Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens SH4

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ PLUTELLA XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH4 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 1311100520 : TRƯƠNG HỒI NGUN Lớp: 13DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ PLUTELLA XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH4 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 1311100520 : TRƯƠNG HỒI NGUN Lớp: 13DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hoài Hương ( Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM) Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm khóa luận tốt nghiệp TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người nuôi nấng dạy dỗ 23 năm qua, người trải qua biết khó khăn sống ln qua tâm con, chăm sóc cho Người ln bên lúc khó khăn Em xin cảm ơn anh chị gia đình định hướng ủng hộ em đường học tập Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường tận tâm dạy bảo truyền đạt kiến thức cho em suốt năm đại học Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến cô Nguyễn Hồi Hương, người ln nhiệt tình với học trò, định hướng cung cấp kiến thức bổ ích cho chúng em, người trực tiếp hướng dẫn em xun suốt q trình thực tốt khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai người cho em lời khuyên trình ni sâu tơ thí nghiệm cung cấp cho em giống nấm thí nghiệm Em xin cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh, anh Trần Thiện Đức tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đồ án phòng thí nghiệm Đồng thời, xin cảm ơn đến bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, Cao Thị Thanh Thúy hổ trợ thực tốt khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tất bạn thực đồ án thời gian thực đồ án phòng thí nghiệm giúp đỡ suốt q trình làm thí nghiệm Cảm ơn em Hồ Trung Lộc lớp 14DSH, em Trần Nguyễn Tuấn Minh 14DSH, em Bùi Nhật Minh 14DSH phụ giúp anh trình thực đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn ! TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG CHƯƠNG : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu thuốc trừ sâu sinh học 1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học thị trường 1.1.3 Những ưu điểm hạn chế thuốc trừ sâu sinh học 10 1.1.4 Giới thiệu thuốc trừ sâu sinh học Abamectin 10 1.1.4.1 Ưu điểm 11 1.1.4.2 Nhược điểm 11 1.1.4.3 Cơ chế tác động 12 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 12 1.2.1 Lịch sử phát 12 1.2.2 Phân loại 13 1.2.3 Đặc điểm Serratia marcescens 13 1.2.4 Đặc điểm sinh lí 14 1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa 15 1.1.3.2 Đặc điểm phân bố 16 1.2 Giới thiệu Prodigiosin 17 1.3.1 Khái niệm prodigiosin 17 1.3.2 Cấu trúc đặc điểm prodigiosin 17 1.3.3 Hoạt tính sinh học prodigiosin 20 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin Serratia marcescens 20 1.4 Enzyme 25 1.5 Yếu tố độc lực Serratia marcescens 25 1.6 Một số nghiên cứu giới 26 1.6.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens 26 Đồ án tốt nghiệp 1.6.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin 27 1.6.3 Tình hình nghiên cứu nấm gây bệnh 27 1.6.3.1 Nấm Fusarium solani sp 27 1.6.3.2 Nấm Paecilomyces sp 28 1.6.3.3 Nấm Trichoderma 28 1.6.3.4 Nấm Aspergillus flavus 29 1.7 Khái quát sâu tơ Plutella xylostella 29 1.7.1 Đặc điểm hình thái, sinh học 29 1.7.2 Tập quán sinh sống cách gây hại 30 1.7.3 Biện pháp phòng trừ 30 CHƯƠNG : ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 32 2.1.1 Thời gian 32 2.1.2 Địa điểm 32 2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 32 2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia mascescens 32 2.2.2 Nguồn nấm 32 2.2.3 Nguồn ấu trùng Artemia nauplii 32 2.2.4 Nguồn cải Brassica integrifolia 32 2.2.5 Nguồn cá bảy màu Poecilia reticulate 32 2.2.6 Môi trường ni cấy hóa chất 32 2.2.7 Dụng cụ, thiết bị 33 2.3 Mục tiêu nghiên cứu 34 2.4 Nội dung nghiên cứu 34 2.5 Phương pháp thí nghiệm 34 2.5.1 Phương pháp luận 34 2.5.2 Bố trí thí nghiệm 35 2.6 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 36 2.6.1 Phương pháp ni sâu phòng thí nghiệm 36 2.6.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens .37 2.6.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học 37 2.6.3.1 Phương pháp định tính enzyme 37 Đồ án tốt nghiệp 2.6.3.2 Phương pháp khảo sát khả kháng nấm 42 2.6.3.3 Khảo sát hiệu lực diệt sâu phương pháp quét .44 2.6.3.4 Khảo sát độc tính chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii 45 2.6.3.5 Khảo sát độc tính chế phẩm tác động lên cải Brassica integrifolia 47 2.6.3.6 Khảo sát độc tính chế phẩm tác động lên cá bảy màu 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 51 3.1 Khả tiết enzyme ngoại bào 51 3.2 Hoạt tính kháng nấm 52 3.3 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm 55 3.4 Khảo sát độc tính chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii 57 3.5 Khảo sát tác động chế phẩm lên cải Brassica integrifolia .58 3.6 Khảo sát tác động chế phẩm lên cá bảy màu Poecilia reticulata 61 1.Kết luận 65 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC A THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG 71 PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH 74 PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ 86 PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ 89 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Artemia nauplii : A.nauplii Brassica integrifolia : B integrifolia Serratia mascescens : S.mascescens Plutella xylostella : P.xylostella Pepton glycerol : PG QCVN : Quy chuẩn Việt Nam BNNVPTNT : Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát kính hiển vi (Gillen Gibbs, 2011) 14 Hình 1.2 Hình dáng màu sắc khuẩn lạc vi khuẩn Serratia marcescens .14 Hình 1.3 Cấu trúc prodigiosin (Krishna, 2008) 18 Hình 1.4 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 18 Hình 1.5 So sánh cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor cộng sự, 2001) .21 Hình 1.6 Con đường đề xuất cho trình sinh tổng hợp prodigiosin 24 Hình 1.7 Vòng đời sâu tơ Plutella xylostella 30 Hình 2.1 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học, khả diệt sâu độc tính chế phẩm 36 Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức đĩa thạch mơi trường Casein .38 Hình 2.3 Cách bố trí nghiệm thức đĩa thạch mơi trường Lipit .40 Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức đĩa thạch mơi trường Chitin 41 Hình 2.3 Bố trí nghiệm thức kháng nấm đĩa thạch PDA 43 Hình 2.6 Bố trí thử nghiệm chế diệt sâu tơ P xylostella phẩm phương pháp quét (Maureen cộng sự, 2012) 45 Hình 3.1 Hiệu lực diệt sâu tơ P.xylostella chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S.mascescens SH4 theo thời gian (Abbott 1925) 56 Hình 3.2 Tỉ lệ chết ấu trùng Artemia nauplli theo Log nồng độ prodigiosin (mg/ml) 58 Hình 3.3 Tỉ lệ nảy mầm cải B integrifolia sau ngâm chế phẩm 59 Hình 3.4 Tỉ lệ nảy chết cải B integrifolia sau phun chế phẩm 60 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serrastia marcescens SH4 63 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens 15 Bảng 1.2 Xác định cấu trúc số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) 19 Bảng 3.1 enzyme ngoại bào canh trường lên men sau xử lí acid 52 Bảng 3.2 Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus flavus CDP1 52 Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp 53 Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm Trichoderma sp 54 Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp 54 Bảng 3.5 Tỉ lệ chết sâu tơ tuổi 56 Bảng 3.6 Độc tính chế phẩm cải sau ngày thử nghiệm .61 Bảng 3.7 Tỉ lệ chết cá sau ngày thử nghiệm 62 Đồ án tốt nghiệp Source Error DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 16 482.37461 30.14841 Corrected Total 23 23302.13072 R-Square Coeff Var Root MSE tilekhang Mean 0.979299 28.03016 5.490757 19.58874 Source nongdo DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 22819.75611 3259.96516 108.13 F 27.96 F 19865.65647 2837.95092 27.96 F 6858.796296 979.828042 10.74 F 13198.14815 1885.44974 45.25 F 23 13864.81481 R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean 0.951917 11.33556 Source DF nongdo 6.454972 56.94444 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 13198.14815 1885.44974 45.25 F 16351.38889 2335.91270 34.56 F 16351.38889 2335.91270 34.56 F 20981.01852 2997.28836 124.50 F 20981.01852 2997.28836 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet 99 124.50 F 21488.42593 3069.77513 245.58 F 16 200.00000 12.50000 Corrected Total 23 21688.42593 R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean 0.990778 4.278293 3.535534 82.63889 Source DF nongdo Anova SS Mean Square F Value Pr > F 21488.42593 3069.77513 245.58 F 2361.238095 393.539683 137.74 F 2361.238095 393.539683 137.74 F 1212.239583 173.177083 10.08 F 1212.239583 173.177083 10.08 F 3308.072917 472.581845 24.52 F nongdo 3308.072917 472.581845 24.52 F 7241.406250 1034.486607 57.57 F 7241.406250 1034.486607 57.57