Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 62 54 01 01 ĐẶNG MINH HIỀN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE TRONG CHẾ BIẾN BỘT PROTEIN THỦY PHÂN TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA SỬ DỤNG LÀM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT Cần Thơ, 2021 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Công Hà Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Vào lúc … … ngày … tháng … năm ……… Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Dang Minh Hien, Vo Thi Nhu Lan, Huynh Thi Bich Tran, Nguyen Thi Cam Tu and Nguyen Cong Ha, 2018 Enzymatic hydrolysis of pangasius belly protein by-product using for Bacillus subtilis cultivation Can Tho University Journal of Science, 54, Special issue: 1-7 Đặng Minh Hiền, Võ Thị Như Lan, Huỳnh Thị Bích Trân, Ngơ Thảo Trang, Nguyễn Thị Cẩm Tú Nguyễn Công Hà, 2018 Khảo sát trình sử dụng bromelain thủy phân protein máu cá tra sau thu hồi protein từ nước rửa máu cá tra chế biến cá tra phi lê ứng dung ni cấy nấm mốc Aspergillus oryzae Tạp chí Nơng Nghiệp Phát Triển Nông Thôn, Tháng 8, 117-124 (ISSN 1859-4581) Đặng Minh Hiền, Nguyễn Thị Điều, Lê Ngọc Quyên Nguyễn Công Hà, 2020 Sử dụng enzyme papain thủy phân protein máu cá tra dùng làm môi trường ni vi khuẩn Bacillus subtilis Tạp chí Nơng Nghiệp Phát Triển Nông Thôn, Tháng 9, 49-56 (ISSN 1859-4581) ii CHƯƠNG 1: GI I THIỆU 1.1.Tính cấp thiết đề tài Trong năm qua, nghề nuôi cá tra Việt Nam phát triển nhanh chóng góp phần vào việc nâng cao thu nhập người nuôi đồng thời sản phẩm cá tra mặt hàng chiếm tỷ trọng cao xuất thủy sản Theo số liệu thống kê vasep từ năm 2015 đến 2019 sản lượng cá tra liên tục tăng Năm 2015, Việt Nam xuất cá tra đạt 1,565 tỷ USD đến năm 2018, tăng lên 2,261 tỷ USD Tính đến ngày 19/11/2019, diện tích thả ni 7.127 (tăng 2.086 41,3% so với kỳ năm 2018), diện tích thu hoạch 5.412 (tăng 1.669 44,6% so với kỳ năm 2018) Bên cạnh việc nuôi trồng xuất cá tra tăng nhanh, trình chế biến cá tra thành sản phẩm đông lạnh xuất sử dụng 1/3 khối lượng nguyên liệu đầu vào, phần lại thải đầu xương cá, da cá, dè cá, mỡ cá, bao tử cá, thịt vụn cá, máu cá phụ phẩm chứa nhiều thành phần có giá trị dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học, dầu ăn, gelatin mỹ phẩm Nếu sản lượng nguyên liệu cá tra triệu tấn/năm có khoảng 600.000 phụ phẩm Phần phụ phẩm sau chế biến cá tra phi lê chiếm khoảng 6065% tổng khối lượng nguyên liệu, nguồn nguyên liệu tiềm để sản xuất sản phẩm giá trị gia tăng Tuy nhiên, chưa có nhiều sản phẩm sản xuất từ nguồn phụ phẩm này, chủ yếu dùng làm nguyên liệu sản xuất bột cá Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng enzyme protease chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật hướng cấp thiết 1.2 Mục tiêu n hiên c u Sản xuất bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra enzyme ngoại bào nhằm tăng thêm giá trị cho phụ phẩm cá tra giàu protein, góp phần tạo nên giải pháp thay đầy hứa hẹn thân thiện với môi trường Tận dụng hiệu sử dụng thành công nguồn phụ phẩm làm protein thủy phân giúp tăng lợi nhuận góp phần phát triển bền vững ngành nuôi trồng, chế biến thủy sản Nghiên cứu cung cấp thông tin kỹ thuật quan trọng để lựa chọn protease điều kiện chế biến để tối ưu hóa hiệu quả, từ phụ phẩm cá tra sử dụng phương pháp thủy phân enzyme với mục tiêu sử dụng phụ phẩm nguồn peptone cho vi sinh vật sinh tổng hợp 1.3 Nội dun n hiên c u Luận án nghiên cứu nội dung sau: - Xác định thành phần hóa lý phụ phẩm thịt dè cá tra máu cá tra - Khảo sát ảnh hưởng thời gian gia nhiệt pH đến trình thu hồi protein máu cá tra - Khảo sát khả tách béo phụ phẩm thịt dè máu cá tra NaHCO3 - Khảo sát điều kiện thủy phân protein: nồng độ enzyme/cơ chất theo thời gian thủy phân - Ứng dụng chế phẩm protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra làm nguồn dinh dưỡng đạm nuôi cấy vi sinh vật (nấm mốc Aspergillus oryzae vi khuẩn Bacillus subtilis) 1.4 Ý n hĩa khoa học ý n hĩa thực tiễn luận án - Ý nghĩa khoa học: Việc sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ phụ phẩm sử dụng nguồn peptone nuôi cấy vi sinh vật cho thấy giải pháp lựa chọn phù hợp để tận dụng hiệu nguồn phụ phẩm thịt dè, máu cá tạo ngành công nghiệp chế biến cá tra phi lê - Ý nghĩa thực tiễn: Kết nghiên cứu luận án sở bước đầu cho nghiên cứu quy mô lớn thu nhận ứng dụng protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra, qua nâng cao giá trị cho nguồn nguyên liệu này, đồng thời giảm tác động xấu đến môi trường 1.5 Điểm luận án Luận án nghiên cứu sử dụng ba enzyme thương mại thủy phân protein phụ phẩm thịt dè máu cá tra tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng sử dụng nguồn peptone nuôi cấy vi sinh vật Kết nghiên cứu tạo thêm hướng sản xuất sản phẩm protein thủy phân từ thịt dè máu cá tra, tạo sản phẩm dinh dưỡng nguồn peptone Nghiên cứu trình thủy phân protein từ phụ phẩm ba loại enzyme bromelain, papain neutrase góp phần cung cấp thêm thơng tin động học q trình thủy phân góp phần mở hướng việc thu hồi protein phụ phẩm nâng cao giá trị phụ phẩm protein Mặt khác, nghiên cứu làm giảm đáng kể chi phí xử lý phụ phẩm, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đồng thời cải thiện nâng cao giá trị thương mại phụ phẩm cá tra 1.6 Bố cục luận án - Bố cục luận án gồm 05 chương với tổng cộng 172 trang, đó: Chương Giới thiệu – 06 trang, Chương 2: Tổng quan tài liệu – 36 trang, Chương Phương tiện phương pháp nghiên cứu – 27 trang, Chương Kết thảo luận – 41 trang, Chương Kết luận kiến nghị – 03 trang, Tài liệu tham khảo – 06 trang, Phụ lục – 55 trang, tổng cộng có 43 hình 16 bảng CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổn quan n ành cá tra Cá tra nuôi chủ yếu tỉnh Đồng sông Cửu Long (An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang, Long An Bến Tre,.) Ngành cá tra có giai đoạn phát triển mạnh, đem lại lợi nhuận cao cho người nuôi, doanh nghiệp chế biến đem lại hàng tỷ USD kim ngạch xuất cho đất nước Cá tra Việt Nam loài cá cung cấp 90% nhu cầu tiêu thụ cá da trơn giới, lợi cạnh tranh đặc biệt để sản phẩm cá tra nâng cao giá trị ngành cá tra hoạt động hiệu năm tới 2.2 Giới thiệu n uyên liệu cá tra Cá tra số 11 loài thuộc họ cá tra (Pangasiidae) xác định sông Cửu Long Cá tra có tên tiếng Anh là: Shutchi catfish Tên khoa học: Pangasius hypophthalmus Thành phần hóa học thịt cá tra phi lê Thành phần hóa học gồm: nước, protein, lipid, muối vô cơ, vitamin, Các thành phần thay đổi phụ thuộc vào giới tính, điều kiện sinh sống, Ngoài ra, yếu tố thành phần thức ăn, mơi trường sống, kích cỡ cá đặc tính di truyền ảnh hưởng đến thành phần hóa học Hàm lượng nước chiếm 72,9%, đạm 60,3%, lipid 26,9%, tro 4,02% acid amin 53,7% (tính theo khô) (Trần Minh Phú ctv, 2014) Việc xử lý phụ phẩm cá tra Sản phẩm chủ yếu cá tra dạng phi lê, cá tra nguyên sau qua công đoạn đến cơng đoạn thành phẩm hiệu suất thu hồi đạt khoảng 38,6% dạng phi lê (Nguyen Phuoc Minh, 2014), 61,4% lại phụ phẩm bao gồm thịt dè, đầu, xương, da, nội tạng, … chiếm khối lượng tương đối lớn 2.3 Tổn quan protein Các acid amin việc tồn dạng tự cịn kết hợp với thơng qua liên kết peptide Tùy thuộc vào số lượng acid amin mạch peptide mà có dạng khác (di, tri, tetra, oligopeptide) Khi số lượng acid amin chuỗi peptide lớn 10 gọi polypeptide Protein tạo thành số acid amin mạch polypeptide đạt khoảng 100 đến 900, với khối lượng phân tử từ 10 đến 100 kDa Khi protein bị biến tính, chúng dễ bị thủy phân protease dạng chưa biến tính, cịn protein có hoạt tính sinh học enzyme thường bị hoạt tính (Hồng Kim Anh, 2007) 2.4 Enzyme bromelain Hoạt động thủy phân bromelain thể thơng qua vai trị nhóm -SH cystein, nhóm imidazole histidine nhóm disulfur Nhóm -SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl chất Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid chuyển cho nhóm amin chất nhận khác Cầu nối S-S có vai trị trì cấu trúc không gian bromelain Casein hemoglobin hai chất tự nhiên dùng nhiều Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein thủy phân sơ cho polypeptide acid amin Protein kết hợp với nhóm -SH enzyme làm cho protein bị ester hóa nhóm imidazole khử ester để giải phóng enzyme, acid amin peptide 2.5 Enzyme papain Papain thể hoạt tính xúc tác nhóm -SH dạng tự Vì ta sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái khơng hoạt động sang trạng thái hoạt động Do trung tâm hoạt động papain có tính khử nên chất hoạt hóa chất có tính khử cysteine, glytation acid, hydrocyamic, hydrogensulfite, sodiumthiosulfate, … cysteine chất hay dùng nhất, có mặt chất nhóm -SH papain phục hồi làm tăng hoạt tính papain 2.6 Enzyme neutrase Neutrase protease có tính kim loại khơng đặc trưng Neutrase phân cắt fibronectin, collagen IV đến mức độ thấp collagen I Neutrase không phân cắt collagen V laminin Neutrase thủy phân liên kết peptide từ đầu cuối N không phân cực acid amin ưu tiên thủy phân protein biến tính acid amin nội bào kỵ nước Neutrase liên kết với ion kẽm bốn ion canxi đơn vị Không giống lồi Bacillus khác, sản sinh neutrase, alkaline kết hợp hai protease Paenibacillus polymyxa ba loài sản sinh neutrase (Fogarty and Griffin, 1973) 2.7 Độn học enzyme Enzyme chất xúc tác hệ thống sinh học hiệu Trong thực tế, thông thường loại enzyme làm tăng tốc độ phản ứng lên triệu lần so với tốc độ phản ứng mà khơng có enzyme Hầu hết phản ứng sinh học không xảy khơng có mặt enzyme Một phản ứng sinh học đơn giản xúc tác enzyme hydrat hóa CO2 Chất xúc tác phản ứng carbonic anhydrase Phản ứng phần chu kỳ hô hấp loại bỏ CO2 khỏi thể Carbonic anhydrase enzyme có hiệu cao, phân tử enzyme xúc tác hydrat hóa 105 phân tử CO2 giây 2.8 Giới thiệu côn n hệ sấy phun Sấy trình sử dụng nhiệt để tách nước khỏi mẫu nguyên liệu Trong trình sấy nước tách khỏi nguyên liệu theo nguyên tắc bốc hay thăng hoa Do đó, hàm lượng chất khơ tăng đơn vị nguyên liệu (Lê Văn Việt Mẫn cộng sự, 2011) Theo Nguyễn Thị Hồng Minh cộng (2011), trình sấy phun tiến hành nhanh nên sản phẩm không nhiệt giữ màu sắc hương vị sản phẩm Ứng dụng trình sấy phun nguyên liệu trạng thái lỏng huyền phù (Lê Văn Việt Mẫn cộng sự, 2011) 2.9 Giới thiệu vi sinh vật Dinh dưỡng vi sinh vật chia thành nhóm lớn: nguồn dinh dưỡng cacbon, ngồn nitơ, nguồn muối vô cơ, chất sinh trưởng nước Vi sinh vật có tính đa dạng cao loại hình dinh dưỡng phức tạp Căn vào nguồn C, nguồn lượng, nguồn điện tử chia thành loại sau (Bảng 2.3): Bảng 2.3: Các loại hình dinh dưỡng vi sinh vật Nguồn C Nguồn năn lượng Nguồn điện tử - Tự dưỡng : - Dinh dưỡng - Dinh dưỡng vô : CO2 nguồn quang : Dùng phân tử vô C hay Nguồn lượng dạng khử để cung cấp chủ yếu ánh sáng điện tử - Dị dưỡng : - Dinh dưỡng hóa - Dinh dưỡng hữu : Nguồn C : Nguồn Dùng phân tử hữ chất hữu lượng hóa học giải để cung cấp điện tử phóng từ oxy hóa hợp (Nguyễn Lân Dũng, 2017) Môi trường nuôi cấy chất dinh dưỡng pha chế nhân tạo nhằm đáp ứng cho nhu cầu sinh trưởng, phát triển sản sinh sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật Có hai dạng mơi trường : Mơi trường thiên nhiên môi trường tổng hợp 2.10.1 Tổn quan Bacillus subtilis Bacillus subtilis trực khuẩn, có khả sinh catalase, hiếu khí hay kị khí, thường tìm thấy đất có nội bào tử có khả chịu nhiệt, tia xạ, chất sát khuẩn Chúng sản sinh protease tùy thuộc vào nguồn dinh dưỡng nitơ nguồn cacbon môi trường; thừa mức nitơ thấp gây ức chế sinh tổng hợp protease (M Paul et al., 2006 Aertsen et al., 2005) B subtilis lợi khuẩn chịu điều kiện mơi trường khắc nghiệt, có khả sinh enzym tốt ứng dụng rộng rãi y học, nông nghiệp công nghiệp thực phẩm Môi trường nuôi cấy B subtilis môi trường Luria-Bertani (LB), triệt trùng 121°C 20 phút (Jemil et al., 2014) 2.10.2 Tổn quan Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae (A oryzae) loại nấm sợi, có khả tiết lượng lớn enzyme thủy phân trình lên men trạng thái rắn Hơn nữa, A oryzae S có gen tốt đặc trưng coi sinh vật an toàn để sản xuất enzyme thực phẩm khơng có biểu gen chịu trách nhiệm sản xuất aflatoxin – chất độc gây ảnh hưởng sức khỏe người (Nora Khaldi, 2008) Môi trường ni cấy thành phần gồm: N, C, khống CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phươn tiện n hiên c u 3.1.1 Thời ian địa điểm - Thời gian: Các thí nghiệm luận án thực từ tháng năm 2014 đến tháng năm 2020 - Địa điểm: nghiên cứu thực phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp-Trường Đại học Cần Thơ; xưởng thực hành-Khoa Cơng nghệ-Trường Đại học Cần Thơ; phịng Chế biến-Trung Tâm Phát Triển Vườn Ươm Công Nghệ Công Nghiệp Việt Nam-Hàn Quốc 3.1.2 N uyên vật liệu - Nguồn phụ phẩm dè cá máu cá tra từ Công ty cổ phần xuất nhập Cần Thơ (CASEAMEX) bảo quản nhiệt độ 4C vận chuyển phịng thí nghiệm Bộ mơn thực phẩm, Khoa Nơng nghiệp, Trường đại học Cần Thơ Nguyên liệu dè cá rửa sạch, xử lý nhiệt sơ máu cá bảo quản đông nhiệt độ 200C sử dụng làm thí nghiệm - Vi khuẩn Bacillus subtilis nấm mốc Aspergillus oryzae nguồn gốc từ Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ - Ba enzyme ngoại bào: Bromelain xuất xứ Merck (Đức), papain neutrase xuất xứ Trung Quốc 3.1.3 Phươn pháp phân tích - Hàm lượng ẩm: Hàm lượng ẩm nguyên liệu xác định phương pháp sấy nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi (AOAC, 2000) - Hàm lượng lipid: Hàm lượng lipid phân tích phương pháp Soxhlet (AOAC, 2000) - Hàm lượng đạm: Xác định hàm lượng đạm tổng số phương pháp Kjeldahl (AOAC, 2000) - Phương pháp thủy phân protein enzyme bromelain, papain neutrase: Xác định hàm lượng tyrosine phương pháp Anson cải tiến (Nguyễn Đức Lương, 2003) - Xác định hàm lượng tyrosine tổng: Thủy phân axit HCl N (AOAC, 2000) - Xác định hàm lượng đạm amin: Hàm lượng đạm amin phương pháp OPA (AOAC, 2000) - Xác định hàm lượng protein tổng: Phương pháp Kjeldahl (AOAC, 2000) - Xác định hàm lượng tro: Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5105:2009 thủy sản sản phẩm thủy sản- xác định hàm lượng tro - Mức độ thủy phân (DH) = tyrosine thủy phân/tổng tyrosine (Nielsen, el al., 2001) - Phương pháp xác định đường cong tăng trưởng vi khuẩn Bacillus subtilis (CFU/mL) nấm mốc Aspergillus oryzae cách sử dụng số lượng khuẩn lạc (Trần Linh Phước, 2006) - Hoạt tính protease xác định phương pháp Anson cải tiến (Nguyễn Đức Lương, 2003) Hiệu suất thủy phân enzyme papain tăng dần theo cặp tỷ lệ E/S 1,0/0,78; 1,25/0,975; 1,5/1,17 1,75/1,365 mốc thời gian phản ứng 240 phút tương ứng 41,21±0,30; 40,23±1,73; 57,74±3,24; 37,41±0,56 (Hình 4.3 Hình 4.4) Hình 3: Đồ thị thể thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỷ lệ E/S thời gian thủy phân thịt dè cá tra enzyme papain Hình 4: Hiệu suất tyrosin từ trình thủy phân thịt dè cá tra enzyme papain 16 Hình 4.5: Đồ thị thể thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỉ lệ E/S thời gian thủy phân thịt dè cá tra enzyme neutrase Hình 4.6: Hiệu suất tyrosin từ trình thủy phân thịt dè cá tra enzyme neutrase theo tỉ lệ E/S thời gian Hiệu suất thủy phân enzyme neutrase tăng dần theo cặp tỷ lệ E/S 0,5/0,78; 0,625/0,975; 0,75/1,17 0,875/1,365 mốc thời gian phản ứng 240 phút tương ứng 35,00±0,30%; 42,69±0,50%; 34,25±0,53% 31,52±0,51% (Hình 4.5 Hình 4.6) 4.2.3.2 Hiệu suất thủy phân đạm amine bằn phươn pháp OPA Hiệu suất thủy phân enzyme dựa vào hàm lượng đạm amine hiệu suất thủy phân enzyme bromelain lớn enzyme papain hiệu suất thủy phân enzyme neutrase tương ứng 71,02±3,82% > 67,22±1,26% >52,51±2,33 4.2.3.3 Hàm lượn acid amin tron trình thủy phân thịt dè cá bằn enzyme n oại bào (bromelain, papain neutrase) Kết thủy phân thịt dè enzyme neutrase, papain, bromelain hàm lượng acid amin tương ứng 7,96, 10,16, 11,25 (mg/100 mL) 17 ... từ nguồn phụ phẩm này, chủ yếu dùng làm nguyên liệu sản xuất bột cá Do vậy, vi? ??c nghiên cứu ứng dụng enzyme protease chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụng làm môi trường nuôi. .. u sử dụn protein thủy phân máu cá tra n dụn ni cấy vi sinh vật a) Thí nghiệm Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân máu cá tra ni cấy khuẩn Bacillus subtilis b) Thí nghiệm: Nghiên cứu sử dụng protein. .. c u sử dụn protein thủy phân n dụn ni cấy vi sinh vật 3.3.4.1 Thí n hiệm 8: N hiên c u sử dụn protein thủy phân thịt dè cá tra n dụn nuôi cấy vi sinh vật a) Thí nghiệm: Nghiên cứu sử dụng protein