Ứng dụng enzyme và siêu âm phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma lucidum

ĐỒN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH BAN CHẤP HÀNH TP HỒ CHÍ MINH CƠNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA LẦN THỨ XX NĂM 2018 TÊN CƠNG TRÌNH: ỨNG DỤNG ENZYME VÀ SIÊU ÂM PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH Mã số cơng trình: …………………………… (Phần BTC Giải thưởng ghi) i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH viii TÓM TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ Lí chọn đề tài 2 Mục đích 3 Mục tiêu Nội dung Đối tượng nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn, quy mô phạm vi áp dụng 7.1 Ý nghĩa khoa học 7.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nấm Linh chi bào tử nấm Linh chi 1.1.1 Giới thiệu nấm Linh chi 1.1.1.1 Phân loại 1.1.1.2 Đặc điểm sinh học nấm Linh chi 1.1.2 Bào tử nấm Linh chi 11 1.2 Thành phần hóa học chủ yếu nấm Linh chi bào tử nấm Linh chi 14 1.2.1 Các polysaccharide peptidoglycan 17 1.2.2 Triterpenes 18 1.2.3 Saponin 24 1.2.4 Acid béo 25 1.2.5 Các thành phần khác 26 1.3 Công dụng nấm Linh chi bào tử nấm Linh chi 27 1.3.1 Phòng chống ung thư 28 ii 1.3.2 Khả kháng oxi hóa 30 1.3.3 Điều trị bệnh đái tháo đường 30 1.3.4 Điều trị bệnh tim mạch 31 1.3.5 Tăng cường hệ miễn dịch 31 1.4 Phương pháp phá vỡ trích ly hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi 32 1.4.1 Giới thiệu nấm Trichoderma 32 1.4.1.1 Phân loại 33 1.4.1.2 Đặcđiểm chung Trichoderma 33 1.4.1.3 Các sản phẩm trao đổi chất Trichoderma 36 1.4.1.4 Các hệ enzyme nấm Trichoderma sinh enzyme tổng hợp 36 1.4.2 Giới thiệu enzyme thương mại 41 1.4.3 Cơ chế phân hủy chitin vách bào tử nấm Linh chi 41 1.4.4 Giới thiệu siêu âm phá tế bào 42 1.4.4.1 Khái niệm 42 1.4.4.2 Bản chất sóng âm 43 1.4.4.3 Nguyên lý tác động sóng siêu âm 44 1.4.4.4 Tác động sóng siêu âm lên tế bào 45 1.4.4.5 Ứng dụng sóng siêu âm 46 1.4.4.6 Thiết bị phát sóng siêu âm 46 1.4.5 Các phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi 48 1.4.6 Phương pháp trích ly hoạt chất thu dầu bào tử 51 PHẦN II: MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 56 2.1 Mục tiêu 56 2.2 Phương pháp nghiên cứu 56 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 56 2.2.2 Thiết bị - dụng cụ - hóa chất 56 2.2.2.1 Thiết bị 56 2.2.2.2 Dụng cụ 57 2.2.2.3 Hóa chất 57 iii 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu 59 2.2.4 Khảo sát enzyme T harzianum T2 chế phẩm thương mại C20032 62 2.2.5 Phương pháp nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 62 2.2.5.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 môi trường thạch PDA 62 2.2.5.2 Thu enzyme dịch trích ly phương pháp tăng sinh môi trường lỏng 62 2.2.5.3 Phương pháp xác định hoạt lực enzyme chitinase dịch nuôi cấy T.harzianum T2 chế phẩm enzyme C20032 62 2.2.6 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu enzyme chitinase dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 enzyme chế phẩm C20032 64 2.2.7 Phương pháp xác định tỷ lệ kết hợp dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 chế phẩm thương mại cellulase C20032 66 2.2.8 Khảo sát nồng độ tối ưu chế phẩm thương mại cellulase C20032 kết hợp với dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 68 2.2.9 Khảo sát thời gian xử lí enzyme siêu âm thích hợp để phá vỡ bào tử 68 2.2.10 Khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lí bào tử 70 2.2.11 Khảo sát thành phần hóa học bào tử phá vỡ 71 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 74 3.1 Khảo sát hiệu xử lí bào tử nấm Linh chi có kết hợp chế phẩm thương mại cellulase C20032 dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harziamum T2 74 3.1.1 Kết định tính định lượng enzyme có chế phẩm thương mại cellulase C20032 dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harziamum T2 74 3.1.1.1 Kết định tính enzyme chế phẩm thương mại cellulase C20032 10% Trichoderma harziamum T2 74 3.1.1.2 Kết định lượng enzyme có dịch ni cấy T harziamum T2 chế phẩm thương mại C20032 (10%) 75 iv 3.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt lực enzyme chitinase dịch nuôi cấy T.harzianum T2 76 3.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt động enzyme chitinase chế phẩm C20032 (10%) 77 3.1.4 Ảnh hưởng tỉ lệ phối hợp enzyme T harzianum T2 enzyme thương mại lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi theo thời gian ủ enzyme 78 3.1.5 Kết tỉ lệ bào tử nấm Linh chi bị phá vỡ thay đổi nồng độ chế phẩm C20032 kết hợp dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 80 3.2 Tăng tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi kết hợp xử lý enzyme sóng siêu âm 82 3.3 Kết ảnh hưởng phương pháp tiền xử lý lạnh đông lên tỉ lệ phá vỡ bào tử 85 3.4 Kết định tính định lượng thành phần có bào tử nấm Linh chi 87 3.4.1 Định lượng hoạt chất thu từ dịch bào tử bào tử bị phá vỡ 88 3.4.1.1 Định lượng polysaccharide dịch trích ly bào tử mẫu không siêu âm mẫu kết hợp siêu âm phương pháp Phenol – Sulfuric 88 3.4.1.2 Định lượng lipid dịch trích ly bào tử mẫu khơng siêu âm mẫu siêu âm phương pháp Adam – Rose – Gottlieb 91 3.5 Đề nghị quy trình phá vỡ bào tử nấm Linh chi thu hoạt chất 93 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 96 4.1 Kết luận 96 4.2 Kiến nghị 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO 98 Tài liệu tiếng Việt 98 Tài liệu tiếng Anh 98 PHỤ LỤC A – VẬT LIỆU PHỤ LỤC B – PHƯƠNG PHÁP PHỤ LỤC C – MỘT SỐ HÌNH ẢNH KẾTQUẢ 11 PHỤ LỤC D – KẾT QUẢ XỬ LÍ ANOVA 15 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT PDA: Potato Dextro Agar EC: Enzyme Cellulase C20032 DD: Dung dịch DTL: Dịch trích ly DNC: Dịch ni cấy ĐC: Đối chứng KSA: Không siêu âm SA: Siêu âm PHC: Pha hữu PN: Pha nước DI: Diethyl ether BT: Bào tử vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn mẫu vật khác (Lê Xuân Thám, 1996) 11 Bảng 1.2 Thành phần dược tính nấm Linh chi 14 Bảng 1.3 Hàm lượng hoạt chất sinh học thể bào tử nấm Linh chi (Li JJ cộng (2014)) 16 Bảng 1.4 So sánh khả ức chế ung thư vú phận trạng thái khác nấm Linh chi (2,5 mg/mL) 29 Bảng 1.5 Những nghiên cứu phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi Thế giới 49 Bảng 1.6 Các phương pháp trích ly 51 Bảng 1.7 Các dung môi chiết xuất lipid Ganoderma lucidum (CN1099455C) 54 Bảng 2.1 Bảng dựng đường chuẩn glucosamine 62 Bảng 2.2 Bảng bố trí thay đổi tỉ lệ enzyme dịch ni cấy chế phẩm thương mại cellulase C20032 10% 67 Bảng 2.3 Bảng bố trí thay đổi tỉ lệ nồng độ chế phẩm thương mại cellulase C20032 (xác định tỉ lệ E/S tối ưu) 68 Bảng 3.1 Vịng phân giải enzyme có chế phẩm thương mại C20032 dịch nuôi cấy T harziamum T2 74 Bảng 3.2 Kết định lượng enzyme có dịch ni cấy Trichoderma harziamum T2 chế phẩm thương mại cellulase C20032 10% 75 Bảng 3.3 Kết khảo sát hoạt lực enzyme chitinase điều kiện nhiệt độ pH thay đổi 76 Bảng 3.4 Kết khảo sát hoạt lực enzyme chitinase có mặt chế phẩm thương mại cellulase C20032 10% điều kiện pH 77 Bảng 3.5 So sánh tỉ lệ phá vỡ tỉ lệ enzyme mốc thời gian 78 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm thương mại cellulase C20032 kết hợp enzyme T.harzianum T2 lên hiệu phá vỡ bào tử nấm Linh chi theo thời gian 80 vii Bảng 3.7 Bảng tổng hợp tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi theo ngày thời gian siêu âm 83 Bảng 3.8 Ảnh hưởng chế độ lạnh động tiền xử lý lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi 85 Bảng 3.9 Bảng tổng kết thử nghiệm tất pha trích ly dịch phá vỡ bào tử vỏ bào tử 87 Bảng 3.10 Bảng mật độ quang dịch D-glucose chuẩn 89 Bảng 3.11 Hàm lượng polysaccharide có dịch phá vỡ bào tử vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ enzyme kết hợp siêu âm không siêu âm (Hiệu suất thu hồi polysaccharide) 89 Bảng 3.12 Bảng phân tích hàm lượng polysaccharide hai pha trích ly lỏng lỏng dịch phá vỡ bào tử diethyl ether từ 100 g bào tử không siêu âm siêu âm 91 Bảng 3.13 Hàm lượng lipid có dịch phá vỡ bào tử vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách enzyme kết hợp siêu âm không siêu âm (hiệu suất thu hồi lipid tổng) 91 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A), nấm mọc tự nhiên (B) nấm trồng (C) Hình 1.2 Hình thái giải phẫu thể nấm Linh chi Ganoderma lucidum 11 Hình 1.3 Bào tử nấm Linh chi kính hiển vi phóng to 3000 lần 13 Hình 1.4 Các kiểu hình bào tử đặc thù họ nấm Linh chi 13 Hình 1.5 Cấu trúc Ganodermasides 16 Hình 1.6 Cấu trúc khơng gian polysaccharide nấm Linh chi 18 Hình 1.7 Cơng thức số triterpene nấm Linh chi (Kubota cộng sự, 1982; Helv Chim Acta 65: 611-9; Nishitoba cộng sự, 1984; Agric Biol Chem 48: 2905-7; Sato cộng sự, 1986; Agric Biol Chem 50: 2887- 90; Budavari cộng sự, 1989) 20 Hình 1.8 Cấu trúc khơng gian 29 loại triterpenoids bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma cộng sự, 2011) 22 Hình 1.9 Tên 29 triterpenoids bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma cộng sự, 2011) 23 Hình 1.10 Các dạng sản phẩm nấm Linh chi bào tử nấm Linh chi 28 Hình 1.11 Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy môi trường thạch dịch chiết khoai tây (PDA) 33 Hình 1.12 Sợi nấm cuống bào tử Trichoderma harzianum 34 Hình 1.13 Cấu trúc chitin 38 Hình 1.14 Cơ chế hoạt động hệ enzyme chitinase 34 Hình 1.15 Cấu tạo cellulose 40 Hình 1.16 Quá trình phân hủy chitin thành chitosan cellulose 42 Hình 1.17 Quá trình hình thành, phát triển vỡ bọt khí 45 Hình 1.18 Thiết bị phát sóng siêu âm dạng 47 Hình 1.19 Máy phá mẫu, tế bào sóng siêu âm Qsonica Q500 48 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 61 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ pH tối ưu 65 ix Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp dịch nuôi cấy chế phẩm thương mại cellulase C20032 10% 67 Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát thời gian siêu âm 69 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lí bào tử 70 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng siêu âm lên thành phần hóa học 72 Hình 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt lực chitinase dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 77 Hình 3.2 Hoạt lực enzyme chitinase có chế phẩm thương mại cellulase C20032 10% điều kiện pH 78 Hình 3.3 So sánh tỉ lệ % phá vỡ bào tử nấm Linh chi thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp dịch nuôi cấy chế phẩm thương mại cellulase C20032 10% theo thời gian 80 Hình 3.4 Tỷ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi thay đổi nồng độ chế phẩm thương mại 81 Hình 3.5 Vịng phân giải hỗn hợp enzyme đĩa thạch chứa chitin theo thời gian ủ với bào tử: a)Ngày 0; b) Ngày 3; c) Ngày 7, d) Ngày 9; e) Ngày 10 82 Hình 3.6 So sánh tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi sau xử lý enzyme siêu âm mức thời gian khác 84 Hình 3.7 a) Bào tử nấm Linh chi trước xử lý enzyme; b) Sau xử lý enzyme T.harzianum T2 + C20032 10% tỉ lệ 1:1 500C sau 10 ngày; c) Sau xử lý enzyme kết hợp siêu âm 86 Hình 3.8 Biểu đồ polysaccharide tổng (%) có dịch phá vỡ bào tử vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách enzyme kết hợp siêu âm khơng siêu âm 90 Hình 3.9 Biểu đồ hàm lượng lipid có dịch phá vỡ bào tử vỏ bào tử từ 100g bào tử âm phá vỡ vách enzyme kết hợp siêu âm không siêu 92 Hình 3.10 Biểu đồ hàm lượng lipid có dịch phá vỡ bào tử vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách enzyme kết hợp siêu âm không siêu âm 94 38 20:02 Thursday, July 5, 2017 D1: ngày 2, D2: ngày 3, D3: ngày 5, D4: ngày 6, D5: ngày 7, D6: ngày 8,D7: ngày 10 P1: không siêu âm, P2: siêu âm 5phút The GLM Procedure Class Level Information Class D6P DP Levels Values K 123 14 D1P1 D1P2 D2P1 D2P2 D3P1 D3P2 D4P1 D4P2 D5P1 D5P2 D6P2 D7P1 D7P2 Number of Observations Read Number of Observations Used The GLM Procedure Dependent Variable: Y 42 42 39 F Source DF Model 1.806343 Root MSE 1.344003 Y Mean 43.67733 Source K DP DF 13 Type I SS 0.962435 9203.921763 Mean Square F Value 0.481217 0.27 707.99398 391.95 Pr > F 0.7682 F 7682 F 0.0053 Y Mean 69.18600 F Value 9.43 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 4.569789 Critical Value of t 2.3 0600 Least Significant Difference Pr > F 0.0053 46 4.0 25 Means with the same letter are not significantly different t Mean N timesieu Grouping am A 74.283 B 69.623 4.5 B C B 67.318 3.5 C C 65.520 2.5 XỨ LÍ ANOVA ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẾ ĐỘ TIỀN XỬ LÍ ‘KET QUA DEM BAO TU NGAY 5’ The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU A196 A20 A4 A70 KLD Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TYLE Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 8246.230907 2061.557727 Error 10 456.407267 45.640727 Corrected Total 14 8702.638173 45.17 F 8246.230907 2061.557727 The ANOVA Procedure 45.17 F Model 654.1475667 218.0491889 Error 4.6396000 0.5799500 Corrected Total 11 658.7871667 375.98 F 654.1475667 218.0491889 The ANOVA Procedure 375.98 F Model 1229.619063 175.659866 Error 16 9.307733 0.581733 Corrected Total 23 1238.926796 301.96 F 1229.619063 175.659866 The ANOVA Procedure 301.96