Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic trong bảo quản hạt đậu phộng

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Sinh viên thực luận văn Trần Thanh Thảo ỜI C M N Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Công nghệ TP HCM tạo điều kiện cho chúng em học tập Trường Em xin chân thành biết ơn dạy dỗ tận tình tồn thể q thầy Viện Khoa học Ứng dụng Hutech, Trường Đại học Công nghệ TP HCM cho chúng em kiến thức quan trọng suốt thời gian qua, nhờ chúng em có tri thức quý giá để làm hành trang cho đường nghiệp phía trước Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Hoài Hương trang bị cho em kiến thức bổ ích ln theo sát q trình làm việc em để kịp thời hướng dẫn khắc phục lỗi sai để công việc đạt kết tốt Cô chia động viên em cơng việc chưa ổn giúp em tìm niềm vui thấy thành gặt hái Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tiếp cho em nghị lực, bình n tâm hồn, ln bên em lúc khó khăn Em xin cảm ơn tới người bạn gắn bó, động viên giúp đỡ em suốt quãng thời gian thực đồ án tốt nghiệp Cuối c ng, em xin cảm ơn Thầy Cô Hội Đồng Phản Biện dành thời gian đọc nhận x t đồ án tốt nghiệp Em xin gửi đến Thầy Cô lời chúc sức khỏe va Trong tr nh làm đồ án, kinh nghiệm c n thiếu kiến thức chưa đầy đủ, nên có nhiều thiếu sót, mong Thầy Cơ bỏ qua Sinh viên thực Trần Thanh Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC B NG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU CHƯ NG I: TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan nấm 1.1.1.Tổng quan Aspergillus sp 1.1.1.1.Phân loại khoa học 1.1.1.2.Đặc điểm hình thái 1.1.1.3.Quá trình dinh dưỡng sinh trưởng 1.1.2.Tác hại độc tố Aflatoxin 1.1.2.1.Tác hại nấm gây cho người 1.1.2.2.Tác hại nấm gây cho động vật 1.1.3.Các phương pháp khử nhiễm độc tố 1.1.3.1.Phương pháp vật lý học 1.1.3.2.Phương pháp hóa học 11 1.1.3.3.Phương pháp sinh học 12 1.2.Tổng quan bảo quản hạt giống 15 1.3.Tổng quan vi khuẩn lactic 16 1.3.1.Giới thiệu chung 16 1.3.2.Đặc điểm hình thái 17 1.3.3.Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 19 1.3.4.Nhu cầu dinh dưỡng 20 1.3.4.1.Nguồn cacbon 20 1.3.4.2.Nguồn nito 20 i 1.3.4.3.Nguồn vitamin 21 1.3.4.4.Các chất hữu khác 21 1.3.4.5.Các muối vô khác 21 1.3.4.6.Nguồn oxy 22 1.3.5.Khả kháng nấm vi khuẩn lactic hợp chất kháng nấm 22 1.3.5.1.Khả kháng nấm vi khuẩn lactic 22 1.3.5.2.Các hợp chất kháng nấm 23 CHƯ NG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯ NG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1.Địa điểm nghiên cứu 29 2.2.Thời gian thực 29 2.3.Vật liệu nghiên cứu 29 2.3.1.Vật liệu 29 2.3.2.Hóa chất sử dụng 29 2.3.3.Môi trường sử dụng 30 2.3.4.Thiết bị 30 2.4.Phương pháp luận 30 2.4.1.Mục tiêu đồ án 30 2.4.2.Nội dung 30 2.5.Phương pháp nghiên cứu 31 2.5.1.Sơ đồ nghiên cứu 31 2.5.2 Phương pháp khảo sát độ khiết chủng vi khuẩn lactic Lactobacilus sp (L5), Lactobacillus sp (L3), Lactobacillus sp (L2N) chủng nấm mốc Aspergillus sp CDP1 32 2.5.2.1.Khảo sát độ khiết vi khuẩn lactic 33 2.5.2.2.Chủng nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 38 2.5.3 Phương pháp khảo sát khả đối kháng trực tiếp vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus spp 39 ii 2.5.4.Phương pháp khảo sát môi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic 40 2.5.5.Phương pháp khảo sát khả bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 43 CHƯ NG III: KẾT QU VÀ TH O LUẬN 51 3.1.Khảo sát tính khiết chủng vi khuẩn lactic L5, L3, L2N 51 3.1.1.Quan sát hình thái khuẩn lạc 51 3.1.2.Nhuộm gram 52 3.1.3.Nhuộm bào tử 53 3.1.4.Thử nghiệm Catalase 54 3.1.5.Thử nghiệm khả lên men đường 55 3.1.6.Thử nghiệm khả di động 57 3.2.1.Xác định hàm lượng acid tổng 59 3.2.2.Khả tạo màng biofilm 63 3.3.Khảo sát phát triển chủng Aspergillus sp CĐP1 khả kháng nấm vi khuẩn lactic 63 3.3.1.Sự phát triển nấm CĐP1 63 3.3.2.Khả kháng nấm trực tiếp vi khuẩn lactic 65 3.4.Lên men vi khuẩn lactic 66 3.4.1.Sinh khối chủng vi khuẩn môi trường MRS bắp cải 66 3.4.2.Hàm lượng acid tổng (%) chủng vi khuẩn môi trường MRS bắp cải 68 3.4.3.Sự tạo màng biofilm chủng vi khuẩn lactic môi trường MRS bắp cải 70 3.4.4.Khả kháng nấm CĐP1 chủng vi khuẩn lactic môi trường MRS bắp cải 71 3.5.Khảo sát khả bảo quản hạt đậu phộng 73 iii 3.6.Sơ đồ quy trình bảo quản hạt đậu phộng từ chủng Lactobacillus sp L5, L2N, L3 77 CHƯ NG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 4.1 Kết luận 79 4.2 Kiến nghị 79 TÀI LIỆU THAM KH O 80 PHỤ LỤC 82 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactic acid bacteria/ Lactobacillales VSV Vi sinh vật VK Vi Khuẩn BVTV Bảo vệ thực vật MRS de Man, Rogosa and Sharpe PDA Potato Detrose Agar ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm NT Nghiệm thức KĐC Không điều chỉnh v DANH MỤC B NG Bảng 1.1: Tóm tắt chế khử nhiễm sinh học số chủng vi khuẩn Bảng 1.2: Text sinh hóa Lactobacillus Bảng 1.3: Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men (Corsetti cộng sự, 1998) Bảng 1.4: Cơ chế kháng nấm số hợp chất tóm tắt qua bảng Bảng 1.5: Bảng tóm tắt chủng vi khuẩn lactic L5, L3 L2N Bảng 1.6: Acid lactic giá trị OD bước sóng nm sau 66 nuôi cấy chủng Lactobacillus spp Bảng 1.7: Số liệu thống kê tỉ lệ phần trăm ức chế phát triển nấm CĐP1 Bảng 1.8: Số ngày mọc nấm thí nghiệm khơng cảm nhiễm cảm nhiễm vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình dáng tế bào Aspergillus Hình 1.2: Hình dáng tế bào Lactobacillus Hình 1.3: Cấu trúc phân tử hợp chất kháng nấm: (a) 4-hydroxy-phenyllactic acid, (b) 3-phenyllactic acid, (c) 3-hydroxydecanoic acid, (d) 3-hydroxydodecanoic acid, e) 3-hydroxytetradecanoic acid, (f) 3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid, (g) Cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin mevalonolactone, (h) methylhydantoin, (i) mevalonolactone, (j) Caproic acid, (k) Propionic acid, (l) Butyric acid, (m) Acetic aicd, (n) Formic acid, (o) n-valeric acid Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu Hình 3.1: Khuẩn lạc chủng Lactobacillus spp đĩa MRS Agar Hình 3.2: Kết nhuộm gram vi khuẩn (từ trái qua phải) vi khuẩn E.coli gram âm, vi khuẩn Bacillus subtilis gram dương, vi khuẩn Lactobacillus sp L5 Hình 3.3: Kết nhuộm bào tử vi khuẩn (từ trái qua qua phải) vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử, vi khuẩn Lactobacillus sp L5 không sinh bào tử Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 (trái qua phải: thử nghiệm âm tính vi khuẩn L5, đối chứng âm vi khuẩn lactic nước cất, thử nghiệm dương tính với vi khuẩn Bacillus subtilis) Hình 3.5: Khả lên men loại đường vi khuẩn Lac obacillus sp L3 A – Glucose; B – Fructose; C – Sucrose; D – Manose; E – Manitol; F – Galactoe Hình 3.6: Thử nghiệm tính di động chủng Lactobacillus sp L5 chủng vi khuẩn đối chứng Bacillus subtilis vii Hình 3.7: So sánh acid lactic giá trị OD bước sóng nm sau 24 nuôi cấy chủng Lactobacillus spp Hình 3.8: Đồ thị so sánh chủng vi khuẩn lactic tạo màng điều kiện lắc không lắc Hình 3.9: (trái qua phải Khả phát triển chủng nấm Aspergillus sp CĐP1 môi trường MRS Agar cải tiến PDA Hình 3.1 : Đồ thị so sánh kháng nấm trực tiếp chủng vi khuẩn Hình 3.11: Độ đục dịch ni cấy Lactocbacillus sp L5 mơi trường Hình 3.12: Độ đục dịch nuôi cấy Lactocbacillus sp L2N môi trường Hình 3.13: Độ đục dịch ni cấy Lactocbacillus sp L2N mơi trường Hình 3.14: Nồng độ acid tổng Lactobacillus sp L5 môi trường Hình 3.15: Nồng độ acid tổng Lactobacillus sp L2N mơi trường Hình 3.16: Nồng độ acid tổng Lactobacillus sp L3 mơi trường Hình 3.17: Đồ thị so sánh khả tạo màng biofilm chủng vi khuẩn mơi trường Hình 3.18: Khả kháng nấm mốc chủng vi khuẩn L5 môi trường nuôi cấy so với đối chứng + Daconil 5g l đối chứng (- nước cất (A – đối chứng (+), B – đối chứng (-), C – môi trường MRS, D – môi trường bắp cải) Hình 3.19: Biểu đồ thể tỉ lệ kháng nấm (%) chủng vi khuẩn môi trường với đối chứng (+) Daconil viii 0.850892 Source DF MOITRUONG MOI TRUONG 9.604433 Anova SS TOI 3.784867 UU 39.40750 Mean Square 653.9790917 L2N; F Value 217.9930306 RUN;DATA; Pr > F 15.22 INPUT 0.0011 MOITRUONG $ TILEKHANGNAM; CARDS;DC 23.89DC 25.37DC 142 21:00 Thursday, April 30, 2018 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TILEKHANGNAM NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t 14.32522 2.30600 Least Significant Difference 7.1263 Means with the same letter are not significantly different 104 t Grouping A Mean N MOITRUONG 45.070 L2N_NG 44.333 L2N_BC A 41.380 L2N_MRS B 26.847 DC A A A D.1.4 Vòng kháng nấm VONG UC CHE NAM‘ The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CHUNG l2 l3 l5 Number of Observations Read Number of Observations Used VONG UC CHE NAM‘ 105 The ANOVA Procedure Dependent Variable: VONGUCCHE Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 9.84206956 4.92103478 Error 12.39314267 2.06552378 Corrected Total 22.23521222 2.38 0.1731 R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean 0.442634 3.306899 1.437193 Source DF Anova SS CHUNG 43.46044 Mean Square F Value Pr > F 9.84206956 4.92103478 2.38 ‗VONG UC CHE NAM‘ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE 0.05 Alpha 106 0.1731 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 2.065524 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 2.8714 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CHUNG A 44.669 l3 A A 43.594 l2 A A 42.118 l5 107 D.2 So sánh khả tạo màng biofilm chủng vi khuẩn LAB môi trường D.2.1 Chủng L5 DATA; INPUT MOITRUONG $ OD; CARDS; DC 0.000 DC 0.000 DC 0.000 L5_MRS 0.174 L5_MRS 0.169 L5_MRS 0.145 L5_NG 0.454 L5_NG 0.414 L5_NG 0.401 L5_BC 0.420 L5_BC 0.419 L5_BC 0.441 ; PROC ANOVA; CLASS MOITRUONG; MODEL OD = MOITRUONG; MEANS MOITRUONG / LSD; MEANS MOITRUONG/ LSD ALPHA = 0.05; TITLE ‗KHA NANG TAO BIOFILM L5; RUN; KHA NANG TAO BIOFILM L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ OD; CARDS;DC 0.000DC 0.000DC 0.000L5_ 112 21:00 Thursday, April 30, 2018 108 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MOITRUONG DC L5_BC L5_MRS L5_NG Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 KHA NANG TAO BIOFILM L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ OD; CARDS;DC 0.000DC 0.000DC 0.000L5_ 113 21:00 Thursday, April 30, 2018 The ANOVA Procedure Dependent Variable: OD Sum of Source DF Model Error Corrected Total Squares Mean Square F Value Pr > F 0.13122919 453.43 F 453.43 F 0.07188733 145.79 F 145.79 F 0.04515144 165.59 F 165.59