CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.2. Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS
Sau khi phân lập và quan sát các đặc điểm hình thái học, các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 được tăng sinh trong môi trường PDB để thu sinh khối và sau đó tiến hành quá trình ly trích và thu nhận DNA bộ gen.
a b
c d
Quá trình định danh bao gồm các bước tách chiết DNA, khuếch đại đoạn DNA bằng phản ứng PCR, điện di kiểm tra sản phẩm PCR, giải trình tự gen và so sánh đoạn trình tự với trình tự gen của các loài cơ sở dữ liệu. NCBI.
3.2.1. Kết quả ly trích, thu nhận bộ gen DNA
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm ly trích bộ gen DNA của 3 chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 trên gel agarose 1%.
Từ hình 3.9 cho thấy kết quả ly trích bộ gen DNA của 3 chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 đều tốt. Từ đó, tiếp tục sử dụng sản phẩm ly trích dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen ITS.
3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS
Đoạn gen bảo tồn ITS của các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 được nhân bản với cặp mồi ITS1F và ITS4R bằng kĩ thuật PCR.
Từ hình 3.10 cho thấy kết quả điện đi của sản phẩm PCR đều có các vạch nằm tương đương ở vị trí khoảng 500 - 600 bp. Sản phẩm PCR được gửi đi công ty Nam Khoa để giải trình tự.
M.1.1 M.1 M.4.1
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 trên gel agarose 1%.
3.3. Kết quả so sánh vùng gen ITS của 3 chủng M.1.1, M.1, M.4.1 và thiết lập cây phát sinh loài dựa trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI
Sau khi gửi sản phẩm PCR để giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa thì kết quả được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng như phần mềm ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 và Ngân hàng gen http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, dựng cây phát sinh loài.
3.3.1. Trình tự vùng gen ITS của các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1
ChủngM.1.1:TCTCCTACGGATACGGTCGGTGGACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTG TGAACATACCTAAACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACT CTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGAT GAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC CCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAAC CCGCGTTCCCCAAATCGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGC GGCCACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA AGCGGAGGAA
ChủngM.1:GCTTCGATTCTACGATCGGTGGACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCTTATGT GAACATACCAATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGTGTCCGGCAGGCCCTCGCGGCCGGCCGCGACCCGGATCCAGGC GGACGCCGGAGACCATCCAAAAACTCTTTGTATTTTAGCAAGTCTTCTGAATGAGCCGCAAGGCAACACAAATGAATCAA AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAT TCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAAC CCTCGAGCTCCCTTTGGGGAGCCCGGCGTTGGGGACCGGCCTCTACCGCCGGCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGC
500-600 bp
M.1.1 M.1 M.4.1 Thang
GGCGACCTCTGCGTAGTAACTCACCTCGCACCGGAACCCCGACGTGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAACGTT GACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAA
ChủngM.4.1:CTCACGACTCTACCGATTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACAGAGTTGCAAAACTCCCACAAACC ATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGGAAAGGCCCTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTCT CCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACTAAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAATA AGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTG CAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCAT TTCAACCATCAAGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGTCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCA CACCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGTTGACCTC GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA
3.3.2. Thiết lập cây phát sinh loài
Hình 3.11. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS các chủng M.1.1, M.1, M.4.1 với các chủng nấm trên ngân hàng gen NCBI.
Tiến hành so sánh vùng gen của các mẫu phân lập được với vùng gen bảo tồn ITS của các chủng nấm sợi trên ngân hàng gen NCBI, các đặc điểm hình thái học của các chủng tương đồng và có được kết quả như sau.
Chủng M.1.1 có mối quan hệ gần nhất với loài Fusarium incarnatum
AB820724.1 có mức độ tương đồng là 100%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng M.1.1 là loài Fusarium incarnatum
Fusarium incarnatum được phân lập từ tổn thương mang của tôm sú nuôi (Penaeus monodon), mỗi vụ thu hoạch trong thời gian 2000 - 2002 tại tỉnh Nghệ An, Việt Nam. Tôm bị nhiễm bệnh cho thấy dấu hiệu điển hình của bệnh mang đen và tỷ lệ chết khoảng một tháng trước khi thu hoạch [10].
Chủng M.1 có mối quan hệ gần nhất với loài Lecanicillium fusisporum KF766521.1 và Lecanicillium tenuipes JN036556.1 với mức độ tương đồng là 100%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và các nghiên cứu về đặc điểm hình thái thì chủng M.1 là loài Lecanicillium tenuipes.
Lecanicillium tenuipes được phân lập từ 0,82% xác B. Piniaria được tìm thấy trong đất và được phân loại như là một nấm keratinophylic. Nó có thể gây ra một số bệnh hại cây trồng. L. tenuipes được tuyên bố hoạt động chitinolytic do đó nó có thể được kết hợp với côn trùng hoặc tuyến trùng trong đất [8].
Chủng M.4.1 có mối quan hệ gần nhất với loài Neurospora Crassa FJ360521.1, Neurospora pannonica KF881757.1 và Neurospora tetrasperma FJ904922.1 với mức độ gen tương đồng là 99%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng M.4.1 là loài Neurospora Crassa
Các báo cáo được công bố đầu tiên của loại nấm này là từ một sự phá hoại của các tiệm bánh Pháp vào năm 1843 [24].
N. crassa có thể hoạt động không chỉ như là một thực vật ký sinh mà còn là một tác nhân gây bệnh trên cây thông Scots, khi cây chủ đã được phát triển trên môi trường thạch nước hoặc trong các môi trường có kiểm soát trong nhà kính. Nhiễm trùng với N. crassa kích thích các triệu chứng bệnh điển hình, cuối cùng gây ra cái chết của cây thông Scots [12].