Ảnh hưởng của các chất đều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình phát sinh hình thái trong quy trình nhân giống cây hoa huệ hương

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v LỜI MỞ ĐẦU - CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .- 1.1 Nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào - 1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật - 1.3 Cơ sở lý luận nuôi cấy mô tế bào thực vật - 1.4 Ưu, nhược điểm phương pháp nhân giống in vitro - 1.5 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro - 1.6 Các hướng nhân giống vơ tính in vitro - 11 1.7 Quy trình nhân giống in vitro - 12 1.7.1 Lấy mẫu xử lý mẫu - 12 1.7.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy - 12 1.7.3 Nhân nhanh chồi - 12 1.7.4 Tái sinh rễ .- 13 1.7.5 Đưa in vitro vườn ươm .- 13 1.8 Sơ lược đối tượng nghiên cứu - 13 1.8.1 Nguồn gốc .- 13 1.8.2 Phân loại - 13 1.8.3 Đặc điểm thực vật học - 14 1.8.4 Yêu cầu ngoại cảnh hoa Huệ Hương - 14 1.8.5 Kỹ thuật trồng chăm sóc - 16 1.8.6 Vấn đề sâu bệnh hoa Huệ Hương - 18 1.8.7 Giá trị kinh tế - 19 1.9 Tình hình sản xuất hoa huệ nước - 20 i Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 22 2.1 Địa điểm thực đề tài - 22 2.2 Đối tượng nghiên cứu - 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu - 23 2.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu cấy - 23 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy khởi động - 23 2.3.3 Phương pháp nhân nhanh .- 23 2.3.4 Phương pháp tạo hoàn chỉnh - 23 2.3.5 Phương pháp ươm - 24 2.4 Bố trí thí nghiệm - 24 2.5 Các tiêu theo dõi - 27 2.6 Thu thập xử lý số liệu - 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 28 Thí nghiệm Xác định phương pháp khử trùng mẫu nuôi cấy phần đỉnh mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương - 28 Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng thực vật lên tới q trình phát sinh hình thái mẫu cấy - 31 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ - 40 4.1 Kết luận - 40 4.2 Đề nghị - 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO .- 42 PHỤ LỤC - 46 - ii Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng HgCl2 0,1% mức thời gian khác đến hiệu khử trùng mẫu cấy 28 Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng việc kết hợp HgCl2 0,1% Ca(OCl)2 15% đến hiệu khử trùng mẫu cấy 29 Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng kinetin lên khả phát sinh hình thái mẫu cấy 29 Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng BA đến khả phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy 29 Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp BA auxin khác lên khả phát sinh hình thái mẫu cấy 30 Bảng 3.1 Ảnh hưởng HgCl2 0,1% mức thời gian khác đến hiệu khử trùng mẫu cấy sau tuần nuôi cấy 32 Bảng 3.2 Ảnh hưởng việc kết hợp HgCl2 0,1% 15 phút Ca(OCl)2 15% đến hiệu khử trùng mẫu sau tuần nuôi cấy 33 Bảng 3.3 Ảnh hưởng kinetin lên khả phát sinh hình thái mẫu cấy sau tuần nuôi cấy 35 Bảng 3.4 Ảnh hưởng ảnh hưởng BA đến khả phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy sau tuần nuôi cấy 37 Bảng 3.5 Ảnh hưởng kết hợp BA auxin khác lên khả phát sinh hình thái mẫu cấy sau tuần ni cấy 40 iii Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Polianthes tuberose L 13 Hình 2.1 Hoa Huệ Hương 26 Hình 2.2 Củ hoa Huệ Hương 26 Hình 3.1 Mẫu phát sinh hình thái mơi trường MS + 30g/l saccaroza + g/l agar + 2mg/l Kinetin 36 Hình 3.2 Mẫu phát sinh hình thái mơi trường MS + 30g/l saccaroza + g/l agar + 4mg/l BA 39 Hình 3.3 Mẫu phát sinh hình thái mơi trường MS + 30g/l saccaroza + g/l agar + 0,25mg/l IBA + 4mg/l BA 41 Hình 3.4 Mẫu phát sinh hình thái mơi trường MS + 30g/l saccaroza + g/l agar + 0,25mg/l 2,4D + 4mg/l BA 41 Hình 3.5 Mẫu phát sinh hình thái mơi trường MS + 30g/l saccaroza + g/l agar + 0,25mg/l α-NAA + 4mg/l BA 42 Hình 3.6 Mẫu phát sinh hình thái mơi trường MS + 30g/l saccaroza + g/l agar + 0,25mg/l IAA + 4mg/l BA 42 iv Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MS: Murashige and Skoog, 1962 BA: Benzyl adenin IBA: Indol butyric acid α-NAA: α-naphtyl acetic acid 2,4-D: 2,4 diclorophenoxy acetic acid IAA: Indol acetic acid v Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây hoa Huệ Hương (Polianthes tuberose L.) hoa cắt cành thuộc nhóm thân thảo, thích cường độ ánh sáng cao cho hoa quanh năm Hoa Huệ Hương nhập vào nước ta từ lâu Cây hoa Huệ Hương trồng phổ biến vùng Nam Trung Bộ đem lại thu nhập cao cho người trồng xóa đói giảm nghèo cho vùng chuyên canh loài Hiện nay, việc canh tác hoa Huệ thường chủ yếu nhân giống kỹ thuật nhân giống truyền thống, chủ yếu lấy củ trồng Với phương pháp nhân giống dễ lây lan mầm bệnh có sẵn củ, đặc biệt bệnh virus làm giảm suất phẩm chất hoa, khiến cho giống hoa ngày thối hóa Trong năm gần đây, bệnh hại hoa Huệ Hương xuất nhiều, đặc biệt có bệnh khó trị bệnh chai Tác nhân gây bệnh chưa xác định Bệnh xuất diện rộng làm ảnh hưởng đến suất phẩm chất hoa Bệnh không làm cho chết làm cho chồi, củ, hoa phát triển, làm thất thu nguồn thu nhập nông dân Các triệu chứng bệnh virus mô tả Horner Person (1988), Chen Chang (1998) gần giống biểu hoa Huệ Hương Nam Trung Bộ Vấn đề đặt làm để tạo nguồn giống bệnh cung cấp cho nhân dân? Phương pháp nhân giống in vitro với nhiều ưu điểm, tạo trẻ hóa bệnh nên tiềm sinh trưởng, phát triển suất cao, khắc phục nhược điểm phương pháp nhân giống truyền thống, khôi phục lại phẩm chất vốn có giống Đồng thời hệ số nhân phương pháp nhân giống cao đáp ứng nhu cầu số lượng giống có chất lượng cao, ổn định đáp ứng nhu cầu sản xuất quy mô rộng Cho đến kĩ thuật nuôi cấy mô nghiên cứu ứng dụng có hiệu việc nhân giống hàng loạt loại -1- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ trồng tạo ngân hàng giống bệnh, khỏe mạnh cho suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất Mục đích nghiên cứu Xác định ảnh hưởng chất hòa sinh trưởng thực vật lên trình phát sinh hình thái quy trình nhân giống hoa Huệ Hương kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, làm sở cho việc hình thành quy trình nhân giống in vitro hoa Huệ Hương, góp phần giải khó khăn thực tiễn sản xuất hoa Đối tượng phạm vi nghiên cứu Cây hoa Huệ Hương đối tượng sản xuất giống phương pháp nuôi cấy mô nước ta Xuất phát từ yêu cầu khó khăn thực tiễn, nhằm khắc phục tượng chai hoa Huệ Hương, giống hoa Huệ quý mang lại hiệu cao cho nông dân Trên sở đó, việc nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro hoa Huệ tiến hành thử nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đề tài đưa minh chứng tác động phương pháp khử trùng đến tỷ lệ sống mẫu cây, tác động chất điều tiết sinh trưởng đến khả phát sinh hình thái Kết nghiên cứu đề tài sử dụng nghiên cứu ni cấy mơ tế bào hoa Góp phần sản xuất giống có hiệu cao, chất lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất góp phần nâng cao hiệu kinh tế ngành sản xuất hoa Huệ Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng thực vật đến q trình phát sinh hình thái mầm ngủ củ hoa Huệ Hương Sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật như: kinetin, BA, IBA, α-NAA, 2,4-D, IAA -2- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Là phương pháp nuôi cấy mô tế bào môi trường dinh dưỡng nhân tạo điều kiện vô trùng tái sinh chúng thành Nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào phương pháp bổ sung cho kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ, khắc phục hạn chế phương pháp nhân giống truyền thống 1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1838, sở nghiên cứu độc lập, hai nhà bác học người Đức Schleiden Schwamn khởi xướng học thuyết tế bào Học thuyết cho tế bào đơn vị cấu trúc chức sinh vật, có khả tồn độc lập Gottlibe Haberlandt người đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật vào năm 1902 để chứng minh học thuyết tính tồn tế bào Theo ông tế bào thể mang toàn hệ thống di truyền cần thiết đầy đủ thông tin sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh Ơng tiến hành thí nghiệm với tế bào khí khổng tế bào biệt hóa chức khác khơng thành cơng Điều giảm tin tưởng nhà khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thời gian dài Đến năm 1922 học trò Gottlibe Haberlandt Kotte Robbinss làm lại thí nghiệm ông Họ lấy đỉnh sinh trưởng rễ hịa thảo ni cấy mơi trường có khoáng, đường, đầu rễ sinh trưởng mạnh tạo hệ rễ nhỏ rễ phụ Tuy nhiên sinh trưởng tồn thời gian chuyển sang môi trường Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật White nuôi cấy thành công rễ cà chua môi trường lỏng có chứa đường, muối khống, dịch chiết nấm men Các thí nghiệm ơng thay -3- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ dịch chiết nấm men hỗn hợp vitamin nhóm B : thiamin (B1), nicotinic acid (B3), pyridioxin (B6) Sau lâu Went Thimann tìm chất kích thích sinh trưởng IAA Năm năm sau Gautheret thông báo tái sinh cà rốt, lần phát triển mô sẹo không bị giới hạn Bằng cách thêm IAA vào mơi trường ni cấy, ơng kích thích phát triển mơ biệt hóa vết cắt bề mặt mẫu cấy vô trùng Sau người ta thấy callus trực tiếp ni cấy vô thời hạn Đến năm 1948, Steward xác nhận tác dụng nước dừa mô sẹo cà rốt Trong thời gian nhiều chất sinh trưởng thuộc nhóm auxin tổng hợp naphthylacetiic acid (NAA), 2,4-Diclophenoxyacetic acid (2,4D) Nhiều tác giả nhận thấy với nước dừa, NAA 2,4 D giúp tạo mô sẹo gây phân chia tế bào thành công nhiều đối tượng thực vật trước khó ni cấy Năm 1955, Miller Skoog xác định vai trị chất kích thích sinh trưởng 6-Furfuryl aminopurin (kinetin) Việc phát chất kích thích sinh trưởng, vitamin nước dừa bước tiến quan trọng giai đoạn thứ Năm 1957, Miller Skoog công bố kết nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ auxin/kinetin mơi trường ni cấy hình thành quan, tỷ lệ auxin/kinetin thấp, mơ sẹo có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại tỷ lệ auxin/kinetin tăng, mơ sẹo có khuynh hướng tạo rễ Hiện nay, kết quan sát thấy nhiều loại khác đóng góp nhiều vào việc điều khiển trình sinh trưởng, phát triển phát sinh quan mô tế bào nuôi cấy Thành công Miller Skoog mở đầu cho giai đoạn thứ ba lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Những thành công sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế báo thực vật sản xuất Morel Martin phát triển kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo giống bệnh khoai lang hoa lan Chính hai nhà khoa học mở đầu cho hướng nuôi cấy mô tế bào thực vật, vi nhân giống -4- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ Từ năm 1960, ngồi hướng trên, ni cấy bao phấn hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn tế bào trần phát triển mạnh Các kỷ thuật lai soma dung hợp tế bào trần kỷ thuật chuyển gen phát triển thu thành tựu đáng kể Chúng ta bước vào giai đoạn thứ ni cấy mơ tế bào thực vật Đó giai đoạn nuôi cấy mô tế bào ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, sản xuất chất thứ cấp có hoạt tính sinh học vao nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao 1.3 Cơ sở lý luận nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro học thuyết tính tồn (totipotence) tế bào Theo Haberlandt G (1902), nhà thực vật người Đức, tất tế bào mang tồn lượng thơng tin di truyền thể, gặp điều kiện thích hợp, tế bào có khả tái sinh phát triển thành cá thể hoàn chỉnh Thực tế chứng minh khả tái sinh thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ Hàng trăm loài trồng nhân giống qui mô thương mại cách nuôi cấy môi trường nhân tạo vô trùng tái sinh chúng thành với hệ số nhân giống vô lớn (Murashige, 1980) Quá trình phát sinh hình thái nuôi cấy in vitro thực vật thực chất kết q trình phân hóa phản phân hóa Tất tế bào quan khác thể thực vật bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sự chuyển tế bào phôi sinh thành tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm chức khác gọi phân hóa tế bào Cịn q trình phản phân hóa ngược lại với q trình phân hóa, có nghĩa tế bào phân hóa thành mơ chức khơng hoàn toàn khả phân chia mà điều kiện thích hợp chúng trở dạng phôi sinh tái phân chia Bản chất trình q trình hoạt hóa, ức chế gen Trong trình phát triển cá thể, thời điểm định có số gen định hoạt hóa cho ta tính trạng mới, số gen khác lại bị đình hoạt động Điều -5- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ Bảng 3.5 Ảnh hưởng kết hợp BA auxin khác lên khả phát sinh hình thái mẫu cấy sau tuần nuôi cấy Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ auxin (mg/l) A0 A1 A2 A3 A4 0,25 αNAA 0,25 IAA 0,25 IBA 0,25 2,4D Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ mẫu mẫu mẫu tạo cảm ứng tạo chồi protocorm (%) (%) (%) 68,33 65,83 2,50 88,33 80,83 7,50 87,50 76,67 10,83 76,67 59,17 17,50 80,00 71,67 8,33 Hình thái mẫu tái sinh Chồi mập, xanh, phát triển tốt Protocorm màu xanh, có đường kính 2,5 mm Từ kết bảng 3.5, nhận thấy: Khi bổ sung auxin vào môi trường nuôi cấy, kết hợp auxin cytokinin BA (nghiệm thức A1 đến A4) có tác động tích cực đến phát sinh hình thái mẫu so với trường hợp có BA (nghiệm thức A0) Các nghiệm thức bổ sung auxin α-NAA, IAA, IBA, 2,4D có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái, tỷ lệ mẫu tạo protocorm tỷ lệ mẫu tạo chồi cao nghiệm thức đối chứng (nghiệm thức A0) Như vậy, việc bổ sung loại auxin vào môi trường làm tăng hiệu kích thích mẫu phát sinh hình thái Tuy vậy, nghiệm thức bổ sung IBA có tỷ lệ phát sinh hình thái cao nghiệm thức A0 lại có tỷ lệ mẫu tạo chồi thấp Trên mơi trường MS có 4mg/l BA, nghiệm thức bổ sung loại auxin khác cho kết khác Điều chứng tỏ hiệu auxin khác việc kích thích mẫu phát sinh hình thái khác Tất nghiệm thức bổ sung auxin có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nghiệm thức A0 (khơng bổ sung auxin) Trong loại auxin bổ sung vào môi trường ni - 37 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ cấy nghiệm thức bổ sung 0,25mg/l α-NAA có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao 88,33%, đó, bổ sung 0,25mg/l IBA lại cho kết thấp, tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái nghiệm thức đạt 76,67% Các nghiệm thức bổ sung auxin có số mẫu phát sinh theo hướng tạo rễ vậy, rễ tạo thành ít, ngắn yếu Qua quan sát, nhận thấy chồi tái sinh nghiệm thức có hình thái tốt, xanh mập, cao chồi cao so với chồi nghiệm thức đối chứng Trong đó, bổ sung thêm 0,25mg/l IBA (nghiệm thức A3) có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nghiệm thức đối chứng (nghiệm thức A0) tỷ lệ mẫu tạo chồi lại thấp (59,17%) Hình 3.3 Mẫu phát sinh hình thái Hình 3.4 Mẫu phát sinh hình thái mơi trường MS + 30g/l môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 0,25mg/l saccaroza + 9g/l agar + 0,25mg/l IBA + 4mg/l BA 2,4D + 4mg/l BA - 38 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ Hình 3.5 Mẫu phát sinh hình thái Hình 3.6 Mẫu phát sinh hình thái mơi trường MS + 30g/l mơi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 0,25mg/l saccaroza + 9g/l agar + 0,25mg/l α-NAA + 4mg/l BA IAA + 4mg/l BA Qua thí nghiệm này, với mục tiêu nhân giống in vitro, nhận định rằng: việc kết hợp 4mg/l BA + 0,25mg/l α-NAA (nghiệm thức A1) có ảnh hưởng tốt đến phát sinh hình thái mẫu cấy với tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái 83,33%, tỷ lệ mẫu tạo protocorm 7,5%, tỷ lệ mẫu tạo chồi đồng thời tạo protocorm 80,83% - 39 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Thí nghiệm Xác định phương pháp khử trùng tốt mẫu nuôi cấy phần đỉnh mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương Thí nghiệm 1.1 Khảo sát ảnh hưởng HgCl2 0,1% mức thời gian khác đến hiệu khử trùng mẫu Trong thí nghiệm, khử trùng HgCl2 0,1% 15 phút nghiệm thức có hiệu tốt thí nghiệm Tỷ lệ sống cao đạt 45,83% tỷ lệ mẫu nhiễm chết 54,17% Thí nghiệm 1.2 Khảo sát ảnh hưởng việc kết hợp HgCl2 0,1% 15 phút Ca(OCl)2 15% đến hiệu khử trùng mẫu cấy Phương pháp khử trùng mẫu tốt mắt ngủ củ hoa huệ dùng HgCl2 0,1% 15 phút kết hợp với Ca(OCl)2 15% 20 phút Với chế độ khử trùng tỷ lệ mẫu sống đạt cao 58,33% Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên tới q trình phát sinh hình thái mẫu cấy Thí nghiệm 2.1 Khảo sát ảnh hưởng kinetin lên khả phát sinh hình thái mẫu cấy Kinentin cytokinin tổng hợp sử dụng chủ yếu kỹ thuật ni cấy mơ Trong thí nghiệm này, nồng độ 3mg/l kinetin tối ưu nhất, tỷ lệ mẫu cảm ứng 54,17% tạo chồi 46,67% Thí nghiệm 2.2 Khảo sát ảnh hưởng BA lên khả phát sinh hình thái mẫu cấy BA cytokinin tổng hợp có tác dụng kích thích hình thành, sinh trưởng phát triển chồi Sau tiến hành thí nghiệm, cho thấy 4mg/l BA nồng độ tối ưu thí nghiệm này, tỷ lệ mẫu cảm ứng 73,33% tỷ lệ tạo chồi 66,67% - 40 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ Thí nghiệm 2.3 Khảo sát ảnh hưởng BA với auxin khác lên khả phát sinh hình thái mẫu cấy Mơi trường tối ưu cho mẫu phát sinh hình thái mơi trường MS + 30 g/l saccaroza + g/l agar + 4mg/l BA + 0,25mg/l α-NAA Trên môi trường này, mẫu phát sinh hình thái đạt 88,33%, tỷ lệ mẫu tái sinh tạo chồi đạt cao 80,83% 4.2 Đề nghị Vì thời gian thực có hạn nên em xin đề nghị: - Tiếp tục tiến hành nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh, giai đoạn then chốt quy trình nhân giống in vitro Nó có ý nghĩa tạo hiệu kinh tế cao, thực mục tiêu nhân nhanh giống cho sản xuất nghiên cứu cho chuyển gen, lai tạo giống - Tiến hành nghiên cứu giai đoạn tạo hoàn chỉnh, nuôi cấy mô, in vitro sau kết thúc giai đoạn sống dị dưỡng ống nghiệm chuyển sang sống tự dưỡng tự nhiên cần có rễ khỏe, hồn chỉnh giúp có khả hút nước dinh dưỡng tốt, làm tiền đề cho sinh trưởng phát triển sau - Thực giai đoạn đưa vườn ươm giai đoạn cuối trình nhân giống in vitro Giai đoạn có tính chất định đến khả ứng dụng kỹ thuật nhân giống in vitro nhân giống trồng - 41 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Tạ Như Thục Anh (2002), Nghiên cứu công nghệ nhân nhanh trinh nữ hoàng cung, Luận văn Thạc sĩ khoa học, Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội [2] Lê Trần Bình (1997), Cơng nghệ sinh học thực vật cải tiến trồng, Nhà xuất Nơng nghiệp Hà nội [3] Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Giáo trình Cao học Nơng nghiệp, Nhà xuất Nơng nghiệp Hà nội, Hà Nội [4] Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1978), Phân loại thực vật, Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội [5] Phạm Văn Hiển, Nguyễn Văn Thuận, Phạm Kim Mãn (1988), “Kết bước đầu nghiên cứu di thực Dioscorea floribunđa”, Tạp chí dược học, số 1, trang -10 [6] Nguyễn Xuân Linh (1998), Hoa Kỹ thuật trồng hoa, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội [7] Đinh Thế Lộc, Đặng Văn Đông, Công nghệ trồng hoa cho thu nhập cao, NXB Lao động – xã hội [8] Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, Nhà xuất Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [9] Đinh Thị Phịng, Nguyễn Thị Lý Anh (2007), Công nghệ nuôi cấy mô, Nhà xuất Nông nghiệp [10] Chu Bá Phúc, Lê Huy Hàm, Nguyễn Khánh Vân, Đỗ Năng Vịnh (1999), Áp dụng phương pháp nuôi cấy mô để nhân nhanh loại hồng môn, báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc năm 1999, Hà Nội [11] Mai Thị Tân, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn cộng (1993), “Phục tráng khoai tây Thường Tín phương pháp ni cấy đỉnh sinh - 42 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ trưởng”, Kết nghiên cứu khoa học, Nhà xuất nông nghiệp, Hà nội (trang 90 - 95) [12] Nguyễn Thị Phương Thảo (1998), Nghiên cứu nhân giống in vitro hoa loa kèn, Luận văn Thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội [13] Nguyễn Quang Thạch (2001), Công nghệ sinh học trồng trọt, Giáo trình sau đại học [14] Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2004) , Giáo trình Cơng nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội [15] Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn (2000), Giáo trình Sinh lý thực vật, NXB Nơng Nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội [16] Huỳnh Thị Huế Trang, Lê Hồng Giang, Nguyễn Bảo Toàn (2007), “Phục hồi giống hoa huệ trắng (Polianthes tuberosa Linn) nhiễm bệnh chai nuôi cấy phân sinh mô chồi”, Báo cáo khoa học, Hội nghị khoa học – Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa, 2007 [17] Đặng Phương Trâm (2005), Giáo trình kỹ thuật trồng hoa cảnh, Đại học Cần Thơ [18] Nguyễn Huy Trí (2000), Trồng hoa cảnh gia đình, Nhà xuất Lao Động [19] Nguyễn Văn Uyển (2000), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Tập 1, NXB Nông nghiệp [20] Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội [21] Nguyễn Thị Thanh Y (2009), Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro hoa Huệ Hương (Polianthes tuberose L.), Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội [22] Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nhà xuất Giáo dục, Hà nội - 43 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ Tài liệu tiếng Anh [23] Bajaj P.S (1997), High-tech and micropagation, Publ Spriger, Berlin [24] Bhojwani S.S., Razdan, M.K (1983), Plant tissue culture – Theory and practice, Elsevier Academic Publ., Amsterdam [25] Chaturvedi, H.C., Sinha, M (1979), “Mass propagation of discorea floribunda by tissue culture”, Ext Bull No6 NBRI Lucknow, India [26] Chen CC, Chang CA (1998), “Characterization of a polyvirus causing mild mosaic on tuberose”, Plant Dis 82: 45 – 49 [27] Chin- Chil Chen, Tom Hsiang, Fen-lan Chiang and Chin-An Chang, Molecular Characterization of Tuberose mild mosaic virus and preparation of its antiserum to the coat protein expressed in bacteria [28] D’Amato, F (1997), “Cytogenetics of differentiation in tissue anh cell cultures” In: Applied and Fundamental Aspects of plant cell, tissue and organ culture Eds.J.Reinert and Y.P.S Bajaj, Spriger-Verlag, Berlin, pp 343-357 [29] Debergh P.C and Zimmeiman P.H (1991), Micropagation-Techniques and Application, Kenwer Academi Pube [30] Horner MB, Person MN (1988), “Purification and electron microscopy studies of a probable polyvirus from polianthes tuberose L.”, J Phytopathol, 122: 261266 [31] Hu and Wang (1983), In Evans et al 177, 277 [32] Kozai T, Smith MAL (1995), “Environmental control in plant tissue culture – general introduction and overview” In: Aitken-Christie J, Kozai T, Smith ML (eds) Automation and Environmental Control in Plant Tissue Culture Kluwer Academic Publisher, Dordrecht – Boston – London, pp 301 – 318 [33] Limasset and Cornel (1949), C.R.Acad.Sci Paris 228, 1888-1890 [34] Morel and Martin (1952), C.R.Acad,Sci: 235, 1324 - 1325 [35] Murashige, T., and R.Skoog (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures” Physiol Plant 15: 473-479 - 44 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ [36] Murashige, T., Serpa, M., Jones, J.B (1974), “Colonal multiplication of Gerbera through tissue culture” Hortcience, 9, 175-180 [37] Murashige, T., (1980), “Plant growth substances in commercial uses of tissue culture” In: Plant growth Substances 1979, ed by F.Skoog Springer- Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp 426 – 434 [38] Narayanaswamy S (1997), “Regenneration of plants from tissue cultures” In: applied and Fundamental aspects of plants cell, tissue and Organ culture Eds.J.Reinert and Y.P.S Bajaj Springer – Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp 179 – 145 [39] Nickell, L.G (1973), “Test-tube Approaches to by pass sexx”, Hawaiian Planters Record 58, pp 239 – 314 [40] Saurabh Kulshrestha, Arpna Mehra, Vipin Hallan, Gaurav Raikhy, Raja Ram, Molecular envidence for occurrence of Tuberose mild mottle virus infecting tuberose ( Polianthes tuberosa) in India [41] Shad, R.R., Dalal, K.C (1980), “Propagation of liquorice by axillary bud cultures”, In: Plant tissue culture Genetic Manipulatin and somatic Hybridisation of plant cells Eds.P.S.Rao, M.R.Heble and MS Chadha Bhabha Atomic Research Centre, Bombay [42] Staritsky, G (1970), “Tissue culture of the oil palm (Elaeis guineensis Jacq) as a tool for its vegetative propagation”, Euphytica, 288 – 292 Tài liệu Internet [43] http://en.wikipedia.org/wiki/Special:Search/Polianthes-tuberose [44] http://www.rauhoaquavietnam.vn [45] http://thuviensinhhoc.com/Baigiang/PLTV/index.html - 45 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ PHỤ LỤC Kết xử lý số liệu Thí nghiệm 1.1 Ảnh hưởng HgCl2 0,1% đến hiệu khử trùng mẫu cấy BALANCED ANOVA FOR VARIATE NHIEM FILE TN1 10/ 8/** 18:11 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 NHIEM TY LE MAU NHIEM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 9169.79 1833.96 660.21 0.000 * RESIDUAL 12 33.3342 2.77785 * TOTAL (CORRECTED) 17 9203.12 541.360 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SONG FILE TN1 10/ 8/** 18:11 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 SONG TY LE MAU SONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 1794.79 358.958 206.76 0.000 * RESIDUAL 12 20.8336 1.73613 * TOTAL (CORRECTED) 17 1815.63 106.801 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHET FILE TN1 10/ 8/** 18:11 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CHET TY LE MAU CHET LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 9075.00 1815.00 ****** 0.000 * RESIDUAL 12 12.4995 1.04163 * TOTAL (CORRECTED) 17 9087.50 534.559 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN1 10/ 8/** 18:11 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS NHIEM SONG CHET 80.0000 15.8333 4.16667 66.6667 23.3333 10.0000 3 55.8333 27.5000 16.6667 36.6667 45.8333 17.5000 29.1667 28.3333 42.5000 14.1667 16.6667 69.1667 SE(N= 3) 0.962263 0.760730 0.589244 5%LSD 12DF 2.96506 2.34407 1.81566 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN1 10/ 8/** 18:11 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN - 46 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | NHIEM 18 47.083 23.267 1.6667 3.5 0.0000 SONG 18 26.250 10.334 1.3176 5.0 0.0000 CHET 18 26.667 23.121 1.0206 3.8 0.0000 Thí nghiệm 1.2 Ảnh hưởng HgCl2 0.1% Ca(OCl)2 15% đến hiệu khử trùng mẫu cấy BALANCED ANOVA FOR VARIATE NHIEM FILE TN2 10/ 8/** 18:14 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 NHIEM TY LE MAU NHIEM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 773.333 193.333 154.67 0.000 * RESIDUAL 10 12.5000 1.25000 * TOTAL (CORRECTED) 14 785.833 56.1310 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SONG FILE TN2 10/ 8/** 18:14 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 SONG TY LE MAU SONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 2330.83 582.708 349.62 0.000 * RESIDUAL 10 16.6668 1.66668 * TOTAL (CORRECTED) 14 2347.50 167.679 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHET FILE TN2 10/ 8/** 18:14 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CHET TY LE MAU CHET LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 4551.67 1137.92 682.75 0.000 * RESIDUAL 10 16.6667 1.66667 * TOTAL (CORRECTED) 14 4568.33 326.310 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN2 10/ 8/** 18:14 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS NHIEM SONG CHET 36.6667 46.6667 16.6667 32.5000 49.1667 18.3333 3 24.1667 58.3333 17.5000 20.8333 42.5000 36.6667 17.5000 20.8333 61.6667 SE(N= 3) 0.645497 0.745358 0.745358 - 47 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ 5%LSD 10DF 2.03398 2.34865 2.34865 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN2 10/ 8/** 18:14 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | NHIEM 15 26.333 7.4921 1.1180 4.2 0.0000 SONG 15 43.500 12.949 1.2910 3.0 0.0000 CHET 15 30.167 18.064 1.2910 4.3 0.0000 Thí nghiệm 2.1 Ảnh hưởng kinetin đến khả phát sinh hình thái BALANCED ANOVA FOR VARIATE PSHT FILE TN3 8/ 9/** 22:55 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 PSHT TY LE PHAT SINH HINH THAI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 7836.46 1567.29 ****** 0.000 * RESIDUAL 12 16.6675 1.38896 * TOTAL (CORRECTED) 17 7853.13 461.949 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN3 8/ 9/** 22:55 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CHOI TY LE TAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 5986.46 1197.29 862.04 0.000 * RESIDUAL 12 16.6668 1.38890 * TOTAL (CORRECTED) 17 6003.12 353.125 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN3 8/ 9/** 22:55 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS PSHT CHOI 0.000000 0.000000 30.8333 25.8333 3 63.3333 55.8333 54.1667 46.6667 51.6667 45.0000 47.5000 39.1667 SE(N= 3) 0.680430 0.680417 5%LSD 12DF 2.09664 2.09660 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN3 8/ 9/** 22:55 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - - 48 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | PSHT 18 41.250 21.493 1.1785 2.9 0.0000 CHOI 18 35.417 18.792 1.1785 3.3 0.0000 Thí nghiệm 2.2 Ảnh hưởng BA đến khả phát sinh hình thái BALANCED ANOVA FOR VARIATE PSHT FILE TN4 8/ 9/** 22:50 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 PSHT TY LE PHAT SINH HINH THAI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 11419.4 2283.89 ****** 0.000 * RESIDUAL 12 16.6671 1.38892 * TOTAL (CORRECTED) 17 11436.1 672.712 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN4 8/ 9/** 22:50 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CHOI TY LE TAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 9120.83 1824.17 ****** 0.000 * RESIDUAL 12 16.6679 1.38899 * TOTAL (CORRECTED) 17 9137.50 537.500 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN4 8/ 9/** 22:50 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS PSHT CHOI 0.000000 0.000000 38.3333 18.3333 3 55.8333 32.5000 65.0000 48.3333 73.3333 66.6667 69.1667 54.1667 SE(N= 3) 0.680422 0.680439 5%LSD 12DF 2.09661 2.09667 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN4 8/ 9/** 22:50 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | PSHT 18 50.278 25.937 1.1785 2.3 0.0000 CHOI 18 36.667 23.184 1.1786 3.2 0.0000 Thí nghiệm 2.3 Ảnh hưởng BA va auxin đến khả phát sinh hình thái - 49 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ BALANCED ANOVA FOR VARIATE PSHT FILE TN5 8/ 9/** 22:58 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 PSHT TY LE PHAT SINH HINH THAI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 818.333 204.583 163.67 0.000 * RESIDUAL 10 12.5001 1.25001 * TOTAL (CORRECTED) 14 830.833 59.3452 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN5 8/ 9/** 22:58 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CHOI TY LE TAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 887.500 221.875 106.50 0.000 * RESIDUAL 10 20.8334 2.08334 * TOTAL (CORRECTED) 14 908.333 64.8810 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN5 8/ 9/** 22:58 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS PSHT CHOI 68.3333 65.8333 88.3333 80.8333 3 87.5000 76.6667 76.6667 59.1667 80.0000 71.6667 SE(N= 3) 0.645499 0.833335 5%LSD 10DF 2.03399 2.62587 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN5 8/ 9/** 22:58 PAGE THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | PSHT 15 80.167 7.7036 1.1180 1.4 0.0000 CHOI 15 70.833 8.0549 1.4434 2.0 0.0000 Thành phần môi trường dinh dưỡng MS (Murashige and Skoog, 1962) STT Tên khoa học I Hàm lượng/l môi trường Các nguyên tố đa lượng NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O (g/l) 1,65 1,90 0,44 - 50 - Khóa luận tốt nghiệp II III IV V SVTH: Lê Ngọc Mỹ MgSO4.7H2O KH2PO4 Các nguyên tố vi lượng H3PO3 MgSO4.4H2O ZnSO4.4H2O KI MoO4.2H2O CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O Các vitamin Glycin Thiamin HCl Pyridoxin Nicotin Inositol NaFeEDTA NaEDTA FeSO4.2H2O 0,50 0,17 (mg/l) 6,20 22,30 8,60 0,83 0,25 0,025 0,025 (mg/l) 2,0 0,5 0,5 0,5 100 (mg/l) (g/l) 0,03725 0,02785 - 51 - ... xuất hoa Huệ Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến trình phát sinh hình thái mầm ngủ củ hoa Huệ Hương Sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật như:... Khảo sát ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng thực vật lên tới q trình phát sinh hình thái mẫu cấy Trong ni cấy mơ tế bào thực vật, để điều khiển phát sinh hình thái thực vật việc bổ sung chất điều... suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất Mục đích nghiên cứu Xác định ảnh hưởng chất hịa sinh trưởng thực vật lên q trình phát sinh hình thái quy trình nhân giống hoa Huệ Hương kỹ thuật