Tạo chế phẩm diệt sâu khoang spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens SH1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO CHẾ PHẨM DIỆT SÂU KHOANG Spodoptera litura TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN Serratia marcescens SH1 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn: TS NGUYỄN HOÀI HƢƠNG Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ NGỌC DUNG MSSV: 1211100056 Lớp: 12DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn đƣợc cám ơn thông tin trích dẫn Luận văn đƣợc rõ nguồn gốc Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 Sinh viên thực luận văn Lê Thị Ngọc Dung Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trong suốt quãng đời học, chƣa ngày bố mẹ thơi lo lắng chăm sóc cho con, nhƣng không biểu hay đơn giản câu nói “con thƣơng bố mẹ” Nhân lúc đây, xin đƣợc ghi khắc công ơn dƣỡng dục bố mẹ, có lúc vơ tình làm bố mẹ buồn, nhƣng hai không bỏ mặc với khó khăn mà ln dõi theo, giúp đỡ sát cánh bên để đƣợc trƣởng thành đến ngày hôm Bố mẹ chỗ dựa tinh thần vững gặp phải vấn đề khó khăn; động lực để đứng dậy sau lần vấp ngã; bách khoa toàn thƣ giúp giải vấn đề Và nhƣ sau Với lòng biết ơn sâu sắc Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý thầy cô trƣờng đại học Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh nhiệt tình truyền đạt cho em kiến thức quý giá từ ngày đầu em bƣớc vào giảng đƣờng đại học Đặc biệt, em xin đƣợc chân thành biết ơn Nguyễn Hồi Hƣơng, ngƣời thầy đáng kính, ln quan tâm tận tình dạy để em hồn thành đồ án Và quan trọng cô đƣa lời khuyên dạy em cách đối mặt với va chạm sống, trang vàng hành trang sau em Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai quan tâm có hƣớng dẫn lúc em tập nuôi sâu khoang cô ngƣời cho nguồn nấm bệnh phịng thí nghiệm Em xin chân thành cảm ơn cô Đỗ Thị Tuyến hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ em địa điểm quét phổ UV – vis Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đồ án phịng thí nghiệm Cảm ơn tất bạn lớp 12DSH01 12DSH02 ln động viên, giúp đỡ suốt trình học tập trƣờng Cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Anh Kha, anh Lê Quốc Vũ, bạn Vũ Hoàng Minh Ngọc, bạn Kiều Nguyễn Phƣơng Vy, bạn Phan Thị Gìn em Trƣơng Hồi Ngun lớp 13DSH03, em Nguyễn Thị Đồ án tốt nghiệp Băng Khanh, em Nguyễn Trung Hậu, em Lê Thị Ngọc Hân đồng hành sát cánh suốt ngày làm đồ án tố nghiệp Xin chân thành cảm ơn! Tp.Hồ Chí Minh, tháng năm 2016 SVTH: Lê Thị Ngọc Dung Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU .1 Chƣơng 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu thuốc trừ sâu sinh học 1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học 1.1.3 Những mặt ƣu điểm hạn chế thuốc trừ sâu sinh học 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 1.2.1 Lịch sử phát 1.2.2 Phân loại khoa học Serratia marcescens 1.2.3 Đặc điểm Serratia marcescens .8 1.2.3.1 Đặc điểm sinh lí 1.2.3.2 Đặc điểm sinh hóa 1.2.3.3 Đặc điểm phân bố 11 1.3 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens 11 1.3.1 Sắc tố 11 1.3.2 Biosurfactants 12 1.3.3 Acid béo 13 1.3.4 Enzyme .13 1.3.5 Yếu tố độc lực Serratia marcescens .13 1.4 Giới thiệu Prodigiosin 14 1.4.1 Khái niệm prodigiosin 14 1.4.2 Cấu trúc đặc điểm prodigiosin 15 1.4.3 Hoạt động sinh học prodigiosin 18 i Đồ án tốt nghiệp 1.5 Tiềm tạo chế phẩm trừ sâu từ prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens 19 1.6 Cơ chế tổng hợp prodigiosin Serratia marcescens .20 1.7 Một số nghiên cứu giới 25 1.7.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens .25 1.7.2 Tình hình nghiên cứu prodigiosin 25 1.8 Khái quát sâu khoang Spodoptera litura 27 1.8.1 Đặc điểm hình thái 27 1.8.2 Đặc điểm sinh học sinh thái 28 1.8.3 Thiên địch 29 1.8.4 Biện pháp phòng trừ 29 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Thời gian, địa điểm .30 2.1.1 Thời gian 30 2.1.2 Địa điểm 30 2.2 Vật liệu – thiết bị – hóa chất 30 2.2.1 Nguồn vi sinh vật .30 2.2.1.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens 30 2.2.1.2 Nguồn vi khuẩn thị 30 2.2.1.3 Nguồn nấm bệnh 31 2.2.1.4 Nguồn sâu khoang Spodoptera litura 31 2.2.2 Mơi trƣờng ni cấy hóa chất .31 2.2.3 Dụng cụ, thiết bị .31 2.3 Bố trí thí nghiệm 33 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 37 2.4.1 Phƣơng pháp ni sâu phịng thí nghiệm .37 2.4.2 Phƣơng pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens 37 2.4.2.1 Phƣơng pháp xử lí acid 37 2.4.2.2 Phƣơng pháp xử lí nhiệt 38 ii Đồ án tốt nghiệp 2.4.3 Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính sinh học .39 2.4.3.1 Phƣơng pháp định tính enzyme .39 2.4.3.2 Phƣơng pháp khảo sát khả kháng khuẩn 43 2.4.3.3 Phƣơng pháp khảo sát khả kháng nấm 46 2.4.3.4 Khảo sát hiệu lực diệt sâu phƣơng pháp quét 48 2.4.4 Khảo sát thời gian bảo quản canh trƣờng lên men sau xử lí 49 2.4.5 Khảo sát hiệu lực diệt sâu invivo .50 2.4.6 Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm 51 Chƣơng KẾT QUẢ, THẢO LUẬN 53 3.1 Xác định thời gian, độ pH tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens từ phƣơng pháp xử lí acid HCl 1N 53 3.2 Xác định thời gian, nhiệt độ tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens từ phƣơng pháp xử lí nhiệt độ 60 3.3 Khả tiết enzyme ngoại bào 62 3.3.1 Khả giữ lại enzyme ngoại bào từ phƣơng pháp xử lí acid 62 3.3.2 Khả giữ lại enzyme ngoại bào từ phƣơng pháp xử lí nhiệt độ 66 3.4 Khả kháng khuẩn 68 3.4.1 Khả kháng khuẩn dịch canh trƣờng xử lí phƣơng pháp xử lí acid 68 3.5 Hoạt tính kháng nấm 69 3.5.1 Khả kháng nấm dịch canh trƣờng xử lí phƣơng pháp xử lí acid 69 3.6 Hiệu lực diệt sâu 71 3.6.1 Hiệu lực diệt sâu từ canh trƣờng lên men qua xử lí 71 3.6.2 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm 73 3.7 Xác định thời gian bảo quan canh trƣờng xử lí .75 3.8 Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm .79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens 10 Bảng 1.2 Xác định cấu trúc số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) 17 Bảng 1.3 Một số sáng chế prodigiosin 26 Bảng 3.1 Prodigiosin unit/tế bào chủng SH1 60 Bảng 3.2 Khả bảo toàn enzyme ngoại bào canh trƣờng đƣợc xử lí phƣơng pháp xử lí acid 64 Bảng 3.3 Khả bảo toàn enzyme ngoại bào canh trƣờng đƣợc xử lí phƣơng pháp xử lí nhiệt 66 Bảng 3.4 Khả kháng khuẩn Escherichia coli Staphylococcus aureus hoạt chất prodigiosin canh trƣờng xử lí 68 Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp canh trƣờng xử lí 70 Bảng 3.6 Tỉ lệ tử vong sâu khoang tuổi 73 Bảng 3.7 Tỉ lệ tử vong sâu khoang tuổi 75 Bảng 3.8 Tỉ lệ prodigiosin lại sau ngày bảo quản (%) 82 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình dáng màu sắc khuẩn lạc vi khuẩn Serratia marcescens Hình 1.2 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen Gibbs, 2011) Hình 1.3 Cấu trúc hình học phẳng hợp chất prodigiosin (Krishna, 2008) 16 Hình 1.4 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 17 Hình 1.5 Hoạt tính kháng khuẩn prodigiosin (Ramina Samira,2009) 19 Hình 1.6 So sánh cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor cộng sự, 2001) 22 Hình 1.7 Quá trình sinh tổng hợp prodigiosin (Caspi R, 2014) 24 Hình 1.8 Vịng đời sâu khoang Spodoptera litura 28 Hình 2.1 Quy trình khảo sát khả tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens hoạt tính diệt sâu prodigiosin canh trƣờng xử lí 34 Hình 2.2 Quy trình thử nghiệm khảo sát thời gian tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens 35 Hình 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid 36 Hình 2.4 Quy trình khảo sát chế phẩm diệt sâu từ prodigiosin 36 Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức đĩa thạch mơi trƣờng Lipit 40 Hình 2.6 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức đĩa thạch mơi trƣờng Casein 41 Hình 2.7 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức đĩa thạch môi trƣờng huyền phù chitin 1% 43 Hình 2.8 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức kháng khuẩn đĩa thạch môi trƣờng NA 45 Hình 2.9 Bố trí nghiệm thức kháng nấm đĩa thạch PDA 47 Hình 3.1 Khả tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens SH1 thời điểm giờ, 24 pH pH 56 v Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2 Giá trị OD499 prodigiosin canh trƣờng xử lí acid nghiệm thức 57 Hình 3.3 Giá trị OD hiệu chỉnh sắc tố (OD 499) tế bào (OD 620) nghiệm thức 59 Hình 3.4 Canh trƣờng xử lí acid đƣợc trang đĩa môi trƣờng PGA, sau 24h ủ tối 61 Hình 3.5 Khả bảo toàn enzyme ngoại bào canh trƣờng S.marcescens xử lí 64 Hình 3.6 Khả bảo toàn enzyme ngoại bào canh trƣờng lên men xử lí 66 Hình 3.7 Khả kháng khuẩn Escherichia coli Staphylococcus aureus hoạt chất prodigiosin canh trƣờng lên men xử lí 68 Hình 3.8 Khả kháng nấm Fusarium sp canh trƣờng xử lí so với đối chứng 70 Hình 3.9 Nồng độ pha lỗng cho thí nghiệm hiệu lực diệt sâu: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 10-6 72 Hình 3.10 Tỉ lệ sâu chết canh trƣờng xử lí acid 72 Hình 3.11 Tỉ lệ sâu chết theo thời gian prodigiosin canh trƣờng S.marcescens xử lí acid 73 Hình 3.12 Chế phẩm nồng độ pha lỗng:10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và10-6 74 Hình 3.13 Tỉ lệ sâu chết cho chế phẩm theo thời gian 75 Hình 3.14 Tỉ lệ prodigiosin cịn lại canh trƣờng ni cấy vi khuẩn S.marcescens xử lí mơi trƣờng ngồi sáng 76 Hình 3.15 Tỉ lệ prodigiosin cịn lại canh trƣờng xử lí mơi trƣờng tối 77 Hình 3.16 So sánh tỉ lệ prodigiosin lại sau ngày bảo quản, nhiệt độ 2oC 78 Hình 3.17 So sánh tỉ lệ prodigiosin lại sau ngày bảo quản, nhiệt độ phòng 78 Hình 3.18 So sánh tỉ lệ prodigiosin cịn lại sau ngày bảo quản, điều kiện trời 79 vi Đồ án tốt nghiệp Hình 3.9 Thí nghiệm hiệu lực diệt sâu theo thứ tự pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 10-6 Hình 3.8 Sâu chết canh trƣờng xử lí acid Bảng 3.9 Tỉ lệ tử vong sâu khoang tuổi Tỉ lệ tử vong (%) Nồng độ pha loãng 0h 24h 48h 72h 96h 120h 10-1 0.00 0.00 23.33 40.00 46.67 53.33 10-2 0.00 3.33 20.00 40.00 50.00 56.67 10-3 0.00 6.67 16.67 50.00 56.67 66.67 72 Đồ án tốt nghiệp 10-4 0.00 10.00 30.00 56.67 83.33 100.00 10-5 0.00 10.00 23.33 40.00 50.00 60.00 10-6 0.00 6.67 6.67 33.33 43.33 56.67 Khả diệt sâu dịch ni cấy xử lí acid HCl 1N 120 Tỉ lệ sâu chết (%) 100 80 2246.0 ng/cm2 1645.6 ng/cm2 60 164.6 ng/cm2 16.5 ng/cm2 40 1.6 ng/cm2 0.2 ng/cm2 Thuốc trừ sâu (6ng/cm2) 20 0 Thời gian (ngày) Hình 3.11 Tỉ lệ sâu chết theo thời gian canh trƣờng S.marcescens xử lí acid (Abbout,1925) 3.6.2 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm Thí nghiệm hiệu lực diệt sâu đƣợc thực phƣơng pháp quét với nồng độ riêng biệt để xác định giá trị nồng độ diệt sâu tốt Tiến thử nghiệm với đối chứng dƣơng thuốc trừ sâu sinh học REASGANT 1.8EC đối chứng âm môi trƣờng PG broth vô trùng có bổ sung Tween 80 0,02%, rỉ đƣờng % CMC % , nghiệm thức chế phẩm nồng độ pha 73 Đồ án tốt nghiệp loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 10-6 , theo dõi số lƣợng sâu chết 24 tiếng vòng ngày Kết cho thấy, với nồng độ pha lỗng 10-4 có nồng độ prodigiosin 16,5 mg/ml cho kết kháng sâu tốt nhất, tƣơng đƣơng với khả diệt sâu thuốc trừ sâu sinh học Reasgant Trong vòng 48h, tỉ lệ tử vong sâu khoang đạt giá trị 56,67 % Vì canh trƣờng xử lí đƣợc bổng sung vào rỉ đƣờng, CMC Tween 80 giúp nâng cao khả kháng sâu khoang Bổ sung CMC 1% giúp tăng độ kết bám chế phẩm lên lá, giảm thất prodigiosin Bên cạnh đó, lồi sâu thích vị chua nên bổ sung rỉ đƣờng vào chế phẩm giúp kích thích vị nó, đƣợc tiêu hóa vào thể lƣợng Tween bổ sung vào chế phẩm giúp prodigiosin khuếch tán tốt vào thể, ngồi cịn có enzyme ngoại bào giúp cho hoạt chất prodigiosin hoạt động tốt gây chết sâu nhanh so với thử nghiệm diệt sâu canh trƣờng S.marcescens xử lí Hình 3.12Chế phẩm nồng độ pha loãng lần lƣợt 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và10-6 Bảng 3.10Tỉ lệ tử vong sâu khoang tuổi Tỉ lệ tử vong Nồng độ pha loãng 10-1 0h 24h 48h 72h 96h 120h 0.00 10.00 16.67 53.33 83.33 90.00 74 Đồ án tốt nghiệp 10-2 0.00 3.33 20.00 60.00 70.00 86.67 10-3 0.00 13.33 30.00 70.00 76.67 90.00 10-4 0.00 30.00 56.67 86.67 100.00 100.00 10-5 0.00 26.67 36.67 53.33 76.67 90.00 10-6 0.00 6.67 20.00 43.33 63.33 90.00 Khả diệt sâu chế phẩm 120.0 Tỉ lệ sâu chết (%) 100.0 80.0 2246.0 ng/cm2 1645.6 ng/cm2 60.0 164.6 ng/cm2 16.5 ng/cm2 1.6 ng/cm2 40.0 0.2 ng/cm2 Thuốc (6 ng/cm2) 20.0 0.0 Thời gian (ngày) Hình 3.13 Tỉ lệ sâu chết cho chế phẩm theo thời gian (Abbott, 1925) 3.7 Xác định thời gian bảo quan canh trường S.marcescens xử lí Tiến hành thí nghiệm bảo quản canh trƣờng nhằm xác định khoảng nhiệt độ thời gian làm prodigiosin bị biến tính để tìm hƣớng bảo quản chế phẩm trừ sâu tốt Thí nghiệm đƣợc thực mơi trƣờng nhiệt độ khác nhau: ngồi trời, nhiệt độ phịng nhiệt độ tủ mát (2oC) Kết xử lí số liệu phần mềm SAS 9.0 thống kê ANOVA, với kết tin cậy 95% Cho thấy nồng độ prodigiosin nghiệm thức sáng, giảm dần từ ngày 75 Đồ án tốt nghiệp thứ đến ngày thứ trình bảo quản Tại nghiệm thức nhiệt độ 2oC ngồi trời có hiệu suất bảo quản lần lƣợt 94,2a 90,3b, khác biệt có nghĩa Và hiệu suất bảo quản nhiệt độ phịng 85,9b (Hình 3.14) Ở kết xử lí thống kê SAS với độ tin cậy 95%, nồng độ prodigiosin nghiệm thức tối, giảm dần từ ngày thứ đến ngày thứ trình bảo quản Tại nghiệm thức nhiệt độ 2oC trời có hiệu suất bảo quản lần lƣợt 94,2a 93,3a, khơng khác biệt có nghĩa Và hiệu suất bảo quản nhiệt độ phịng 85,9b (Hình 3.15) Khả bảo quản dịch ni cấy xử lí (ngồi sáng) Tỉ lệ prodigiosin (%) 120.0 100.0 80.0 60.0 Nhiệt độ 2oC Nhiệt độ phịng 40.0 Nhiệt độ ngồi trời 20.0 0.0 Thời gian (ngày) Hình 3.14 Tỉ lệ prodigiosin lại canh trƣờng S.marcescens xử lí mơi trƣờng ngồi sáng 76 Đồ án tốt nghiệp Khả bảo quản dịch nuôi cấy xử lí (bao tối) Tỉ lệ prodigiosin (%) 120.0 100.0 80.0 60.0 Nhiệt độ 2oC Nhiệt độ phòng 40.0 Nhiệt độ trời 20.0 0.0 Thời gian (ngày) Hình 3.15 Tỉ lệ prodigiosin cịn lại canh trƣờng xử lí mơi trƣờng tối Khi so sánh khả bảo quản canh trƣờng lên men ngày môi trƣờng tối ngồi sáng kết cho thấy, điều kiện bảo quản 2oC ngồi trời hiệu suất bảo quản tốt khơng có khác biệt có nghĩa xử lí phần mềm SAS ANOVA Tuy nhiên, không loại trƣờng điều kiện khách quan nhiệt độ môi trƣờng, nên dẫn đến khơng khác biệt có nghĩa So sánh nhiệt độ 2oC, bảo quản điều kiện tối ngồi sáng cho kết xử lí thống kê SAS với độ tin cậy 95%, hiệu suất bảo quản nhƣ khơng có khác biệt (Hình 3.16) So sánh nhiệt độ phịng, bảo quản điều kiện tối sáng cho kết xử lí thống kê SAS với độ tin cậy 95%, hiệu suất bảo quản nhƣ khơng có khác biệt (Hình 3.17) So sánh nhiệt độ ngồi trời, bảo quản điều kiện tối sáng cho kết xử lí thống kê SAS với độ tin cậy 95%, hiệu suất bảo quản nhƣ khơng có khác biệt (Hình 3.18) 77 Đồ án tốt nghiệp Tỉ lệ Prodigiosin lại Nhiệt độ 2oC 108.0 106.0 104.0 102.0 100.0 98.0 96.0 94.0 92.0 90.0 88.0 86.0 Ngoài Trong Ngoài Trong Ngoài Trong Ngoài Trong Ngoài Trong sáng sáng sáng sáng sáng tối tối tối tối tối Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Hình 3.16 So sánh tỉ lệ prodigiosin lại canh trƣờng nhiệt độ 2oC Nhiệt độ phòng Tỉ lệ prodigiosin lại 105.0 100.0 95.0 90.0 85.0 80.0 75.0 Ngoài Trong Ngoài Trong Ngoài Trong Ngoài Trong Ngoài Trong sáng sáng sáng sáng sáng tối tối tối tối tối Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Hình 3.17 So sánh tỉ lệ prodigiosin cịn lại canh trƣờng nhiệt độ phòng 78 Đồ án tốt nghiệp Tỉ lệ prodigiosin cịn lại Nhiệt độ ngồi trời 104.0 102.0 100.0 98.0 96.0 94.0 92.0 90.0 88.0 86.0 84.0 Ngoài Trong Ngoài Trong Ngoài Trong Ngoài Trong Ngoài Trong sáng sáng sáng sáng sáng tối tối tối tối tối Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Hình 3.18 So sánh tỉ lệ prodigiosin cịn lại canh trƣờng ngồi trời 3.8 Xác định môi trường bảo quan chế phẩm Thí nghiệm đƣợc tiến hành với mục địc bảo quản prodigiosin chế phẩm biến tính thất thoát yếu tố khách quan càn tốt, giúp đảm bảo hoạt lực diệt sâu chế phẩm Kết sau q trình trích ly lỏng – lỏng thu đƣợc kết Ở nhiệt độ -20oC, thu nhận 8,184 mg/ml, đạt hiệu suất 38,16 Ở nhiệt độ tủ mát (2oC) thu nhận 20,016 mg/ml, đạt hiệu suất 93,32 Ở nhiệt độ phòng (37oC) thu nhận 18,228 mg/ml, đạt hiệu suất 84,99 Ở điều kiện môi trƣờng nhiệt độ 60oC thu nhận 7,808 mg/ml, đạt hiệu suất 36,40 Ở điều kiện mơi trƣờng ngồi trời, chế phẩm tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời thu nhận 3,973 mg/ml, đạt hiệu suất 18,52 Tóm lại, hoạt chất prodigiosin đƣợc bảo quản tốt điều kiện mát mẻ (2 oC); prodigiosin bị biến tính điều kiện bảo quản dƣới ánh sáng mặt trời (ngồi trời) hoạt chất bị biến tính đến 80% lƣợng prodiosin ban đầu 79 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.19 Chế phẩm trƣớc sau ngày bảo quản Canh trƣờng vi khuẩn SH1 đƣợc xử lí với acid 4h, đƣợc đƣa pH thêm phụ gia để tăng độ bám prodigiosin (CMC 1%), tăng khả khuếch tán prodigiosin (Tween 80 0,02%) giảm tiếp xúc trực tiếp prodigiosin với ánh sáng (rỉ đƣờng 1%) Vì vậy, chế phẩm sinh học diệt sâu nồng độ đậm đặc trạng thái huyền phù, sệch lại Nếu đo trực tiếp canh trƣờng với OD 499 dẫn đến sai số, ảnh hƣởng kết hiệu suất thu hồi Vì vậy, tiến hành trích ly lỏng – lỏng canh trƣờng xử lí với petroleum ether, đo OD 535 Hình 3.20 Trích ly lỏng – lỏng chế phẩm 80 Đồ án tốt nghiệp Sau tiến hành trích ly lỏng – lỏng, để thu lại prodigiosin cịn lại chế phẩm Xử lí thống kê với phần mềm SAS ANOVA với khoảng tin cậy 95%, kết cho thấy sau ngày bảo quản, nồng độ prodigiosin cịn lại mơi trƣờng nhiệt độ tử mát cao 20,016a mg/ml, nhiệt độ phịng có lƣợng prodigiosin sau thu hồi 18,228b mg/ml, mơi trƣờng ngồi trời có nồng độ prodigiosin sau thu hồi thấp (Bảng 3.14) Có thể nói, chế phẩm sau bổ sung chất phụ gia có khả bảo quản đƣợc ngày điều kiện nhiệt độ mát mẻ (2oC) nhiệt độ phòng (30 3oC) Mặc dù bổ sung rỉ đƣờng giúp chế phẩm tránh ánh sáng trực tiếp, nhƣng tia UV có tia nắng mặt trời làm biến tính gần nhƣ hoàn toàn prodigiosin để chế phẩm mơi trƣờng ngồi trời Bảng 3.14 Giá trị nồng độ prodigiosin sau ngày bảo quản (mg/ml) Trƣớc cho Bảo quản sau phụ gia ngày Nhiệt độ tủ đông (-20oC) 21,449 8,184c 0,2 Nhiệt độ mát (2oC) 21,449 20,016a 0,5 Nhiệt độ phòng 21,449 18,228b 1,7 Nhiệt độ 60oC 21,449 7,808d 0,1 Nhiệt độ trời 21,449 3,973e 0,1 Dựa vào bảng 3.14, tính đƣợc hiệu suất bảo quản prodigiosin chế phẩm sau ngày bảo quản điều kiện khác -18oC, 2oC, nhiệt độ phịng, 60oC ngồi trời Từ chọn môi trƣờng bảo quản tốt cho chế phẩm Qua kết xử lí thống kê SAS phân tích ANOVA, hiệu suất nhiệt độ 2oC 93,319 2,3 giá trị hiệu suất bảo quản tốt điều kiện khảo sát, đạt giá trị tin cậy 95% Hiệu suất bảo quản nhiệt độ phòng cho giá trị ổn mức 85 7,9 Đạt hiệu suất thấp điều kiện bảo quản nhiệt độ trời với 18,52 0,4 Do ảnh 81 Đồ án tốt nghiệp hƣởng trực tiếp tia mặt trời làm prodigiosin bị biến tính Vậy nên, việc bảo quản chế phẩm tốt nên nhiệt độ 2oC (xem bảng phụ lục B) Khả bảo quản chế phẩm Tỉ lệ prodigiosin lại 100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 Nhiệt độ tủ đông (-18oC) Nhiệt độ mát Nhiệt độ phịng Nhiệt độ 60oC Nhiệt độ ngồi (2oC) trời Điều kiện bảo quản Hình 3.21 Hiệu suất bảo quản chế phẩm sau ngày theo dõi điều kiện mơi trƣờng: -18oC, 2oC, nhiệt độ phịng, nhiệt độ ngồi trời nhiệt độ cao (60oC) 82 Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau canh trƣờng S.marcescens SH1 đƣợc xử lí nhiệt 65oC, 15 phút, tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt hoàn tồn prodigiosin có giá trị OD 535 1,278; nhiên enzyme ngoại bào nhƣ chitinase, lipase bị bất hoạt hoàn toàn giữ lại phần enzyme protease Sau xứ lý canh trƣờng S.marcescens SH1 HCl 1N pH = giờ, toàn vi khuẩn bị tiêu diệt, pH pH 2, tế bào vi khuẩn Serratia marcescens bị tiêu diệt hồn tồn Riêng pH2 có giá trị OD 499 prodigiosin thời điểm ngƣng xử lí với acid 18,00 Khi canh trƣờng S.marcescens đƣợc xử lí phƣơng pháp acid có đƣợc ƣu điểm so với phƣơng pháp xử lí nhiệt enzyme ngoại bào khơng bị biến tính Vì vậy, phƣơng pháp xử lí acid HCl 1N, đƣa pH xử lí biện pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn khả thi phù hợp để thu hợp chất prodigiosin nhằm tạo chế phẩm sinh học diệt sâu Canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens xử lí có khả kháng nấm nấm Fusarium sp với tỉ lệ ức chế 53,19%, Canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens xử lí khả cạnh tranh lấn át với vi khuẩn gây bệnh Escherichia coli Staphylococcus aureus Hiệu diệt sâu canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens chế phẩm sinh học diệt sâu tốt nồng độ pha loãng 10-4, tƣơng đƣơng nồng độ prodigiosin 16,5 ng/cm2 Với canh trƣờng vi khuẩn qua xử lí acid, vịng 72h tỉ lệ sâu tử vong 56,67% đến hết ngày thứ tỉ lệ sâu tử vong đạt 100% Đối với chế phẩm diệt sâu sinh học, tỉ lệ tử vong sâu khoang tuổi 56,67% sau 48h cho ăn phƣơng pháp quét đạt tỉ lệ tử vong 100% vịng 96h, có khả diệt sâu tƣơng đƣơng với thuốc trừ sâu sinh học REASGANT 3.6EC 83 Đồ án tốt nghiệp Cả canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí chế phẩm sinh học trừ sâu bảo quản tốt nhiệt độ 2oC, nên tránh ánh sáng trực tiếp từ mặt trời Đối với canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí, tỉ lệ prodigiosin lại sau ngày bảo quan đạt 94,2 hai mơi trƣờng ủ tối ngồi sáng nhiệt độ 2oC Ở nhiệt độ phòng, hiệu việc bảo quản sáng ủ tối 85,7 85,9 Ở nhiệt độ môi trƣờng trời (30 3oC) sáng ủ tối 90,3 93,3 Đối với chế phẩm, môi trƣờng bảo quản tốt 2oC với hiệu suất 93,3, lần lƣợt môi trƣờng nhiệt độ phòng 84,9, nhiệt độ -18oC 60oC 38,6, 36,4; mơi trƣờng ngồi trời 18,5 Từ đây, rút kết chung cho toàn trình sử dụng phƣơng pháp xử lí acid HCl 1N, pH để tiêu diệt hoàn toàn tế bào vi khuẩn Khả diệt sâu khoang canh trƣờng xử lí đƣợc pha lỗng với nồng độ 10 -4 để đạt hiệu diệt sâu tối ƣu Đồng thời bảo quản canh trƣờng nhƣ chế phẩm điều kiện nhiệt độ mát mẻ (2oC) mơi trƣờng nhiệt độ bảo quản tối ƣu Kiến nghị Tiếp tục khảo sát khả diệt sâu chủng Serratia marcescens SB HB Khảo sát ảnh hƣởng chế phẩm lên thực vật, môi trƣờng Mở rộng phổ ký chủ cho chế phẩm sinh học diệt sâu 84 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Nguyễn Hiếu Dân (2013) Khảo sát hoạt tính sinh học vi khuẩn Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN hợp chất màu dạng prodigiosin tổng hợp vi khuẩn này, Đồ án tốt nghiệp, trƣờng Đại học Cơng nghệ TP HCM Nguyễn Hồng Anh Kha (2013) Thu nhận sắc tố màu đỏ dạng prodigiosin tổng hợp vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng EPN, Đồ án tốt nghiệp, trƣờng Đại học Công nghệ TP HCM Nguyễn Hoài Hƣơng, Nguyễn Hoàng Anh Kha, Nguyễn Hiếu Dân, Nguyễn Thị Hai (2013) Phân lập chủng vi khuẩn từ tuyến trùng EPN khảo sát độc lực chúng sâu khoang Spodoptera litura, Báo cáo khoa học, P1 -16 Nguyễn Hoài Hƣơng, Nguyễn Hoàng Anh Kha(2015) Khả diệt sâu khoang Spodoptera litura vi khuẩn Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN hợp chất thứ cấp prodigiosin vi khuẩn này, Tạp chí phát triển KH & CN, tập 18 Tài liệu tiếng Anh Pryce L Haddix* and Terry F Werner (2000) Spectrophotometric Assay of Gene Expression:Serratia marcescens Pigmentation Lapenda Lins et al (2014), Production and toxicological evaluation of Prodigiosin from Serratia marcescens UCP/WFCC1549 on Mannitol Solid Medium, International Journal of Applied Research in Natural Products, Vol (2), pp 32-38 Kamble K.D, Hiwarale V.D (2012), Prodigiosin production from Serratia marcescens 85 Đồ án tốt nghiệp strains obtained from farm soil, INTERNATIONAL JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCES Volume 3, No 1, 2012 Vijayalakshmi et al (2016), Production of Prodigiosin from Serratia marcescens and its antioxidant and anticancer potential, International Journal of Advanced Research in Biological Sciences Volume 3, Issue – 2016, 3(3): 75 – 88 Chidambaram Kulandaisamy et al (2009), An Insightful Overview on Microbial Pigment, Prodigiosin, Electronic Journal of Biology, 2009, Vol 5(3): 49-61 Anuradha V Giri et al (2004), A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil, BMC Microbiology 2004, 4:11 Anita Khanafari, Mahnaz Mazaheri Assadi and Fatemeh Ahmadi Fakhr (2006), Review of Prodigiosin, Pigmentation in Serratia marcescens, Online Journal of Biological Sciences (1): 1-13, 2006 Helvia W Casullo de Araújo, K Fukushima, and Galba M Campos Takaki (2010), Prodigiosin Production by Serratia marcescens UCP 1549 Using RenewableResources as a Low Cost Substrate, Molecules 2010, 15, 6931-6940 Tài liệu có nguồn từ Internet http://bvtvld.gov.vn/quan-ly-thuoc-bao-ve-thuc-vat/tinh-hinh-su-dung-thuoc-bvtv/884dac-diem-cua-hoat-chat-abamectin.html http://www.biocyc.org/META/NEW-IMAGE?type=PATHWAY&object=PWY7547&detail-level=2&orgids=(AAEO224324%20ECOLI)# http://www.bvtvhcm.gov.vn/document.php?id=51&cid=6 http://www.vietlinh.vn/giai-phap-sinh-hoc-huu-co/sinh-hoc-thuoc-tru-sau.asp 86 ... đồ án tốt nghiệp là: ? ?Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH1? ?? Mục đích nghiên cứu Sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin... phƣơng pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens canh trƣờng lên men Sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến trùng diệt sâu EPN bỏ qua q... litura tuổi …) Khảo sát đƣợc hiệu lực diệt sâu chế phẩm từ dịch nuôi cấy xử lý acid Khảo sát đƣợc ảnh hƣởng điều kiện bảo quản lên chế phẩm Kết cấu đồ án Đồ án ? ?Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera