Định danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ pterapogon kauderni dựa trên gen its và xác định sự lây nhiễm bằng kĩ thuật sem

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐỊNH DANH NẤM SỢI GÂY HỎNG TRỨNG CÁ BÁ CHỦ (Pterapogon kauderni) DỰA TRÊN GEN ITS VÀ XÁC ĐỊNH SỰ LÂY NHIỄM BẰNG KĨ THUẬT SEM Ngành: Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : Ths Võ Minh Sơn CN Ngô Đức Duy Sinh viên thực MSSV: 1151110524 : Nguyễn Thị Thủy Tiên Lớp: 11DSH04 TP Hồ Chí Minh, năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đồ án công trình nghiên cứu thực cá nhân, thực hướng dẫn khoa học ThS Võ Minh Sơn, CN Ngô Đức Duy Các số liệu thu thập kết phân tích đề tài trung thực, đề tài không trùng với đề tài nghiên cứu khoa học Những thông tin tham khảo khóa luận trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thủy Tiên LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực đồ án tốt nghiệp Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ Đức, hướng dẫn tận tình Thầy cô, anh chị bạn , em hoàn thành tốt đồ án Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: TS Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam, Thầy tạo điều kiện cho em làm đề tài Thầy Ngơ Đức Duy, TS Nguyễn Hồng Dũng chị Loan phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam tận tình bảo, giảng dạy giúp đỡ em suốt thời gian thực đồ án Thầy Võ Minh Sơn công tác Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II thuộc Bộ Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn, nhiệt tình giúp em q trình thu nhập mẫu bệnh trứng cá, hỗ trợ giải đáp thắc mắc trình làm đề tài Cơ Nguyễn Hồi Hương, phịng Vi sinh, khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tận tình giúp đỡ em trình nhận đề tài Các bạn lớp 11DSH04 đồng hành, chia sẻ giúp đỡ em suốt thời gian học tập thực đề tài Cuối cùng, xin cám ơn Ba Mẹ, ni nấng, chăm sóc tạo điều kiện cho ăn học thành người có ích cho xã hội anh hai, người bên cạnh động viên, định hướng cho em em gặp khó khăn cơng việc Đồ Án Tốt Nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu Mục đích nghiên cứu .2 Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu .2 Các kết đạt đề tài .3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cá Bá Chủ 1.1.1 Hệ thống phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh thái học 1.1.2.1 Hình thái 1.1.2.2 Sinh học sinh sản .6 1.1.3 Quy trình ấp trứng cá Bá Chủ Việt Nam 1.2 Bệnh nấm thủy sản 1.2.1 Bệnh nấm thủy mi .10 1.2.2 Bệnh nấm Lagenidium 10 1.2.3 Bệnh nấm Haliphthoros .10 1.2.4 Bệnh nấm Fusarium .11 i Đồ Án Tốt Nghiệp 1.2.5 Bệnh nấm Plectosporium .11 1.3 Định danh phương pháp sinh học phân tử 11 1.3.1 Các phương pháp ly trích DNA .11 1.3.1.1 Nguyên tắc .11 1.3.1.2 Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật 12 1.3.2 PCR định danh vi sinh vật .13 1.3.2.1 Kỹ thuật PCR 13 1.3.2.2 Gen rDNA 14 1.3.2.3 Mồi 14 1.3.2.4 Ứng dụng PCR q trình định danh lồi vi sinh vật 16 1.3.3 Xây dựng phát sinh loài 16 1.4 Kỹ thuật khuếch tán đĩa giấy kháng sinh vào môi trường thạch 17 1.4.1 Phạm vi áp dụng 17 1.4.2 Kháng sinh 17 1.5 Phương pháp chụp SEM 22 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1 Vật liệu, thiết bị hóa chất 24 2.1.1 Dụng cụ thiết bị 24 2.1.2 Nguồn mẫu 24 2.1.3 Hóa chất .24 2.1.3.1 Môi trường nuôi cấy 24 2.1.3.2 Các hóa chất định danh 24 2.1.3.3 Các hóa chất phản ứng PCR 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu .25 ii Đồ Án Tốt Nghiệp 2.2.1 Phân lập nấm gây bệnh 25 2.2.2 Phương pháp phòng ẩm .26 2.2.3 Định danh sinh học phân tử 26 2.2.3.1 Phương pháp tách chiết thu nhận gen DNA CTAB 26 2.2.3.2 Phản ứng PCR 27 2.2.3.3 Dùng PCR để khuếch đại đoạn gen ITS nấm bệnh 30 2.2.3.4 Giải trình tự định danh 32 2.2.4 Kháng sinh đồ 32 2.2.4.1 Nguyên lý .32 2.2.4.2 Đĩa giấy kháng sinh .32 2.2.4.3 Các bước thực 33 2.2.5 Phương pháp cảm nhiễm 33 2.2.5.1 Chuẩn bị 33 2.2.5.2 Bố trí thí nghiệm 34 2.2.6 CHƯƠNG Phương pháp chụp SEM 34 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 35 3.1 Kết phân lập làm nấm bệnh .35 3.1.1 Kết thu nhận mẫu trứng bệnh .35 3.1.2 Kết hình thái khuẩn lạc .36 3.1.3 Kết quan sát sợi khuẩn ty bào tử 38 3.2 Định danh chủng nấm vùng gen ITS 40 3.2.1 Kết ly trích, thu nhận gen DNA 41 3.2.2 Kết nhân đoạn gen bảo tồn ITS 41 iii Đồ Án Tốt Nghiệp 3.3 Kết so sánh vùng gen ITS chủng M.1.1, M.1, M.4.1 thiết lập phát sinh loài dựa ngân hàng liệu gen NCBI .42 3.3.1 Trình tự vùng gen ITS chủng M.1.1, M.1 M.4.1 .42 3.3.2 Thiết lập phát sinh loài 43 3.4 Kết độ nhạy cảm chủng nấm với kháng sinh 45 3.5 Kết hình ảnh trình lây nhiễm nấm trứng cá kĩ thuật SEM .46 3.5.1 Kết hình ảnh lây nhiễm kính hiển vi quang học 47 3.5.2 Kết hình ảnh trình lây nhiễm kĩ thuật SEM 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 Kết luận 51 Kiến nghị .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường PHỤ LỤC B: Kết trình tự vùng gen bảo tồn ITS PHỤ LỤC C: Kết trình tự vùng gen chủng so sánh NCBI PHỤ LỤC D: Kết hình ảnh kĩ thuật SEM trình lây nhiễm nấm trứng cá Bá Chủ iv Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Bp Base Pair CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleotide Acid EDTA Ethylene- diamine-Tetraacetic-Acid ITS Internal transcribed spacer PCR Polymerase Chain Reation PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth PYGSA Peptone Yeast extract Glucose Salt Agar SEM Scanning Electron Microscope TAE Tris-Acetic acid- Ethylenediamine- Tetraacetae TE Tris- Ethylenediamine- Tetraacet v Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS [22] 15 Bảng 3.1 Kết độ nhạy cảm chủng M.1.1, M.1 M.4.1 với kháng sinh 45 Bảng 3.2 Kích thước đường kính vịng kháng khuẩn kháng nấm sau 72 46 vi Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni) [28] Hình 1.2 Con đực nuốt trứng vào miệng để ấp [29] Hình 1.3 Trứng cá Bá Chủ sau thụ tinh [21] Hình 1.4 Hệ thống bể ươm [4] .9 Hình 1.5 Bản đồ mồi vùng gen ITS [22] 15 Hình 1.6 Hình thái bên ngồi vật kí sinh chụp SEM [14] 23 Hình 1.7 Sự thay đổi hình thái xảy bề mặt tế bào chụp SEM [14] 23 Hình 3.1 Trứng cá Bá Chủ 35 Hình 3.2 Trứng cá Bá Chủ bị nhiễm bệnh 35 Hình 3.3 Khuẩn lạc chủng M.1.1 môi trường PDA 28oC 72 36 Hình 3.4 Khuẩn lạc chủng M.1 môi trường PDA 28oC 72 36 Hình 3.5 Khuẩn lạc chủng M.4.1 mơi trường PDA 28oC .37 Hình 3.6 Sợi khuẩn ty hình thành bào tử chủng M.1.1 (40X) .38 Hình 3.7 Sợi khuẩn ty hình thành bào tử chủng M.1 (100X) 39 Hình 3.8 Sợi khuẩn ty bào tử chủng M.4.1 (100X) 40 Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm ly trích gen DNA chủng M.1.1, M.1 M.4.1 gel agarose 1% .41 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR chủng M.1.1, M.1 M.4.1 gel agarose 1% .42 Hình 3.11 Cây phát sinh lồi dựa phân tích trình tự vùng gen ITS chủng M.1.1, M.1, M.4.1 với chủng nấm ngân hàng gen NCBI .43 vii Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 3.13 Kết mẫu đối chứng kính hiển vi quang học (100X) Kết quan sát kính hiển vi quang học (hình 3.13) cho thấy khơng phát có diện sợi nấm trứng Mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1.1: quan sát sau 48 khơng có tượng trứng bị nhiễm bệnh, trứng phát triển bình thường Hình 3.14 Kết mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1.1 kính hiển vi quang học (100X) Kết quan sát kính hiển vi quang học (hình 3.14) cho thấy khơng phát có diện sợi nấm trứng Mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1: quan sát sau 48 khơng có tượng trứng bị nhiễm bệnh, trứng phát triển bình thường 48 Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 3.15 Kết mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1 kính hiển vi quang học (100X) Kết quan sát kính hiển vi quang học (hình 3.15) cho thấy khơng phát có diện sợi nấm trứng Mẫu trứng cảm nhiễm có dấu hiệu nhiễm bệnh, từ màu đỏ cam chuyển dần sang màu trắng đục, cứng dai Trứng chết cố định gửi chụp kĩ thuật SEM 3.5.2 Kết hình ảnh trình lây nhiễm kĩ thuật SEM Hình 3.16 Bề mặt trứng mẫu đối chứng chụp SEM Kết chụp SEM bề mặt mẫu đối chứng (hình 3.16) khơng có dấu hiệu nhiễm sợi nấm 49 Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 3.17 Bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 chụp SEM (100X 500X) Kết chụp SEM bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 cho thấy vùng không nhiễm với độ phân giải 100X (hình 3.17a) 500X (hình 3.17b) Hình 3.18 Bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 chụp SEM (500X 1000X) Kết chụp SEM bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 cho thấy thay đổi từ vùng không nhiễm sang vùng nhiễm nấm với độ phân giải 500X (hình 3.18a) vùng nhiễm nấm với độ phân giải 1000X (hình 3.18b) so sánh với bề mặt trứng mẫu đối chứng (hình 3.16) cho thấy xâm nhiễm chủng M.4.1 trứng 50 Đồ Án Tốt Nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ mẫu trứng cá Bá Chủ bị nhiễm bệnh phân lập, làm chọn lọc chủng M.1.1, M.1 M.4.1.Kết hình thái học khuẩn lạc, khuẩn ty bào tử cho thấy chủng M.1.1 có khả thuộc chi Fusarium, chủng M.1 thuộc chi Lecanicillium chủng M.4.1 thuộc chi Neurospora Dựa vào kết thu nhận gen DNA nhân vùng bảo tồn ITS chủng M.1.1, M M.4.1 với so sánh liệu gen chủng ngân hàng gen NCBI cho kết là: chủng M.1.1 có mức độ tương đồng với lồi Fusarium incarnatum 100%, chủng M.1 có mức độ tương đồng với loài Lecanicillium tenuipes 100% tương tự chủng M.4.1 với loài Neurospora crassa 99% Kết cảm nhiễm chủng nấm với trứng cá Bá Chủ từ hình ảnh kính hiển vi quang học kĩ thuật SEM cho thấy chủng Neurospora crassa có khả xâm nhiễm vào trứng cá Bá Chủ gây hỏng trứng trình ấp Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng kháng sinh chủng cho kết là: loại kháng sinh kháng khuẩn Ampiciline (Am), Chloramphenicol (Cl), Penicilin (Pn), Streptomycin (Sm) Tetracycline (Te) khơng có tác dụng với loại nấm bệnh định danh Kháng sinh kháng nấm Amphotericin (AMB), Ketoconazole (KCA) Nystatin (NY) có tác dụng tốt chủng M.4.1 (Neurospora crassa), đặc biệt kháng tốt Nystatin (NY) Từ kết thu cho thấy nấm Neurospora crassa có khả gây bệnh làm hỏng trứng cá Bá Chủ Kiến nghị Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa nấm Neurospora crassa 51 Đồ Án Tốt Nghiệp Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến lây nhiễm nấm Neurospora crassa trứng cá Bá Chủ nhằm tăng hiệu suất trứng nở Cần khảo sát thêm loại kháng sinh 52 Đồ Án Tốt Nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Ts Phạm Minh Đức, Nguyễn Thanh Phương Trần Ngọc Tuấn, 2010 Tổng quan bệnh nấm động thủy sản Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số 16b: 88-97 [2] Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Bùi Quang Tề Đỗ Thị Muội, 2004 Giáo trình Bệnh học thủy sản Đại học Thủy sản Nha Trang, 2004, NXB Nông Nghiệp, Thành phố HCM [3] Đặng Thị Hồng Oanh Trần Thị Tuyết Hoa 2005 Giáo trình bệnh học thủy sản Đại học Cần Thơ Trang 73 [4] Võ Minh Sơn (2013) Nghiên cứu ứng dụng qui trình sản xuất giống cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni Koumans, 1933) Việt Nam Tài liệu tiếng Anh [5] AHFS DRUG INFORMATION 2006 (2006 ed.) American Society of HealthSystem Pharmacists 2006 [6] "Aspergillus sydowii (Bainier & Sartory) Thom & Church 1926" MycoBank International Mycological Association Retrieved 2012-10-10 [7] Cites (2007) Convention on international trade in endangered species of wild fauna flora Fourteenth meeting of the Conference of the Parties The Hague (N etherlvàs), 3-15 June 2007 CoP14 Prop 19 [8] Dalė Pečiulytė, Irena Nedveckytė, Vaidilutė Dirginčiūtė-Volodkienė, Vincas Būda (2010) Pine defoliator Bupalus piniaria L (Lepidoptera: Geometridae) and its entomopathogenic fungi EKOLOGIJA Vol 56 No 1–2 P 34–40 [9] Guarro Josep, Gené Josepa, and Stchigel Alberto M., 1999 Developments in fungal taxonomy Clinical Microbiology Reviews Vol 12, No 3, p 454-500 53 Đồ Án Tốt Nghiệp [10] Khoa, L V., K Hatai, T Aoki 2004 Fusarium incarnatum isolated from black tiger shrimp Penaeus monodon Fabricius, with black gill disease cultured in Vietnam Journal of Fish Diseases 27: 507-515 [11] Handwerk, Brian (May 6, 2005) Egypt's "King Tut Curse" Caused by Tomb Toxins_National Geographic [12] Hsiao-Che Kuo, Sun Hui, Jaeyoung Choi, Frederick O Asiegbu, Jari P T Valkonen and Yong-Hwan Lee (2014) Secret lifestyles of Neurospora crassa Scientific Reports 4, Article number: 5135 doi:10.1038/srep05135 [13] M M Songe, A Willems, J Wiik-Nielsen, E Thoen, Ø Evensen, P van West and I Skaar (2015), Saprolegnia diclina IIIA and S parasitica employ different infection strategies when colonizing eggs of Atlantic salmon, Salmo salar L, Journal of Fish Diseases, doi:10.1111/jfd.12368 [14] Núria Cortadellas, Eva Fernández, and Almudena Garcia, Biomedical and Biological Applications of Scanning Electron Microscopy, Handbook of instrumental techniques from CCiTUB [15] Petri WA in Brunton LL, Chabner BA, Knollmann BC (eds.) (2011 ) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th ed., Chapter 53 McGraw-Hill, New York [16] Singh B, Mitchison DA (16 January 1954) Bactericidal Activity of Streptomycin and Isoniazid Against Tubercle Bacilli British Medical Journal (4854): 130 – 132.doi:10.1136/bmj.1.4854.130 PMC 2084433 PMID 13106497 [17] T R Prabha, K Revathi1, M S Vinod, S P Shanthakumar and Paul Bernard, 2013 A simple method for total genomic DNA extraction from water moulds Current science 104(3): 345-346 54 Đồ Án Tốt Nghiệp [18] Vagelli, A (2007) Synopsis of the biology conservation status of the Banggai cardinalfish Pterapogon kauderni Presentation given by Dr Alejvàro Vagelli to the Indonesian CITES Authorities, Jakarta, 24 May 2007 [19] Vagelli, A A (2011) The Banggai Cardinalfish: Natural History, Conservation, Culture of Pterapogon kauderni Wiley, Hoboken [20] Yanong, R P E 2003 Fungal diseases of fish Vet Clin Exot Anim 6: 377– 400 Tài liệu từ Internet [21] http://blog.aquanerd.com/wp-content/uploads/2013/12/ [22] http://www.clarku.edu/faculty/dhibbett/protocols_folder/primers/primers.htm [23] http://en.wikipedia.org/wiki/Flucytosine [24] https://en.wikipedia.org/wiki/Neurospora_crassa [25] http://en.wikipedia.org/wiki/Nystatin [26] http://www.dieutri.vn/s/14-6-2011/S804/Streptomycin.htm [27] http://www.dieutri.vn/a/7-5-2011/S423/Amphotericin-B.htm [28] http://www.practicalfishkeeping.co.uk/content.php?sid=5109 [29] http://www.oceanflooraquariums.com/underwater-photography-by-daviddempsey [30] http://vi.wikipedia.org/wiki/Penicillin 55 Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường Môi trường nuôi cấy : PDA (Potato Dextrose Agar) Dịch chiết khoai tây 20% Dextrose 2% Agar 2% Chloramphenycol 100 mg Sodium propionate 2g pH 5.6 H2O 1000 ml Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC B: Kết trình tự vùng gen bảo tồn ITS Chủng M.1.1 Đồ Án Tốt Nghiệp Chủng M.1 Đồ Án Tốt Nghiệp Chủng M.4.1 Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC C: Kết trình tự vùng gen chủng so sánh NCBI Lecanicillium fusisporum KF766521.1 CAACTCCCAAACCCTTATGTGAACATACCAATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGTGTCCGGCAGGCCC TCGCGGCCGGCCGCGACCCGGATCCAGGCGGACGCCGGAGACCATCCAAAAACTCTTTGTATTTTAGCAAG TCTTCTGAATGAGCCGCAAGGCAACACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA ACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCTCCCTT TGGGGAGCCCGGCGTTGGGGACCGGCCTCTACCGCCGGCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCG ACCTCTGCGTAGTAACTCACCTCGCACCGGAACCCCGACGTGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTTCTGA ACGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATC Lecanicillium tenuipes JN036556.1 CAACTCCCAAACCCTTATGTGAACATACCAATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGTGTCCGGCAGGCCC TCGCGGCCGGCCGCGACCCGGATCCAGGCGGACGCCGGAGACCATCCAAAAACTCTTTGTATTTTAGCAAG TCTTCTGAATGAGCCGCAAGGCAACACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA ACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCTCCCTT TGGGGAGCCCGGCGTTGGGGACCGGCCTCTACCGCCGGCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCG ACCTCTGCGTAGTAACTCACCTCGCACCGGAACCCCGACGTGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTTCTGA ACG-TGACCTCGAATCAGG Fusarium incarnatum KM519192.1 CAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGA CGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAA CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGT TCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGAT TGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCC GTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA AGCGGAGGAA Penicillium expansum FJ008994.1 CAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGA CGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAA CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGT Đồ Án Tốt Nghiệp TCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGAT TGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCC GTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA AGCGGAGGA Fusarium longipes AB820724.1 CAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAAAGGGA CGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAA CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGT TCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGAT TGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCC GTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA AGCGGAGGAA Neurospora tetrasperma FJ904922.1 CAGAGTTGCAAAACTCCCACAAACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGA AAGGCCCTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTCTCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACT AAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCG AATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCATCA AGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGCCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCACA CCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGT TGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA Neurospora crassa FJ360521.1 CAGAGTTGCAAAACTCCCACAAACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGA AAGGCCTTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTCTCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACT AAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCG AATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCATCA AGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGTCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCACA CCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGT TGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA Neurospora pannonica KF881757.1 CAGAGTTGCAAAACTCCCACAAACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGA AAGGCCCTCGGGTCCTCCCGGATCCTCGGGTCTCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACT AAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG Đồ Án Tốt Nghiệp GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCG AATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCATCA AGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGCCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCACA CCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGT TGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA PHỤ LỤC D: Kết hình ảnh kĩ thuật SEM trình lây nhiễm nấm trứng cá Bá Chủ ... khuẩn ty bào tử chủng nấm gây bệnh phân lập từ trứng cá Bá Chủ, tiếp tục định danh mức độ phân tử dựa vào vùng gen ITS với cặp mồi ITS1 F ITS4 R 3.2 Định danh chủng nấm vùng gen ITS Sau phân lập... nghiên cứu nhiễm nấm bệnh trứng cá Bá Chủ Mục đích nghiên cứu Mục đích đề tài xác định nấm gây bệnh trứng cá Bá Chủ, sau xác định nấm gây bệnh dựa vào đặc điểm nghiên cứu nấm bệnh đưa biện pháp khắc... ảnh trình lây nhiễm nấm trứng cá kĩ thuật SEM .46 3.5.1 Kết hình ảnh lây nhiễm kính hiển vi quang học 47 3.5.2 Kết hình ảnh trình lây nhiễm kĩ thuật SEM 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ