tồn trung thực Tơi xin chịu trách nhiệm hồn tồn đồ án tốt ngiệp TP.HCM, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực Vũ Hoàng Minh Ngọc iii Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, bậc sinh thành nuôi nấn, dạy dỗ dành cho lời khuyên nhủ bổ ích, định hướng đến điều tốt đẹp sống Em xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ Tp.HCM hết lòng truyền đạt tảng kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em khoảng thời gian học tập thực đồ án tốt nghiệp Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hồi Hương, người thầy đáng kính, tận tâm hướng dẫn em nội dung, phương pháp kỹ tiến hành thí nghiệm để em hồn thành đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn cô Đỗ Thị Tuyến cung cấp vi khuẩn thị tạo điều kiện giúp em thực quét phổ UV/VIS Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành thầy Nguyễn Trung Dũng tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đồ án phòng thí nghiệm Khoa Mơi trường Công nghệ sinh học, Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ TP Hồ Chí Minh Em xin cảm ơn quý thầy cô hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án tốt nghiệp em Xin cảm ơn anh chị, bạn em động viên giúp đỡ khoảng thời gian em thực đồ án tốt nghiệp trường Em xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực Vũ Hoàng Minh Ngọc iii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮC iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH v DANH MỤC CÁC BẢNG vii Tính cấp thiết đề tài viii Mục đích nghiên cứu viii Nhiệm vụ nghiên cứu viii Các kết đạt đề tài viii Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan sắc tố có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật có hoạt tính sinh học 1.1.1 Khái niệm .1 1.1.2 Phân loại .3 1.2 Tổng quan Prodigiosin .3 1.2.1 Nguồn gốc prodigiosin 1.2.2 Cấu trúc đặc điểm prodigiosin .4 1.2.3 Cơ chế tổng hợp prodigiosin 1.3 Hoạt động sinh học prodigiosin 12 1.3.1 Khả kháng khuẩn .12 1.3.2 Khả kháng nấm 12 1.3.3 Khả diệt sâu .12 1.3.4 Hoạt động ức chế miễn dịch 12 1.3.5 Hoạt động kháng tế bào .14 1.4 Yếu tố ảnh hưởng tổng hợp đến prodigiosin 14 1.5 Thu nhận tinh định lượng prodigiosin 16 Chương II: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 iii Đồ án tốt nghiệp 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 19 iii Đồ án tốt nghiệp 2.1.1 Thời gian .19 2.1.2 Địa điểm 19 2.2 Vật liệu - hóa chất - thiết bị 19 2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia mascescens 19 2.2.2 Nguồn vi khuẩn thị .19 2.2.3 Môi trường ni cấy hóa chất 19 2.2.4 Dụng cụ, thiết bị 20 2.3 Bố trí thí nghiệm 21 2.3.1 Mục đích 21 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Phương pháp xử lý canh trường sau lên men 22 Hiệu suất trích ly lỏng – lỏng prodigiosin tổng hợp môi trường PG 22 2.4.2 Phương pháp tách chiết prodigiosin 25 2.4.3 Phương pháp kiểm tra hợp chất sau tách chiết 26 2.4.4 Phương pháp tinh prodigiosin sắc ký cột 26 2.4.5 Phương pháp LC/MS/MS: 27 2.4.6 Phương pháp Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 27 2.4.7 Phương pháp khảo sát điều kiện bảo quản 29 Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .31 3.1 Kết xử lý canh trường sau lên men 31 3.1.1 Xử lý nhiệt 31 Hiệu suất trích ly lỏng – lỏng prodigiosin tổng hợp môi trường PG 33 3.1.2 Xử lý acid: 33 3.2 Kết kiểm tra hợp chất trước sau trích lý lỏng – lỏng 36 3.3 Kết tinh prodigiosin Sắc ký cột 39 3.4 Kết khảo sát LC/MS/MS STSTLLL STSSKC 47 iii Đồ án tốt nghiệp 3.5 Khả kháng khuẩn STSTLLL STSSKC 47 iii Đồ án tốt nghiệp 3.6 Sự ảnh hưởng điều kiện bảo quản lên prodigiosin .54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .59 PHỤ LUC 75 33 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮC STLLL: sau trích ly lỏng lỏng SSKC: sau sắc ký cột PG: peptone glycerol 44 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc prodigiosin (Krishna, 2008) 12 Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 13 Hình 1.3 So sánh cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno cộng sự, 2001) 16 Hình 1.4: Con đường đề xuất cho trình sinh tổng hợp prodigiosin 19 Hình 1.5: Hoạt tính kháng khuẩn prodigiosin (Ramina Samira, 2009) A Đối với Staphylococcus aureus; B Đối với Echerichia coli 20 Hình 2.1 : Sơ đồ thí nghiệm khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất thứ cấp 31 Hình 2.2 sơ đồ trích ly thơ prodigiosin từ canh trường ni cấy 33 Hình 2.3: Cách đục giếng thạch thí nghiệm kháng khuẩn 37 Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm hiệu suất trích ly lỏng lỏng sau xử lý nhiệt canh trường 650C 39 Hình 3.1: Kết sau 24h cấy trang mẫu đun 650C khơng pha lỗng 42 Hình 3.2 Khả tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens SH1 43 thời điểm giờ, 24 pH pH 43 Hình 3.3: Nồng độ prodigiosin canh trường xử lí acid thời điểm 44 Hình 3.3: Kết sau sắc ký cột hệ dung môi Methanol:chloroform:acetone (2:3:4, v:v) 50 Hình 3.4: Kết thử nghiệm Biuret cho màu tím dãy sắc tố sử dụng dung môi Methanol:chloroform:acetone (2:3:4, v:v) 51 Hình 3.5: Kết sau sắc ký cột hệ dung môi Petrolium ether : Aceton (7:3 ; v:v) 52 Hình 3.6: Kết thử nghiệm Biuret cho màu tím dãy sắc tố với pha động dung môi Petrolium ether : Aceton (7:3 ; v:v) 52 55 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8: Kết chạy TLC cho phân đoạn 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10+11 A) trước phun thuốc thử Dragendorff B) sau phun thuốc thử Dragendorff 54 66 PHỤ LỤC THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ Thành phần mơi trường nutrient agar (Gram/Lít) Beef extract 3,00 Peptone 5,00 Agar 18,00 Môi trường Peptone glycerone agar Peptone 5,00 gram/lít Glycerone 10,00 ml/lít Agar 18,00 gram/lít Mơi trường Peptone glycerone broth Peptone 5,00 gram/lít Glycerone 10,00 ml/lít PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Canh trường lên men vi khuẩn Serrtia marcescens SH1 sau xử lý nhiệt Hình 2: Sau q trình trích ly lỏng- lỏng với hệ dung mơi petroleum ether: nước muồi bảo hòa (2:3, v:v) Hình 3: Thí nghiệm hiệu suất STLLL, giai đoạn chuẩn bị mẫu đo OD535 Hình 4: Quá trình tinh sắc ký cột cho mẫu STLLL với dung mơi Nhexan:ethyl acetate (2:1,v:v) Hình 5: Kết qt UV-VIS cho mẫu SSKC phân đoạn thứ Hình 6: Máy quét quang phổ UV-VIS PHỤ LỤC SỐ LIỆU THỐNG KÊ Nghiệm xử lý nhiệt độ cho canh trường sau lên men: + Nồng độ prodigiosin mg/ml DATA; INPUT 10 _1 10 8 _1 10 _1 10 10 _1 10 _1 10 91 11 56 11 _1 10 _1 10 _1 10 _1 10 _1 10 _1 10 _1 10 _2 10 _2 10 _2 10 _2 10 _2 10 _2 10 _2 10 87 10 82 10 53 11 63 10 16 10 10 10 20 8 11 98 11 35 11 17 13 80 14 _2 10 _2 10 26 13 16 10 _2 _8 07 _2 10 _2 10 NONGDO $ GIATRIOD; CARDS; 44 11 ; PROC ANOVA; CLASS NONGDO; MODEL GIATRIOD = NONGDO; MEANS NONGDO / LSD; MEANS NONGDO / LSD ALPHA = 0.05; TITLE ‘OD’; RUN; Class Level Information Class NONGDO Levels Values 10_1_50 10_1_65 10_1_80 10_1_DC 10_2_50 10_2_65 10_2_80 10_2_DC De pen S r M el E r C e S m D S M F Pr F u e V > < 1 Source RSqu 0.9 690 C R G o o I D Ano Mea Pr F va n > NONGDO 58.16197533 8.30885362 71.53 F Model Error Corre To 11 cted ta 36.78752 R P R S O Sourc D F e F Va NHIET DO Alpha Error Degrees of Freedom Error Cr Meant 77 it Di Le as ff 0.05 Means with the same letter are not significantly different t Grouping B B B B B A A A A A Thí nghiệm kháng khuẩn: S.aureus: DATA; INPUT MAU $ SOLIEU; CARDS; SK C1 SK 0 TL LL TL C2 SK C2 SK 0 C1 SK LL TL LL SK C2 TL LL TL LL TL LL SK 0 0 0 C3 SK C3 SK 0 C3 Mean 3 M a M a M a M a N NHIETDO TL LL TL 0 C4 SK C4 SK 0 C4 TL LL TL 0 C5 SK C5 SK 0 C5 TL LL TL 0 C6 SK C6 SK 0 LL TL LL SK 0 LL TL LL SK 0 LL TL LL SK 0 C6 TL LL TL 0 LL TL ; LL PROC ANOVA; CLASS MAU; MODEL SOLIEU = MAU; MEANS MAU / LSD; MEANS MAU / LSD ALPHA = 0.05; TITLE ‘KHANG TOT NHAT’; RUN; KHANG TOT NHAT Class Levels MAU 12 19:42 Thursday, August 16, 2016 14 The ANOVA Procedure Class Level Information Values SKC1 SKC2 SKC3 SKC4 SKC5 SKC6 TLLL1 TLLL2 TLLL3 TLLL4 TLLL5 TLLL6 Dependent Variable: SOLIEU So urc Mo del Err or Cor rec So MA urc U SqF P u V r< R0.8 Sq 81 D A M F 2n e0 V Sum of D F 1 C o4 R S o O0 P < r Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 0.015556 Critical Value of t 2.06390 Least Significant Diference 0.2102 Means with the same letter are not signifcantly diferent t M N M Grouping 0.8e T A A 00 L A A 0.7 S 33 K B S B K C B T L C B C B S K C B C B S K C C D T L D E D T L E E S K E E S K E E T L E E T L E.coli: DATA; INPUT MAU $ SOLIEU; CARDS; SK C1 SK 1 C1 SK C1 TLL 1 C2 SK C2 SK TLL L2 TLL L2 TLL L2 SK 0 C3 SK C3 SK 0 C3 TLL L3 TLL L3 TLL L3 SK 0 C4 SK C4 SK 0 C4 L1 TLL L1 TLL L1 SK 1 TLL L4 TLL L4 TLL L4 SK C5 SK 0 C5 SK C5 TLL 0 C6 SK C6 TLL 0 L5 TLL L5 TLL L5 SK C6 SK 0 L6 TLL L6 TLL L6 ; PROC ANOVA; CLASS MAU; MODEL SOLIEU = MAU; MEANS MAU / LSD; MEANS MAU / LSD ALPHA = 0.05; TITLE ‘KHANG TOT NHAT’; RUN; KHANG TOT NHAT 19:42 Thursday, August 16, 2016 18 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU 12 SKC1 SKC2 SKC3 SKC4 SKC5 SKC6 TLLL1 TLLL2 TLLL3 TLLL4 TLLL5 TLLL6 Number of Observations Read Number of Observations Used So urc Mo del Err or Cor rec 36 36 Sum of D F 1 S M F Pr q e > < 2.04 0 RC RSO Sq o o LI uar e o EU So D A M F Pr MA < urc F n e0 > U 2.04 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 0.012058 Critical Value of t 2.06390 Least Significant Diference 0.185 Means with the same letter are not signifcantly diferent t Grouping Mean N MAU A A B C C D E E E D F F F F F F 0 3 3 3 3 3 3 S K C S K S K C T L L L S K S K C T L T L Đồ án tốt nghiệp 89 ... đề tài Prodigiosin sắc tố đỏ có chất alkaloid khảo sát chủ yếu lên men Serratia marcescens môi trường peptone glycerol Serratia marcescens lên men mơi trường huyền phù đậu phộng lại khó tinh hơn,... biến đổi hợp chất prodigiosin ban đâu Dựa sở mà người thực đề tài chọn hướng cho đồ án tốt nghiệp : Tinh prodigiosin từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens mơi trường peptone glycerol Mục đích... nghiên cứu Thiết lập quy trình ni tăng sinh prodigiosin từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens môi trường nuôi cấy pepton glycerol Nhiệm vụ nghiên cứu - Xử lý dịch nuôi cấy sau lên men - Khảo sát điều