1.3. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
1.3.2. PCR trong định danh vi sinh vật
1.3.2.1. Kỹ thuật PCR
Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gen.
PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới.
Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về
trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược [11].
1.3.2.2. Gen rDNA
Gen rDNA là nhóm gen mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa.
Hơn nữa, ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa.
Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng trình tự không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật.
Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen, khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên quan đến rDNA. Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ sở rDNA được phát triển những năm đầu của thập niên 90 đã tìm được quan hệ di truyền của nhiều loài nấm sợi.
1.3.2.3. Mồi
Internal transcribed spacer (ITS) là vùng phiên mã bên trong, có rất nhiều sự biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của vi sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong cùng loài [9].
Các mồi vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5,8S và 28S. ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Mồi ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng
lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8S của N. crassa, Szchiosaccharomyces prombe và S.cerevisiae, Viciafaba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28 S của S. prombe, S.cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Mồi ITS5 có trình tự giống với rDNA 18S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách mồi ITS1 25bp.
Bảng 1.1. Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS [22].
ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G White và cộng sự. 1990
ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A Gardes và Bruns 1993
ITS2 GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC White và cộng sự. 1990
ITS3 GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC White và cộng sự. 1990
ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC White và cộng sự. 1990
ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG Gardes và Bruns 1993
ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G White và cộng sự. 1990
Hình 1.5. Bản đồ mồi trong vùng gen ITS [22].
1.3.2.4. Ứng dụng của PCR trong quá trình định danh loài vi sinh vật
Hoàng Quốc Khánh thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Phạm Thị Lan Thanh thuộc Trường Đại học Lạc Hồng với đề tài “Phân lập, định danh và xác định các chủng Lactobacillus có tiềm năng probiotic từ con người”
Khoa, L. V., K. Hatai, và T. Aoki. 2004, “Fusarium incarnatum isolated from black tiger shrimp, Penaeus monodon Fabricius, with black gill disease cultured in Vietnam”
Nguyễn Thị Thanh Thủy, Đỗ Ngọc Thúy và Nguyễn Bá Hiên với để tài:”Thiết lập phương pháp pcr để xác định vi khuẩn verotoxigenic e.coli (vtec) trong thịt” với phương pháp PCR phức với 3 loại cặp mồi (VT1, VT2 và eae), các điều kiện phản ứng như đã được thiết lập và chuẩn hóa trong nghiên cứu này có thể được áp dụng để xác định vi khuẩn Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC).
M M Songe, A Willems, J Wiik-Nielsen, E Thoen, ỉ Evensen, P van West và I Skaar 2015, “Saprolegnia diclina IIIA and S. parasitica employ different infection strategies when colonizing eggs of Atlantic salmon, Salmo salar L”.
Văn Hồng Cầm, Phan Thị Thảo, Đặng Thúy Bình với đề tài:” Phân lập và định danh vi khuẩn phát sáng gây bệnh trên cá ngựa đen (Hippocampus kuda)”