Báo cáo Vi sinh ứng dụng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA NUÔI TRỒNG Báo cáo Vi sinh ứng dụng Chủ đề 4: Nhận dạng Vibrio spp thu môi trường CPC agar từ mẫu nước biển tự nhiên 1.Mở đầu Như biết vi khuẩn (chẳng hạn Vibrio spp) nguyên nhân gây bệnh nguy hiểm cho đối tượng nuôi trồng thủy sản tác hại chúng với sức khỏe người Song hiểu biết nghiên cứu chúng đến thời điểm cịn nhiều hạn chế Do việc nghiên cứu, phân lập, nhận dạng chúng để có hiểu biết sâu sắc từ làm sở cho việc chẩn đốn phịng trị bệnh có vai trị to lớn ni trồng thủy sản việc bảo vệ sức khỏe người! Nội dung Trong trình nghiên cứu, phân lập để xác định loài vi sinh vật nhà khoa học sử dụng môi trường khác để tiến hành phân lập Từ tiến hành nhận diện tìm hiểu kĩ Vi sinh vật phương pháp nghiên cứu khác Môi trường CPC (cellobiose-polymixin B-colistin agar) sử dụng để thử nghiệm phân lập xác định Vibrio vulnificus từ mẫu nước môi trường tự nhiên Ngồi từ mơi trường tạo môi trường phân lập khác cách : +Pha trộn tỉ lệ môi trường CPC khác +Giảm nông độ Colistin môi trường nuôi cấy +Loại bỏ thành phần CPC agar Mẫu nước tự nhiên/mẫu ĐVTS mật độ Vibrio vulnificus CPC agar Phương pháp cấy vạch ước lượng Những điều tra gần V vulnificus Arias cộng tiến hành nghiên cứu mẫu nước biển mẫu động vật thủy sản khu vực ven bờ biển Tây Ban Nha thuộc biển Địa Trung Hải: Mẫu nước tự nhiên/mẫu ĐVTS CPC agar TCBS agar khuẩn lạc Đặc điểm hình thái Kiểm tra PCR (các đoạn mồi đặc biệt) Kết luận ? (nhanh, xác) Giả định V vulnificus Các khuẩn lạc Vibrio vulnificus môi trường TCBS CPC V vulnificus Trong q trình nghiên cứu đó, V vulnificus phát vùng biển Tây Ban Nha thuộc biển Địa Trung Hải Nhưng có 7.6% khuẩn lạc phát triển nhận dạng thơng qua đặc điểm hình thái V vulnificus (đã kiểm chứng PCR) Những khuẩn lạc kiểm chứng PCR khơng nhận dạng Người ta tiến hành việc xác định số dịng tiêu biểu thu mơi trường CPC agar Trong nghiên cứu thấy xuất loài tương tự V vulnificus chưa kiểm chứng cách chắn Kết thu sai lệch : +Sự thiếu xác phương pháp PCR +sự có mặt vi khuẩn cạnh tranh khác (chúng có đặc điểm hình thái tương tự V vulnificus) Bảng : đặc điểm sinh hóa số lồi Vibrio Đặc điểm sinh hóa V parahaemolyticus Nhuộm Gr Di động Phản ứng Oxydase Phát triển 370C Màu kh lạc / TCBS Arginine dyhidrolase Lysine decarboxylase Khử Nitrat Phát triển 0%NaCl Phát triển 3%NaCl Phát triển 7%NaCl + + + Xanh + + + + V harveyi + + + Xanh + + + + V alginolyticus + + + Vàng + + + + V anguillarum + + + Vàng + + - V vulnificus + + + Xanh + + + - Để nhận diện lồi khơng phải Vibrio nhà nghiên cứu chọn 284 chủng mà xác định V vulnificus để phân lập CPC agar Trong 284 chủng phân lập có 57 thể phân lập lồi thuộc Vibrio khơng nhận dạng Những chủng có kết dương tính với Arginine dehidrolase số chúng âm tính với Decacboxylase Thêm vào tỉ lệ Enterobacteriaceae thấp xác định API 20E Và vài dịng khơng thể phát triển mơi trường lên men khơng phải Vibrio khơng xác định Những lồi phong phú V harveyi (chiếm 24%) thể phân lập với V splendidus, V navarrensis, V alginolyticus, V parahaemolyticus Những loài lại chiếm tỉ lệ thấp 1% V harveyi, V splendidus loài phong phú trình nghiên cứu suốt mùa nóng lẫn mùa lạnh chúng có khả cạnh tranh với lồi khác có nhu cầu độ mặn thấp như: V vulnificus, V parahaemolyticus Điều liên quan đến phạm vi tác động hẹp V vulnificus, V parahaemolyticus Vì vậy, với điều kiện độ mặn cao Địa Trung Hải lại thuận lợi cho lồi Vibrio khác Do nhận thấy số lượng V vulnificus gần giữ ngưỡng giới hạn định Một vài Enterobacteriaceae xác định như: Serratia sp, Citrobacter sp Proteus sp chiếm ưu lớn Những thể phân lập phát triển phát triển môi trường CPC agar lấy từ mẫu nước với mật độ cao, không ổn định trực khuẩn đường ruột Coliform Có ý loài V alginolyticus, V parahaemolyticus xác định khơng có khả sử dụng Cellulose nguồn Cacbon tạo lượng chúng Sự phát triển mức loài Vibrio cạnh tranh khác bao gồm dịng có khả sử dụng Cellulose làm giảm hoạt tính mơi trường CPC agar Từ dẫn đến sai lệch việc xác định mẫu có mơi trường nơi mà chúng sinh sống chiếm số it Bảng Các lồi (khác với V vulnificus) thu mơi trường CPC agar từ mẫu nước biển tự nhiên Species Vibrio spp: V harveyi V splendidus V navarrensidus V alginolyticus V parahaemolyticus V fluvialis V anguillarum V tubashii V pelagius V proteolyticus Unidentified Vibrio spp Non-Vibrio Non-fermenters Enterobacteria TOTAL No strains (%) total 67 54 38 22 14 2 1 57 24 19 13 0.7 0.7 0.7 0.3 0.3 20 20 1.5 284 100 Massad Oliver cho môi trường CPC agar lựa chọn tốt cho V cholerae V vulnificus Đồng thời họ kiểm tra với 19 loài Vibrio số loài khác nhận ủ ấm 400C có chủng V parahaemolyticus phát triển Trong nghiên cứu sau đó, vài tác giả dùng môi trường CPC agar làm giảm hoạt tính mơi trường cách giảm nồng độ Colistin (mCPC) cho phân lập V vulnificus từ mẫu nước biển hay mẫu động vật thủy sản có vỏ từ vùng biển khác Moriss cộng kiểm tra nhận thấy V fluvialis, V harveyi có khả sử dụng Cellulose mơi trường CPC Mơ hình nghiên cứu Moriss cộng Mẫu nước tự nhiên/mẫu ĐVTS Cytotoxin-hemolysin gene V vulnificus (chiếm 28.7% khuẩn lạc kiểm tra) CPC agar mCPC Khuẩn lạc (có khả sử dụng Cellulose) Kiểm tra PCR (các đoạn mồi đặc biệt) Høi cộng sử dụng mơi trường CC agar (CellobioseColistin agar) nhận thấy Polymyxin B không thật cần thiết (chất kháng sinh Colistin xem chất kháng khuẩn) Họ nhận thấy rằng: môi trường cải thiện cách đáng kể tốc độ phân lập V vulnificus từ mẫu nước mẫu lắng cặn so với môi trường mCPC agar Tuy việc làm giảm nồng độ chất kháng sinh khơng ngăn chặn hồn toàn khả cạnh tranh ức chế loài Vibrio khác Họ nhận thấy chủng V vulnificus phân lập từ mẫu cá Chình bị bệnh không phát triển môi trường CPC agar Điều có liên quan đến việc đánh giá thấp có mặt lồi sử dụng mơi trường CPC agar Ngoài họ kiểm tra 125 chủng xác nhận V vulnificus chủng có liên quan phát triển môi trường chọn lọc Tất thể phân lập V vulnificus phát triển môi trường MB (marine broth) 280C 14 nuôi cấy môi trường CPC agar 14 400C Chỉ có số phát triển cho dương tính với Cellulose Việc kiểm tra tiến hành lô môi trường CPC agar hồn tồn độc lập 91% mẫu cá Chình bị bệnh dòng E (serovar E) với 25% thể phân lập mẫu môi trường 33% thể phân lập dịng có liên quan (khơng phải dịng E) phát triển Môi trường MB Tất đềuphát triển tốt 280C ;14h 125 dòng V vulnificus chủng liên quan CPC agar 400C; 14h CPC agar 400C; 14h Chỉ có71/125 dịng V vulnificus phát triển (chiếm 57%) Quan sát bảng số Bảng Sự phát triển dòng V vulnificus CPC agar Vibrio vulnificus Non-serogroup E isolates Clinical isolated Enviromental strains Serogroup E isolates TOTAL No strains tested Show typical growth (%) 85 34 125 (67%) 64 (75%) (9%) 71 (57%) Sự phát triển V vulnificus từ mẫu cá Chình bị bệnh giải thích nhiệt độ ủ cao (400C) vượt qua giới hạn nhiệt độ chủng Phát khả phát triển môt trường CPC agar không chia sẻ tất chủng V vulnificus trình bày Høi cộng (đã tìm thấy vài chủng gây bệnh chủng có liên quan phát triển MICs (là chế phẩm vi sinh) 3 Kết luận Từ kết thu nghiên cứu trước vùng biển Địa Trung Hải kết luận rằng:  Mơi trường CPC có tính đặc trưng thấp có mẫu thí nghiệm chứa số lượng lớn lồi Vibrio có khả sử dụng Cellulose V harveyi, V splendidus Việc xảy với số lồi V navarrensis có khả sử dụng Cellulose  Một số chủng loài Vibrio mà khơng có khả sử dụng Cellulose nguồn Cacbon nguồn lượng V alginolyticus, V parahaemolyticus phát triển với hình thái đặc trưng V vulnificus đĩa thạch CPC agar ảnh hưởng đến độ xác khả phán đốn mơi trường  Khơng phải tất chủng V vulnificus kiểm tra phát triển môi trường CPC agar  Phương pháp PCR có độ tin cậy cao nhận dạng  Tính chọn lọc thấp mơi trường CPC agar thể phân lập diện với số lượng cao loài Vibrio cạnh tranh khác phù hợp với môi trường đặc biệt mà khơng thể ức chế chúng cách hồn tồn  Ngồi kết hợp mơi trường CPC agar phương pháp PCR để phát có mặt lồi gây bệnh người ta cịn sử dụng phương pháp khác Vấn đề tranh cãi để mang lại xác minh xác có sở cho khuẩn lạc V vulnificus CPC agar mà mẫu nghiên cứu có số lượng lớn lồi cạnh tranh khác  ... trình nghiên cứu, phân lập để xác định loài vi sinh vật nhà khoa học sử dụng môi trường khác để tiến hành phân lập Từ tiến hành nhận diện tìm hiểu kĩ Vi sinh vật phương pháp nghiên cứu khác Môi... kiểm chứng cách chắn Kết thu sai lệch : +Sự thiếu xác phương pháp PCR +sự có mặt vi khuẩn cạnh tranh khác (chúng có đặc điểm hình thái tương tự V vulnificus) Bảng : đặc điểm sinh hóa số lồi Vibrio... sử dụng Cellulose nguồn Cacbon tạo lượng chúng Sự phát triển mức loài Vibrio cạnh tranh khác bao gồm dịng có khả sử dụng Cellulose làm giảm hoạt tính mơi trường CPC agar Từ dẫn đến sai lệch vi? ??c