4.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD của
4.1.4. Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR và enzyme cắt giới hạn
Ba dòng tế bào E. coli DH5α cho đúng kích thước mục tiêu ở trên được chọn ngẫu nhiên và tăng sinh qua đêm trong môi trường LB lỏng để tách chiết plasmid và thực hiện kiểm tra bằng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR, cắt với hai enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI nhằm xác định các dòng E. coli DH5α mang gen CelD. Vị trí cắt của hai enzyme này được thiết kế ở đầu 5’ của hai cặp mồi khuếch đại các gen mục tiêu. Những dòng tế bào có plasmid pJET1.2-CelD sẽ bị cắt thành hai đoạn có kích thước tương ứng với kích thước của plasmid pJET1.2 (2974 bp) và của gen CelD (1824 bp). Chọn một dòng gửi giải trình tự và tiến hành chuyển gen mục tiêu sang vector biểu hiện.
47
Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm của cắt plasmid pJET1.2 – CelD bằng enzyme SnaBI và EcoRI và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp
pJET1.2-CelD với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR
Giếng 1 - 3: plasmid pJET1.2-CelD cắt bằng SnaBI vả EcoRI (E1 – E3); giếng 4 – 6: sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi CelDF/ CelDR; 7: sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi pJET1.2F/ pJET1.2R; M:
thang chuẩn DNA 1 Kb; N: đối chứng âm.
Kết quả điện di sản phẩm cắt các plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD bằng enzyme SnaBI và EcoRI ở giếng 1, 2, 3 tương ứng với các dòng E. coli DH5α E1, E2, E3 đều cho hai vạch rõ nét. Một vạch có kích thước khoảng 3000 bp tương ứng với kích thước lý thuyết của plasmid pJET1.2 khi mở vòng (2974 bp) và một vạch có kích thước khoảng 1800 bp tương ứng với kích thước của gen CelD là 1824 bp.
Bên cạnh đó giếng 4, 5, 6 là sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với cặp mồi đặc hiệu của đoạn gen, cho các cho vạch có kích thước khoảng 1800 bp so với thang chuẩn tương ứng với kích thước của đoạn gen CelD là 1824 bp. Vạch này thấp hơn vạch điện di sản phẩm PCR plasmid pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2R/ pJET1.2R là 2000 bp ở giếng 7. Dựa vào kết quả điện di, nhận thấy phản
48
ứng cắt hoàn toàn bình thường, hiệu suất cắt của cả hai enzyme đều tốt, tất cả các plasmid đã được cắt hoàn toàn và đưa về dạng mạch thẳng, di chuyển cùng với vị trí của thang tương ứng với kích thước của nó. Như vậy, các dòng E. coli DH5α E1, E2, E3 có khả năng chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD.
4.1.5. Kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5𝜶 chứa plasmid pJET1.2-CelD bằng giải trình tự
Trong quá trình tiến hành kĩ thuật PCR, sai sót có thể xảy ra, đặc biệt là sự thay đổi nucleotide trong gen CelD. Những sai sót này có thể nhỏ nhưng lại ảnh hưởng lớn đến kết quả biểu hiện gen. Sự thay thế nucleotide không mong muốn có thể tạo ra một trình tự mã kết thúc. Sự mất hay thêm nucleotide dẫn đến sai cấu trúc dịch mã tạo ra protein không chính xác. Chính vì vậy, từ kết quả sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R và kiểm tra bằng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR cũng như phản ứng cắt giới hạn với hai enzyme SnaBI và EcoRI, chọn ra dòng E. coli DH5α E2 gửi đi giải trình tự bằng cặp mồi pJET1.2F/
pJET1.2R tại công ty Macrogen (Hàn Quốc).
Kết quả giải trình tự được xử lý bằng phần mềm Genetyx, xác định được khoảng 600 nucleotide của trình tự cần biết trong plasmid pJET1.2. Khi blast trình tự DNA này lên NCBI, nhận thấy trình tự này có sự tương đồng 99% với trình tự có mã số X04584.1 được công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI.
Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen CelD trong plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với trình tự có mã số X04584.1 bằng công cụ BLAST của NCBI.
Query 4 GCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTT 63 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 324 GCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTT 383 Query 64 ATACCGAACCACAGCAAAAAGGCGACTATAGCTGCAAATTGTTCAACCTTTTATGTTGTT 123 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 384 ATACCGAACCACAGCAAAAAGGCGACTATAGCTGCAAATTGTTCAACCTTTTATGTTGTT 443 Query 124 AAAGAAGACGGAACAATAGTGTATACCGGAACGGCAACTTCAATGTTTGACAATGATACA 183 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 444 AAAGAAGACGGAACAATAGTGTATACCGGAACGGCAACTTCAATGTTTGACAATGATACA 503
49
Query 184 AAAGAAACTGTTTATATTGCTGATTT 209 ||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 504 AAAGAAACTGTTTATATTGCTGATTT 529
...
Query 1 AGACAGACTATGATACTTCAGGTTGCGAACAAGATTTCACCCAACAATGATTATGTAAAT 60 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1593 AGACAGACTATGATACTTCAGGTTGCGAACAAGATTTCACCCAACAATGATTATGTAAAT 1652
Query 61 GCTGCTCTCGATGCGATTTCACATGTATTTGGAAGAAACTATTACAACAGGTCTTATGTA 120 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1653 GCTGCTCTCGATGCGATTTCACATGTATTTGGAAGAAACTATTACAACAGGTCTTATGTA 1712
Query 121 ACAGGCCTTGGTATAAATCCTCCTATGAATCCTCATGACAGACGTTCAGGGGCTGACGGA 180 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1713 ACAGGCCTTGGTATAAATCCTCCTATGAATCCTCATGACAGACGTTCAGGGGCTGACGGA 1772 Query 181 ATATGGGAGCCGTGGCCCGGTTACCTTGTAGGAGGAGGATGGCCCGGACCGAAGGATTGG 240 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1773 ATATGGGAGCCGTGGCCCGGTTACCTTGTAGGAGGAGGATGGCCCGGACCGAAGGATTGG 1832 Query 241 GTGGATATTCAGGACAGTTATCAGACCAATGAAATTGCTATAAACTGGAATGCGGCATTG 300 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1833 GTGGATATTCAGGACAGTTATCAGACCAATGAAATTGCTATAAACTGGAATGCGGCATTG 1892
Query 301 ATTTATGCCCTTGCCGGATTTGTCAACTATAATTCTGCTCAAAATGAAGTACTGTACGGA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||
Sbjct 1893 ATTTATGCCCTTGCCGGATTTGTCAACTATAATTCTCCTCAAAATGAAGTACTGTACGGA 1952
Query 361 GATGTGAATGATGACGGAAAAGTAAACTCCACTGACTTGACTTTGTTAAAAAGATATGTT 420 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1953 GATGTGAATGATGACGGAAAAGTAAACTCCACTGACTTGACTTTGTTAAAAAGATATGTT 2012
Query 421 CTTAAAGCCGTCTCA 435 |||||||||||||||
Sbjct 2013 CTTAAAGCCGTCTCA 2027
Trình tự thu nhận được của gen CelD trong plasmid pJET1.2 được xử lý bằng phần mềm DNAClub để chuyển từ trình tự nucleotide sang trình tự amino acid. Khi blast trình tự amio acid này lên NCBI, nhận thấy trình tự protein này tương đồng 100% với trình tự đã công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI.
Query 2 AKITENYQFDSRIRLNSIGFIPNHSKKATIAANCSTFYVVKEDGTIVYTGTATSMFDNDT 61 Sbjct 42 AKITENYQFDSRIRLNSIGFIPNHSKKATIAANCSTFYVVKEDGTIVYTGTATSMFDNDT 101 Query 62 KETVYIAD 69
Sbjct 102 KETVYIAD 109
…
Query 1 RQTMILQVANKISPNNDYVNAALDAISHVFGRNYYNRSYVTGLGINPPMNPHDRRSGADG 60 Sbjct 465 RQTMILQVANKISPNNDYVNAALDAISHVFGRNYYNRSYVTGLGINPPMNPHDRRSGADG 524
Query 61 IWEPWPGYLVGGGWPGPKDWVDIQDSYQTNEIAINWNAALIYALAGFVNYNSAQNEVLYG 120 Sbjct 525 IWEPWPGYLVGGGWPGPKDWVDIQDSYQTNEIAINWNAALIYALAGFVNYNSAQNEVLYG 584 Query 121 DVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVS 145
Sbjct 585 DVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVS 609
50
Do đoạn gen có kích thước 1824 bp trong khi giải trình tự chỉ có thể giải được khoảng 1200 bp nên không thể giải toàn bộ trình tự của đoạn gen CelD. Tuy nhiên, dựa vào trình tự đã biết có thể kết luận rằng đã thu nhận thành công đoạn gen mã hóa cho enzyme endoglucanase D từ Clostridium thermocellum và nhân dòng thành công gen CelD trong vector pJET1.2. Từ đó, tiến hành tạo dòng vào E. coli DH5α thông qua vector biểu hiện pPIC9K.
4.2. Tạo dòng tế bào E. coli DH5𝛂 chứa plasmid pPIC9K mang gen CelD Sau khi kiểm tra bằng phương pháp giải trình tự, plasmid pJET1.2 tái tổ hợp của dòng E2 và plasmid pPIC9K được cắt với enzyme cắt giới hạn là SnaBI và EcoRI. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó tiến hành thu nhận đoạn gen trực tiếp từ gel điện di để loại bỏ các sản phẩm phụ không mong muốn đồng thời để hạn chế sự thất thoát, tăng hiệu suất thu nhận gen.
Tiến hành nối vector pPIC9K với gen mục tiêu bằng T4 DNA ligase ở 160C qua đêm để tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α khả nạp bằng phương pháp hóa biến nạp.
4.2.1. Sàng lọc các dòng E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pPIC9K-CelD Các chủng biến nạp mang gen mục tiêu được sàng lọc trên môi trường LB đĩa thạch có chứa ampicillin (50 μg/ml). Do plasmid pPIC9K có mang gen kháng kháng sinh ampicillin nên chỉ những tế bào E. coli DH5α có mang plasmid này mới sinh trưởng được trên môi trường này. Thí nghiệm được thực hiện song song với mẫu đối chứng âm là tế bào E. coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp gen mục tiêu và mẫu đối chứng dương là tế bào E. coli DH5α chứa vector pPIC9K đã cắt mở vòng và không có đoạn gen chèn CelD.
51
Hình 4.5. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5𝛼 chứa pPIC9K – CelD bằng mụi trường đĩa thạch LB/ ampicillin (50 àg/ml)
A. Đĩa đối chứng âm; B. Đĩa đối chứng dương; C. Đĩa biến nạp
Kết quả cho thấy, sau khoảng 16 giờ nuôi cấy trên đĩa thạch, đĩa đối chứng âm không xuất hiện khuẩn lạc vì đây là đĩa chứa các tế bào E. coli DH5𝛼 không được biến nạp vector pPIC9K nên không có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa ampicillin. Đĩa đối chứng dương xuất hiện một vài khuẩn lạc trên đĩa. Nguyên nhân là do phản ứng cắt vector pPIC9K bằng enzyme cắt giới hạn chưa hoàn toàn nên những tế bào E. coli DH5α chứa vector pPIC9K dạng vòng sẽ có khả năng kháng kháng sinh và phát triển được trên môi trường có ampicillin. Đĩa biến nạp chứa các tế bào E. coli DH5𝛼 đã được biến nạp sản phẩm nối pPIC9K-CelD nên có thể sinh trưởng trên môi trường chứa ampicillin.
Chọn ngẫu nhiên 6 khuẩn lạc E. coli DH5𝛼 trên đĩa biến nạp và thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/AOX1R để chọn lọc những dòng mang plasmid tái tổ hợp gen mục tiêu.
B
A C
52
4.2.2. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
Để khẳng định các thể biến nạp chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD, tiến hành PCR khuẩn lạc các thể biến nạp với cặp mồi AOX1F/ AOX1R.
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α/pPIC9K-CelD với cặp mồi AOX1F/AOX1R.
Giếng 1 – 6: sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α/pPIC9K- CelD (EP1 – EP6); M: Thang DNA 1Kb; N: đối chứng âm.
Plasmid pPIC9K có hai vùng promoter AOX1F và AOX1R nằm ở hai đầu của MCS nên sản phẩm khuếch đại với cặp mồi AOX1F và AOX1R sẽ có kích thước 493 bp. Khi có gen mục tiêu chèn vào pPIC9K trong vùng này thì sản phẩm khuếch đại với cặp mồi trên sẽ cho ra kích thước 2330 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc cho thấy đối chứng âm không xuất hiện vạch, các giếng số 1, 3, 4, 5 tương ứng với các dòng E. coli DH5α EP1, EP3, EP4, EP5 chỉ xuất hiện vạch khoảng 500 bp so với thang chuẩn trùng với kích thước lý thuyết của vector pPIC9K là 493 bp. Điều này cho thấy rằng, các chủng này không chứa đoạn gen chèn CelD.
53
Giếng số 2 và giếng số 6 tương ứng với dòng EP2 và EP6 xuất hiện vạch khoảng 2300 bp trùng với tổng kích thước lý thuyết của vector pPIC9K (493 bp) và đoạn gen CelD (1824 bp). Như vậy, chỉ có 2 dòng E. coli DH5α EP2 và EP 6 có khả năng chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD.
4.2.3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR và bằng enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI
Hai dòng tế bào E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pPIC9K-CelD là EP2 và EP6 được tăng sinh trong môi trường LB lỏng để tách chiết plasmid, kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn bằng hai enzyme SnaBI và EcoRI đồng thời thực hiện phản ứng PCR với mồi CelDF và CelDR.
Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi CelDF/ CelDR và cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI.
Giếng 1: plasmid pPIC9K chưa cắt; giếng 2: plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD chưa cắt; giếng 3: sản phẩm cắt pPIC9K-CelD dòng EP2 với SnaBI; giếng 4: sản
54
phẩm cắt pPIC9K-CelD dòng EP6 với SnaBI; giếng 5: sản phẩm cắt pPIC9K với SnaBI và EcoRI; giếng 6: sản phẩm cắt pPIC9K-CelD dòng EP2 với SnaBI và EcoRI; giếng 7: sản phẩm cắt pPIC9K-CelD dòng EP6 với SnaBI và EcoRI; giếng 8: Sản phẩm PCR dòng EP2 với mồi CelDF/ CelDR; giếng 9: Sản phẩm PCR dòng EP6 với mồi CelDF/ CelDR; M: Thang chuẩn DNA 1 Kb; N: đối chứng âm.
Kết quả điện di ở hình 4.7 cho thấy khi so sánh sản phẩm cắt plasmid pPIC9K với SnaBI và EcoRI ở giếng 5 với pPIC9K chưa cắt ở giếng 1, nhận thấy có sự khác nhau rõ rệt. Hình điện di sản phẩm cắt của pPIC9K cho thấy một vạch duy nhất tại vị trí thấp hơn 10 kb của thang chuẩn, phù hợp với kích thước của pPIC9K là 9300 bp. Như vậy, tất cả plasmid pPIC9K đã được cắt hoàn toàn và đưa về dạng mạch thẳng. Dựa vào kết quả điện di, nhận thấy phản ứng cắt hoàn toàn bình thường, hiệu suất cắt của cả hai enzyme đều tốt.
Giếng số 6 và giếng số 7 tương ứng với plasmid tái tổ hợp của hai dòng EP2 và EP6 sau khi cắt với hai enzyme SnaBI và EcoRI đều cho cho hai vạch rõ nét.
Một vạch có kích thước lớn hơn 1636 bp, tương ứng với kích thước của lý thuyết của gen CelD là 1824 bp. Một vạch kích thước khoảng 9300 bp, tương ứng với kích thước lý thuyết của plasmid pPIC9K là 9276 bp. Vector tái tổ hợp pPIC9K-CelD của hai dòng EP2 và EP6 sau khi cắt bằng enzyme SnaBI (giếng số 3 và 4) cho vạch có kích thước hơn 10 kb, tương ứng với kích thước lý thuyết của plasmid pPIC9K sau khi chèn gen CelD là 11100 bp. Sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K- CelD với cặp mồi CelDF/ CelDR đặc trưng cho gen CelD của dòng EP2 và EP6 ở giếng 8 và 9 cũng cho vạch có kích thước bằng với kích thước gen đã được cắt ở giếng 6 và giếng 7. Plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD chưa cắt ở giếng 2 cũng cho kích thước lớn hơn plasmid pPIC9K chưa cắt ở giếng 1. Như vậy cả hai dòng EP2 và EP6 có khả năng mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. Tuy nhiên, dựa vào sản phẩm cắt vẫn chưa thể khẳng định đã tạo dòng thành công tế bào E.coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD mà cần phải có thêm kết quả giải trình tự.
55
4.2.4. Kiểm tra dòng E. coli DH5𝜶 chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD bằng giải trình tự
Plasmid tái tổ hợp của dòng EP2 được tiến hành giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) để kiểm tra lại trình tự của gen mục tiêu. Kết quả được xử lý bằng phần mềm Genetyx. Khi blast trình tự này lên NCBI, nhận thấy sự tương đồng là 99%.
Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen CelD trong plasmid pPIC9K- CelD với trình tự có mã số X04584.1 bằng công cụ BLAST của NCBI
Query 239 GCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTT 298 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 324 GCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTT 383
Query 299 ATACCGAACCACAGCAAAAAGGCGACTATAGCTGCAAATTGTTCAACCTTTTATGTTGTT 358 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 384 ATACCGAACCACAGCAAAAAGGCGACTATAGCTGCAAATTGTTCAACCTTTTATGTTGTT 443
Query 359 AAAGAAGACGGAACAATAGTGTATACCGGAACGGCAACTTCAATGTTTGACAATGATACA 418 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 444 AAAGAAGACGGAACAATAGTGTATACCGGAACGGCAACTTCAATGTTTGACAATGATACA 503 Query 419 AAAGAAACTGTTTATATTGCTGATTTTTCATCCGTTAATGAAGAAGGAACGTACTATCTT 478 |||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 504 AAAGAAACTGTTTATATTGCTGATTTTTCATCTGTTAATGAAGAAGGAACGTACTATCTT 563 Query 479 GCCGTGCCGGGAGTAGGAAAAAGCGTAAACTTTAAAATTGCAATGAATGTATATGAGGAT 538 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 564 GCCGTGCCGGGAGTAGGAAAAAGCGTAAACTTTAAAATTGCAATGAATGTATATGAGGAT 623
Query 539 GCTTTTAAAACAGCAATGCTGGGAATGTATTTGCTGCGCTGCGGCACCAGTGTGTCGGCC 598 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 624 GCTTTTAAAACAGCAATGCTGGGAATGTATTTGCTGCGCTGCGGCACCAGTGTGTCGGCC 683
Query 599 ACATACAACGGAATACACTATTCCCATGGACCGTGCCATACTAATGATGCATATCTTGAT 658 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 684 ACATACAACGGAATACACTATTCCCATGGACCGTGCCATACTAATGATGCATATCTTGAT 743
Query 659 TATATAAACGGACAGCATACTAAAAAAGACAGTACAAAAGGCTGGCATGATGCGGGCGAC 718 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 744 TATATAAACGGACAGCATACTAAAAAAGACAGTACAAAAGGCTGGCATGATGCGGGCGAC 803
…
Query 1 GGACCAGCCAAAACCATGGCTATGGCAGAACCCTTGGTACAACATATTACTGGGGATGCA 60 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1519 GGACCAGCCAAAACCATGGCTATGGCAGAACCCTTGGTACAACATATTACTGGGGATGCA 1578
Query 61 ACGGCACGGTTGTAAGACAGACTATGATACTTCAGGTTGCGAACAAGATTTCACCCAACA 120 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1579 ACGGCACGGTTGTAAGACAGACTATGATACTTCAGGTTGCGAACAAGATTTCACCCAACA 1638
56
Query 121 ATGATTATGTAAATGCTGCTCTCGATGCGATTTCACATGTATTTGGAAGAAACTATTACA 180 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1639 ATGATTATGTAAATGCTGCTCTCGATGCGATTTCACATGTATTTGGAAGAAACTATTACA 1698
Query 181 ACAGGTCTTATGTAACAGGCCTTGGTATAAATCCTCCTATGAATCCTCATGACAGACGTT 240 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1699 ACAGGTCTTATGTAACAGGCCTTGGTATAAATCCTCCTATGAATCCTCATGACAGACGTT 1758 Query 241 CAGGGGCTGACGGAATATGGGAGCCGTGGCCCGGTTACCTTGTAGGAGGAGGATGGCCCG 300 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1759 CAGGGGCTGACGGAATATGGGAGCCGTGGCCCGGTTACCTTGTAGGAGGAGGATGGCCCG 1818 Query 301 GACCGAAGGATTGGGTGGATATTCAGGACAGTTATCAGACCAATGAAATTGCTATAAACT 360 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1819 GACCGAAGGATTGGGTGGATATTCAGGACAGTTATCAGACCAATGAAATTGCTATAAACT 1878
Query 361 GGAATGCGGCATTGATTTATGCCCTTGCCGGATTTGTCAACTATAATTCTGCTCAAAATG 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||
Sbjct 1879 GGAATGCGGCATTGATTTATGCCCTTGCCGGATTTGTCAACTATAATTCTCCTCAAAATG 1938
Query 421 AAGTACTGTACGGAGATGTGAATGATGACGGAAAAGTAAACTCCACTGACTTGACTTTGT 480 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1939 AAGTACTGTACGGAGATGTGAATGATGACGGAAAAGTAAACTCCACTGACTTGACTTTGT 1998
Query 481 TAAAAAGATATGTTCTTAAAGCCGTCTCAACTCTGCCTTCTTCCAAAGCTGAAAAGAACG 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1999 TAAAAAGATATGTTCTTAAAGCCGTCTCAACTCTCCCTTCTTCCAAAGCTGAAAAGAACG 2058 Query 541 CAGATGTAAATCGTGACGGAAGAGTTAATTCCAGTGATGTCACAATACTTTCAAGATATT 600 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 2059 CAGATGTAAATCGTGACGGAAGAGTTAATTCCAGTGATGTCACAATACTTTCAAGATATT 2118 Query 601 TGATAAGGGTAATCGAGAAATTACCAATA 629
|||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 2119 TGATAAGGGTAATCGAGAAATTACCAATA 2147
Trình tự thu nhận được của gen CelD trong plasmid pPIC9K được xử lý bằng phần mềm DNAClub để chuyển từ trình tự nucleotide sang trình tự amino acid.
Hình 4.8. Kết quả blast trình tự protein của trình tự trong plasmid pPIC9K-CelD trên NCBI
Kết quả blast trình tự protein cho thấy hai chuỗi acid amin khác nhau. Chuỗi đầu tiên chính là trình tự tiết nhân tố α có trong plasmid biểu hiện pPIC9K. Chuỗi tiếp theo là trình tự protein mã hóa cho enzyme cellulase.