Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris - Tạo dòg plas- 123docz.net

2.4.1. Đặc điểm hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris

Pichia pastoris là sinh vật eukaryote thuộc họ Saccharomycetaceae. Chúng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 28 – 320C. Nếu nhiệt độ môi trường nuôi cấy cao hơn 320C sẽ ảnh hưởng đến quá trình tiết protein của nấm men này. Pichia pastoris là một trong số không nhiều nấm men có khả năng sử dụng methanol như nguồn cacbon duy nhất. P. pastoris có hai gen mã hóa enzyme alcohol oxydase (AOX) là AOX1 và AOX2.

Ứng dụng của P. pastoris trong biểu hiện xuất phát từ việc khai thác promoter AOX, promoter liên quan đến quá trình đồng hóa methanol. Thông thường gen biểu hiện protein mong muốn đặt dưới sự kiểm soát của promoter AOX1. Promoter AOX1 có vai trò quan trọng trong việc điều khiển sự phiên mã của gen nhân dòng và việc sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp. Promoter AOX2 cũng mã hóa alcohol oxydase nhưng hoạt tính thấp hơn khoảng 10 – 20 lần so với AOX1 (Daly R, Hearn MT, 2005). Gen ngoại lai chứa trong plasmid tái tổ hợp có khả năng tích hợp vào hệ gen của P. pastoris nhờ quá trình tiếp hợp và trao đổi chéo, qua đó làm tăng tính ổn định của gen này trong tế bào chủ (Thân Văn Minh, 2012).

Tất cả các chủng biểu hiện của hệ biểu hiện P. pastoris đều có nguồn gốc từ chủng dại NRRL-Y 11430. P. pastoris GS115 và KM71 là các chủng đột biến gen histidinol dehydrogenase (his4) mất khả năng tổng hợp histidine nên các thể biến nạp có thể được chọn lọc bằng môi trường khuyết dưỡng histidine.

2.4.2. Tích hợp gen ngoại lai vào P. pastoris

Các vector biểu hiện trong P. pastoris được thiết kế tương đồng với locus AOX1 hay locus his4. Giống như ở S. cerevisiae, DNA dạng thẳng giúp ổn định

quá trình biến nạp vào P. pastoris nhờ sát nhập hay tái tổ hợp với trình tự tương đồng trong bộ gen nấm men. DNA tái tổ hợp có thể tồn tại ổn định với dạng đa bản sao trong bộ gen tế bào chủ. Ở chủng Mut+ hoặc MutS, gen sát nhập tại locus his4 do sự trao đổi chéo giữa locus his4 của nhiễm sắc thể nấm men và vector biểu hiện.

Kết quả có thể cho một hoặc nhiều bản sao của vector tại vị trí his4 và có kiểu hình His+. Làm thẳng vector bằng enzyme cắt giới hạn tại vị trí his4, kiểu hình Mut+ hay MutS tùy thuộc vào chủng chủ sử dụng. Các dòng nấm men tái tổ hợp đa bản sao của vector biểu hiện chiếm 1-10% các chủng His+ biến nạp (Thân Văn Minh, 2012).

2.4.3. Ưu điểm của hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris

Một số hệ thống biểu hiện phổ biến hiện nay bao gồm: E. coli, B. subtilis, S.

cerevisae, P. pastoris, A. niger và tế bào động vật. Mỗi hệ biểu hiện có những ưu điểm có những ưu điểm và hạn chế riêng, tùy thuộc sản phẩm protein mà cần lựa chọn hệ biểu hiện phù hợp.

Nấm men đang là hệ biểu hiện đang được sử dụng rộng rãi hiện nay do có nhiều ưu điểm. Chúng là các sinh vật nhân chuẩn có khả năng tích hợp gen lạ của các sinh vật khác vào genome của mình. Ngoài ra chúng là sinh vật nhân chuẩn duy nhất có khả năng thực hiện các thao tác kĩ thuật di truyền phân tử dễ dàng như khi thực hiện ở E. coli và có khả năng phát triển rất mạnh trong môi trường nuôi cấy.

Đặc biệt ở nấm men có quá trình sửa đổi sau dịch mã hoàn thiện để trở thành dạng protein hoạt động và có khả năng tiết protein mạnh với cơ chế điều hòa nghiêm ngặt, thao tác dễ dàng (R. Daly, M. T. Hearn, 2005).

Pichia pastoris có thể sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy liên tục và có khả năng lên men với mật độ tế bào cao. Chúng có thể sinh trưởng trên môi trường pH tương đối thấp từ 3 đến 7 do đó có thể điều chỉnh được pH để giảm thiểu tối đa hoạt động của protease đối với protein được tiết ra.

Có khả năng sử dụng methanol là nguồn cacbon chính nên môi trường nuôi cấy chứa nhiều methanol, hạn chế được sự nhiễm của các loài sinh vật khác. Do vậy nuôi cấy P. pastoris ít bị tạp nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài. Đồng thời methanol là chất rẻ tiền hơn so với IPTG, chất cảm ứng của hệ thống biểu hiện E. coli.

Nấm men P. pastoris tổng hợp protein ngoại lai trong peroxisome, thuận tiện cho việc vận chuyển và tiết protein. Hệ thống P. pastoris có khả năng sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp với hàm lượng lên đến gram trên lít.

Vector biểu hiện pPIC9K có trình tự nhân tố α giúp protein mục tiêu được tiết ra ngoài môi trường nên dễ thu nhận hơn so với các hệ thống biểu hiện khác, đồng thời protein của bản thân P. pastoris được tiết ra với hàm lượng rất thấp nên quá trình tinh sạch và thu nhận protein mục tiêu về sau rất dễ dàng.

Quá trình lên men được thực hiện nhanh chóng, dễ dàng thu được sản phẩm ở dạng gấp cuộn có hoạt tính, mỗi mẻ từ 5-6 ngày, đáp ứng được nhu cầu sản xuất protein số lượng lớn, các thông số pH, độ thông khí, lượng CO2 có thể được kiểm soát chặt chẽ.

Ngoài ra P. pastoris không là tác nhân gây bệnh, không chứa virus trong tế bào và còn có một promoter mạnh có thể kiểm soát chặt chẽ bằng nguồn cacbon.

Với các thuận lợi trên, P. pastoris thu hút được nhiều sự quan tâm và là đối tượng được lựa chọn để biểu hiện nhiều loại protein, nâng cao được hiệu quả và tiết kiệm được chi phí sản xuất so với các hệ thống biểu hiện khác.

2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tạo dòng các gen từ Clostridium thermocellum

Khởi đầu cho những nghiên cứu về hệ enzyme cellulase ở Clostridium thermocellum là T.Kobayashi và cộng sự (1990). Nhóm nghiên cứu đã tạo hệ minicellulosome và tiến hành khảo sát hoạt tính phân giải cellulose. Hoạt tính của hệ cellulosome này cao hơn 8 lần trên Avicel (microcrystalline cellulose powder) (pH 5,5 – 7; 700C) và hơn 15 lần trên CMC ( (pH 5,5 – 7; 650C) so với dịch cellulase ngoại bào thô đã được phân tách từ hệ cellulase của C. thermocellum.

Năm 1993, Wang và cộng sự đã nhân dòng và phân tích trình tự gen CelS từ Clostridium thermocellum ATCC 27405 vào DH1OB. E. coli XL-1 Blue bằng plasmid pBluescript SK. Đến năm 1994, Wang và các cộng sự của mình tiếp tục tạo dòng tế bào E. coli DH5𝛼 mang vector biểu hiện pRSET chứa gen mã hóa CelS.

Thông qua phân tích bằng phương pháp Western blot đã phát hiện được protein tái

tổ hợp với kích thước tương tự protein từ CelS. Tiến hành kiểm tra định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng E. coli tái tổ hợp, kết quả cho thấy các dòng này phân hủy rất ít trên môi trường cacboxymethyl cellulose nhưng có khả năng phân hủy mạnh trên môi trường cellulose tinh thể.

Năm 1996, Mohammad Mainul Ahsan và cộng sự cũng nghiên cứu tạo dòng, giải trình tự và biểu hiện gen mã hóa cellulase CelJ trong tế bào E. coli JM109. Kết quả điện di SDS - PAGE cho thấy gen CelJ có khả năng biểu hiện cao trong tế bào này.

Shen-Long Tsai và cộng sự (2009) đã thiết kế một hệ minicellulosme ba chức năng từ các enzyme endoglucanase CelA, β-glucosidase BglA của Clostridium thermocellum, exoglucanase CelE và endoglucanase CelG từ C. cellulolyticum với hướng biểu hiện bề mặt scaffoldin trên hệ thống biểu hiện Saccharomyces cerevisiae. Kết quả lên men ethanol với hiệu quả gấp 2,6 lần so với việc sử dụng các enzyme tinh sạch trên phối hợp với nhau, mặc dù hàm lượng đo được là giống nhau.

Vào năm 2011, Jian-Ming Liu và cộng sự đã tạo dòng và biểu hiện năm gen mã hóa enzyme cellobiohydrolase và một gen mã hóa enzyme endoglucanase của Clostridium thermocellum DSM 1237 là CbhA, CelK, CelO, Cel48Y, Cel48S và CelA vào hai dòng tế bào Bacillus subtilis WB600 và WB800. Các enzyme cellulase từ các dòng B. subtilis tái tổ hợp trên có khả năng tiết enzyme hiệu quả trong môi trường nuôi cấy, có hoạt tính khá tốt trên chất nền photphoric acid swollen cellulose (PASC). Kết quả cụ thể cho thấy khi khi nghiên cứu biểu hiện cellobiohydrolase của CbhA, Cel48S, Cel48Y cho hàm lượng enzyme lần lượt là 304, 110 và 153 mg/l, nhưng khi có sự phối hợp CbhA – Cel48S và CbhA – Cel48Y thì hàm lượng enzyme thu được của mỗi phức hợp lần lượt là 532 mg/l và 611 mg/l.

Bên cạnh đó sự phối hợp giữa CelA với các tỉ lệ CbhA khác nhau cũng cho hàm lượng từ 761 – 905 mg/l trên chất nền phosphoric acid swollen cellulose (PASC).

Tuy nhiên hai gen mã hóa cho CelO và CelK thì chưa được biểu hiện thành công trên Bacillus subtilis.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tạo dòng gen mã hóa enzyme cellulase từ Clostridium thermocellum chưa nhiều và chủ yếu được thực hiện trên hệ thống Bacillus subtilis. Phạm Lương Thắng và cộng sự (2012) đã nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện endoglucanase A (CelA) từ Clostridium thermocellum vào các chủng Bacillus subtilis 1012 và WB800N. Nguyễn Hoàng Ngọc Phương cũng đã nghiên cứu đề tài tạo mini – cellulosome từ các protein tái tổ hợp của Clostridium thermocellum và biểu hiện trên hệ thống Bacillus subtilis.

Hiện nay các nghiên cứu chỉ mới tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa enzyme cellulase từ Clostridium thermocellum trên các hệ thống E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae nhưng chưa có nghiên cứu nào sử dụng hệ thống biểu hiện Pichia pastoris. Vì thế, nghiên cứu dòng hóa và biểu hiện gen mã hóa cellulase từ Clostridium thermocellum trên hệ thống Pichia pastoris là một hướng nghiên cứu tiềm năng ở Việt Nam và trên thế giới.