DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 3.5. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/
Hình 4.12. Vòng phân giải CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp khi nhuộm với thuốc đỏ Congo 63
DANH SÁCH CÁC BẢNG
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
Hình 2.1. Tỉ lệ các thành phần trong lignocellulose
Hình 2.2. Lignocellulose
Nguồn: Joseleau và cộng sự (1992)
Hình 2.3. Cấu trúc phân tử Cellulose
Hình 2.4. Cấu trúc cellulose
Nguồn: Hsu và cộng sự (1980)
Hình 2.5. Hemicellulose
Hình 2.6. Lignin
Hình 2.7. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase
Hình 2.9. Cơ chế hoạt động của Cellulosome
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hình 3.1. Thang DNA 1 Kb (Nguồn: Invitrogen)
3.2.4. Môi trường
3.2.4.1. Môi trường LB (Luria-Bertani):
3.2.4.2. Môi trường MD (Minimal Dextrose):
3.2.4.3. Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose)
3.2.4.4. Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex):
3.2.4.5. Môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) bổ sung CMC
3.2.5. Plasmid
Hình 3.2. Plasmid pJET 1.2
Hình 3.3. Plasmid pPIC9K (Nguồn: Invitrogen)
Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi được sử dụng
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR
3.3.1.3. Quy trình tinh sạch gen theo MEGAquick – spin Total Fragment DNA Purification Kit – INTRON Biotechnololy
- Cho mẫu vào eppendorf 1,5 ml. Thêm BNL Buffer theo tỉ lệ Buffer : mẫu là 5 : 1, vortex để hòa tan toàn bộ mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.
- Chuyển mẫu vào màng lọc được đặt trong eppendorf mới, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng.
- Thêm 700 μl dung dịch rửa vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng, tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để làm khô màng. Thực hiện bước này hai lần nếu sau đó sản phẩm được dùng cho phản ứng ...
- Chuyển màng lọc vào eppendorf mới. Thêm 40 μl Elution Buffer vào giữa màng, để yên 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút thu sản phẩm tinh sạch.
3.3.1.4. Phương pháp ghép nối gen vào vector nhân dòng pJET1.2/ Blunt
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng nối gen CelD vào plasmid pJET1.2
3.3.1.5. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5 khả nạp
3.3.1.6. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp hóa biến nạp
3.3.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R
Hình 3.5. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI
Bảng 3.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid pPIC9K và pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI
3.3.2.2. Quy trình tinh sạch gen và plasmid theo MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction System – INTRON
- Cho mẫu vào eppendorf 1,5 ml. Thêm BNL Buffer theo tỉ lệ Buffer : mẫu là 5:1, vortex để hòa tan toàn bộ mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.
- Chuyển mẫu vào màng lọc được đặt trong eppendorf mới, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng.
- Thêm 700 μl Washing Buffer vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng, tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để làm khô màng. Thực hiện bước này hai lần nếu sau đó sản phẩm được dùng cho phản ứng...
- Chuyển màng lọc vào eppendorf mới. Thêm 40 μl Elution Buffer vào giữa màng, để yên 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút thu sản phẩm tinh sạch
3.3.2.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD
3.3.2.4. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5 khả nạp
3.3.2.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào E. coli DH5
3.3.2.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc
Hình 3.6. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi
Bảng 3.8. Thành phần phản ứng cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI
3.3.2.8. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự tương ứng trên ngân hàng Gen
3.3.3.1. Chuẩn bị tế bào Pichia pastoris GS115 khả nạp
3.3.3.2. Phương pháp điện biến nạp
3.3.3.3. Chọn lọc các dòng Pichia pastoris mang nhiều bản sao của gen CelD và có khả năng năng tiết enzyme ngoại bào Endoglucanase D
3.3.3.4. Phương pháp ly trích DNA tổng số
3.3.3.5. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R
Hình 3.7. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Hình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CelD
Hình 4.2. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5 chứa plasmid tái tổ hợp
pJET1.2-CelD trên môi trường LB/ Ampicillin (50µg/ml)
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng
E. coli DH5α/pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R
Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm của cắt plasmid pJET1.2 – CelD
bằng enzyme SnaBI và EcoRI và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp
Hình 4.5. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5 chứa pPIC9K – CelD bằng
môi trường đĩa thạch LB/ ampicillin (50 µg/ml)
Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi CelDF/ CelDR và cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI.
Hình 4.8. Kết quả blast trình tự protein của trình tự trong plasmid pPIC9K-CelD trên NCBI
Hình 4.9. Sàng lọc thể biến nạp P. pastoris GS115 chứa pPIC9K-CelD
Hình 4.10. Sàng lọc tế bào P. pastoris mang gen CelD trên môi trường YPD/ G418
Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự sát nhập của plasmid pPIC9K-CelD vào bộ gen P. pastoris GS115
Hình 4.12. Vòng phân giải CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp khi nhuộm với thuốc đỏ Congo
Đĩa A: vòng phân giải CMC của dòng Pichia pastoris tái tổ hợp P8
Đĩa B: vòng phân giải CMC của dòng Pichia pastoris tái tổ hợp P9
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
5.2. Đề nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO