Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử real time PCR định lượng HBV DNA trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm viêm gan b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TRẦN THỊ NGUYÊN DUNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG HBV DNA TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN NHIỄM VIÊM GAN B LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội, 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TRẦN THỊ NGUYÊN DUNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG HBV DNA TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN NHIỄM VIÊM GAN B LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN : TS.NGUYỄN XUÂN THÀNH Hà Ni, 2006 mục lục Trang Đặt vấn đề Chương I: Tổng quan tài liệu I Bệnh viêm gan B virut I.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan virut viªm gan B I.2 BiĨu hiƯn lâm sàng bệnh viêm gan B virut II Tình hình nhiễm viêm gan virut B Việt Nam giới III Virut viêm gan B (HBV) III.1 Hình thể cấu trúc virút viêm gan B III.2 Sự mà hoá gen cho kháng nguyên HBV phân typ HBV 10 III.3 Các dấu ấn virut viêm gan B 16 III.4 Sức đề kháng HBV 18 III.5 Khả chế gây bệnh HBV 19 IV Các kỹ thuật chẩn đoán HBV 21 IV.1 Các kỹ thuật miễn dịch 22 IV.2 Kỹ thuật PCR truyền thống 26 IV.3 Kỹ thuật real time PCR định lượng HBV DNA 27 V Vai trò, ý nghĩa định lượng HBV DNA chẩn đoán điều trị 34 Chương II: Đối tượng, vật liệu phương pháp nghiên cứu 35 I Đối tượng nghiên cứu 35 II Vật liệu nghiên cứu 35 III Phương pháp nghiên cứu 37 III.1.1 Kü thuËt t¸ch chiÕt DNA 37 III.1.2 Kü thuật miễn dịch xác định dấu ấn virút viêm gan B 39 III.1.3 Kỹ thuật định lượng HBV DNA b»ng kü thuËt real time PCR 42 Ch­¬ng III: KÕt bàn luận 47 I Đánh giá độ nhạy đặc hiệu quy trình kỹ thuật real-time PCR định lượng virút viêm gan B huyết bệnh nhân 47 I.1 Đánh giá độ nhạy cặp mồi thiết kế 47 I.2 Đánh giá độ đặc hiệu cặp mồi thiết kế 49 II Tìm hiểu mối tương quan nồng độ HBV DNA với dÊu Ên kh¸c cđa HBV 50 KÕt ln 61 kiÕn nghị 62 Tài liệu tham khảo 63 Đặt vấn đề Viêm gan virut bệnh truyền nhiễm phổ biến nguy hiểm Bệnh thường gặp với tần xuất cao nước phát triển vấn đề quan trọng y tế cộng ®ång Mặc dù chương trình tiêm phịng vi rút viêm gan B (HBV) làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh viêm gan vi rút B, HBV cũn l mt mối hiểm hoạ lớn loài người đơi triệu chứng bệnh rât mơ hồ làm cho ta lầm tưởng với trường hợp rối loạn tiêu hóa hay gặp, đa số trường hợp khơng có triệu chứng lâm sàng trường hợp viêm gan vi rút B mãn tính mà có xét nghiệm máu chẩn đoán bệnh Do đó, vai trị xét nghiệm chẩn đốn viêm gan vi rút B giữ vai trò quan trọng Có nhiều loại xét nghiệm khác sử dụng chẩn đoán viêm gan vi rút B, loại có ý nghĩa khác tùy vào giai đoạn bệnh mà người bác sĩ lựa chọn xét nghiệm thích hợp Có xét nghiệm hay dùng chẩn đoán, đánh giá vi rút viêm gan siêu vi B trước HBsAg, AntiHBs, HBeAg, AntiHBe, AntiHBc IgM AntiHBc IgG Các xét nghiệm xét nghiệm bản, dùng phương pháp miễn dịch để phát có số hạn chế Vào năm cuối kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử đời có tốc độ phát triển nhanh chóng mở kỷ nguyên chẩn đoán gen nên chẩn đốn vi rút viêm gan B mức độ phân tử (Đó xét nghiệm phân tích phân tử di truyền HBV DNA) Nhờ ứng dụng kỹ thuật phân tích DNA HBV mà giải hạn chế kỹ thuật miễn dịch cị phân tích DNA giúp có sở đánh giá tình trạng bệnh, khả diễn tiến bệnh, theo dõi điều trị bệnh lựa chọn phương thuốc điều trị thích hợp HiƯn thực số xét nghiệm sinh học phân tử ë HBV như: Xác định tình trạng tăng sinh vi rút trường hợp có đột biến vùng trước lõi (Pre Core) để từ có định điều trị đặc trị khơng Đó xét nghiệm HBV DNA, kỹ thuật thường dùng để xác định HBV DNA kỹ thuật PCR (Là kỹ thuật khuếch đại DNA đích, nhạy đặc hiệu, sử dụng phổ biến không Việt Nam mà c trờn th gii); Kỹ thuật định lng vi rỳt B máu để theo dõi điều trị Nhờ xác định số lượng vi rút trước điều trị mà theo dõi số lượng vi rút trình điều trị: Tăng giảm để có thay đổi điều trị kịp thời hiệu Hai kỹ thuật thường dùng để định lượng vi rút viêm gan B Real Time PCR (Khuếch đại DNA đích với thời gian thật) bDNA (Khuếch đại tín hiệu) Trong ®ã, kü tht real time cho kết xác, độ nhạy độ đặc hiệu cao, thời gian thí nghiệm ngắn Đây mét kü tht míi ë ViƯt Nam, viƯc øng dơng kỹ thuật thực tế chưa phổ biến Nhằm mục đích đưa kỹ thuật áp dụng cách rộng rÃi nghiên cứu, chẩn đoán điều trị, tiến hành đề tài: ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử real time PCR định lượng Virut HBV DNA huyết bệnh nhân mắc viêm gan siêu vi B Mục đích: Đánh giá độ nhạy đặc hiệu quy trình kỹ thuật Real- time PCR định lượng virút viêm gan B huyết bệnh nhân Tìm hiểu mối tương quan nồng độ HBV DNA với dấu ấn khác HBV Chương I Tổng quan tài liệu I bệnh viêm gan b virut I.1 Lịch sử nghiên cứu bƯnh viªm gan virut viªm gan B Viªm gan virut thuật ngữ chung trường hợp gan bị nhiễm loại virut gây viêm gan khác Bệnh đà mô tả từ kỷ thứ năm trước công nguyên Năm 1963, Baruch Blumberg cộng phát thấy mẫu huyết người xứ Australia có loại kháng nguyên phản ứng đặc hiệu với loại kháng thể bệnh nhân bị Hemophilia người Mỹ, gọi kháng nguyên Au Loại kháng nguyên gặp người Băc Mỹ Tây Âu thấy lưu hành vài nước Châu Phi Châu gặp bệnh nhân bị bạch cầu cấp, bệnh nhân phong hội chứng Down Tuy nhiên mối liên quan kháng nguyên Au viêm gan huyết chưa biết đến cách đầy đủ Năm 1968, Prince, Okochi Murakami đà chứng minh kháng nguyên Au (mà ngày gọi kháng nguyên bề mặt viêm gan B hay HBsAg) tìm thấy đặc hiệu huyết bệnh nhân viêm gan B Năm 1970, Dane cộng đà xác định hạt virut viêm gan B hoàn chỉnh (virion) gọi tiểu thể Dane Năm 1972, Magnuis Espmark tiếp tục nghiên cứu thành phần kháng nguyên virut viêm gan B: HBcAg, HBeAg kháng thể tương ứng I.2 Biểu lâm sàng bệnh viêm gan B virut I.2.1 Viêm gan B cấp Khoảng 70% trường hợp VGSV B cấp triệu chứng lâm sàng Tuy nhiên, 30% trường hợp bệnh nhân có triệu chứng bệnh cảnh lâm sàng thường diễn tiến qua giai đoạn sau: Giai đoạn ủ bệnh: Có thể thay đổi từ 1-4 tháng Trong giai đoạn này, khám lâm sàng kết xét nghiệm âm tính Giai đoạn khởi phát: kéo dài từ 1-2 tuần, 10-20% số bệnh nhân có biểu có ban hồng, mày đay, đau khớp, viêm khớp sốt vài ngày trước xuất biểu lâm sàng: sốt nhẹ, mệt mỏi, tiểu vàng, chán ăn Giai đoạn toàn phát: kéo dài từ 2-6 tuần, mức độ nặng nhẹ thay đổi cá thể Các triệu chứng viêm gan B cấp nhẹ không vàng da nặng kết hợp với vàng da Trong trường hợp điển hình, gồm đau đầu, mệt vmỏi, chán ăn, ngứa nhẹ, buồn nôn nôn, sốt nhẹ dấu hiệu sớm xuất 2-7 ngày trước vàng da trường hợp có vàng da, đầy bụng đau khu trú hạ sườn phải hay gặp Nước tiểu trở nên sẫm màu phân nhạt màu Kháng nguyên HBs xuất vài tuần sau nhiễm virut viêm gan B Một thời gian ngắn sau xuất kháng nguyên HBe Kháng thể HBc xt hiƯn sím kh¸ng thĨ kh¸ng HBs xt muộn từ vài ngày đến vài tuần trước HBsAg biến mất, bệnh khỏi, kháng thể antiPre S1 anti Pre S2 xt hiƯn tr­íc cã anti HBs vµ lµ dÊu hiƯu tiÕn triĨn tèt cđa bƯnh Sù tồn dai dẳng kháng nguyên Pre S1 Pre S2 cho biết nhân lên virut ®ang tiÕp tơc Trong giai ®o¹n cÊp, DNA cđa virut phát kỹ thuật PCR kỹ thuật lai phân tử I.2.2 Viêm gan B mạn I.2.2.1 Viêm gan B mạn tồn Thường triệu chứng, kèm với mệt mỏi, chán ăn, đau tức nhẹ vùng hạ sườn phải Thăm khám lâm sàng bình thường thấy gan to nhẹ Những xét nghiệm chức gan bình thường I.2.2.2 Viêm gan B mạn hoạt động Phần lớn bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B mạn triệu chứng lâm sàng, nhiên số có dấu hiệu lâm sàng gồm mệt mỏi, đau hạ sườn phải, vàng da ngứa có tắc mật Biểu tăng áp lực tĩnh mạch cửa Khám thấy gan to vừa đau, thấy lách to Viêm gan virut B mạn xác định xét nghiệm sinh hoá men Transaminase cao kéo dài tháng sau giai đoạn cấp Các kháng nguyên tồn lâu máu HBsAg, HBeAg DNA virut cho thấy nhân lên virut tiếp tục Sau thời gian định (có thể từ vài tháng đến vài năm) DNA virut gắn vào genom tế bào gan, HBeAg mất, xuất kháng thể kháng HBe, men transaminase trở lại bình thường II Tình hình nhiễm viêm gan virut B Việt Nam giới II.1 Tình hình nhiễm virút viêm gan B trªn thÕ giíi Nhiễm vi rút gây viêm gan siêu vi B (HBV) vấn đề sức khỏe lớn toàn cầu, đặc biệt nước phát triển Ng­êi lµ ỉ chứa nhiễm tự nhiên động vật hoang dại, người ta đà gây bệnh thực nghiệm loài chimpanzee số loài linh trưởng khác, nhiễm HBV phát tất dân tộc tần xuất bệnh tỷ lệ mang virut người lành thay đổi tuỳ theo vùng địa lý chủng téc HiƯn nay, theo thèng kª cđa Tỉ chøc Y tÕ ThÕ giíi, ­íc tÝnh cã kho¶ng tû ng­êi đà bị nhiễm HBV, có khoảng 350 triệu người mang mầm bệnh mạn tính, 3/4 số Châu á, 25% người nhiễm virut mÃn thành viêm gan mÃn, xơ gan ung thư gan nguyên phát Hng nm khong 1-2 triu người tử vong bệnh có liên quan đến HBV viêm gan cấp, tối cấp; lâu dài xơ gan ung thư gan Tû lƯ nhiƠm HBV thay đổi theo khu vực địa lý dân cư quần thể dân cư khác Các nhóm nguy cao (truyền máu, tiêm chích, quan hƯ t×nh dơc, tiÕp xóc nghỊ nghiƯp) cã tØ lệ mang trùng 10 lần cao so với quần thể dân cư nói chung khả trở thành mang trùng sau tiếp xúc tăng lên đáp ứng miễn dịch suy giảm II.2 Tình hình nhiễm HBV ViÖt Nam Việt Nam quốc gia nằm vùng lưu hành viªm gan cao Theo TCYTTG số cơng trình nghiên cứu nước, có khoảng 515% dân số Việt Nam mang HBV hàng nǎm khoảng 35.000 người tử vong bệnh có liên quan đến HBV 56 B¶ng 2: TØ lƯ nồng độ HBV DNA mức khác HBV DNA Không xác định (< 10 coppies/ml ) trung b×nh (10 – 10 coppies/ml) coppies/ ml) n=68 10 33 25 % 14.7% 48,6% 36.7% P P P P P P Cao (>10 P P P Nh­ số 68 mẫu định lượng, hàm lượng mẫu có nồng độ virus cao chiếm tới 36,7%; từ chẩn đoán lâm sàng ban đầu không thực xác có tác dụng phản ánh phần nào, từ có kế hoạch thực thử nghiêm cần thiết Bảng 3: Mối liên quan nồng độ HBV DNA mức không xác định với dấu ấn HBV stt Mà sè coppies/ ml huyÕt Nång ®é HBsAg HBeAg Anti-HBe + + M65 - 345.5 M7 - 345.3 - M15 - 565.6 - + M21 - 378.9 + + M58 - 643.8 + M14 - 265.8 - M52 - 124.6 - + M1 - 242.3 - - M74 - 255.7 10 M26 - 243.5 - + - + 57 Nhìn vào bảng kết nhận thấy, mẫu huyết cho kết không xác định, có hàm lượng HBsAg tương đối thấp, đa số HBeAg âm tính, anti-HBe dương tính, từ rút kết luận, tiến hành định lượng HBV DNA huyết bệnh nhân, kết định lượng ©m tÝnh, cã thĨ nghÜ ®Õn bƯnh nh©n ®ang ë giai đoạn bình phục, không cần tiếp tục biện pháp điều trị mẫu huyết người lành mang bệnh, biểu bệnh bên thể mang virus, cần tiếp tục theo dõi sau sáu tháng để đánh giá diễn tiến HBV Bảng 4: Mối liên quan nồng độ HBV DNA mức trung bình với dấu ấn HBV stt M· sè coppies/ ml huyÕt Nång ®é HBsAg HBeAg Anti-HBe + - M50 1.14*10 1345.5 M22 2.59*10 1345.3 + + M9 2.10*10 1565.6 + + M68 2.79*10 1378.9 + + M16 1.84*10 943.8 + + M70 3.66*10 865.8 - - M38 1.27*10 1224.6 + + M55 1.60*10 1242.3 - - M34 2.91*10 1255.7 + + 10 M33 4.05*10 943.5 + + 11 M40 8.00*10 1345.5 + - P P P P P P P P P P P 58 12 M44 3.91*10 1345.3 + - 13 M43 3.07*10 1565.6 + - 14 M36 3.60*10 378.9 + + 15 M57 8.94*10 743.8 + 16 M28 4.48*10 865.8 - - 17 M37 1.02*10 1224.6 + - 18 M53 5.11*10 742.3 - - 19 M13 4.09*10 855.7 + 20 M39 1.07*10 943.5 21 M71 3.24*10 1345.5 22 M19 7.72*10 23 M12 24 P P P P P P P P P + - 645.3 + + - 1.09*10 865.6 + - M62 7.50*10 678.9 + + 25 M24 1.90*10 943.8 + 26 M8 1.14*10 1265.8 - + 27 M27 6.84*10 824.6 + - 28 M3 9.64*10 742.3 - + 29 M11 3.74*10 1255.7 + 30 M76 6.67*10 943.5 31 M67 7.01*10 1345.5 32 M47 2.10*10 33 M48 4.49*10 P P P P P P P P P P P P P + - 1045.3 + + + - 1565.6 + + Từ kết thực nghiệm so sánh nồng độ HBV DNA mức trung bình dấu ấn khác HBV, nhận thấy, mức này, nồng độ HBsAg có cao so với mẫu không xác định, tỉ lệ HBeAg dương tính tăng tỉ 59 lệ Anti-HBe âm tính tăng Như rút kết luận, nồng độ virut bắt đầu tăng, bệnh bắt đầu tiến triển có nguy lây nhiễm cao, đặc biệt HBeAg dương tính Khi biện pháp tốt nên có kế hoạch điều trị kịp thời tránh để chuyển sang nguy viêm gan mạn hoạt động dễ dẫn đến xơ gan ung thư gan thứ phát Bảng 5: Mối liên quan nồng độ HBV DNA mức cao víi c¸c dÊu Ên cđa HBV stt M· sè coppies/ ml Nång ®é HBsAg huyÕt HBeAg Anti-HBe + - M51 2.68*10 10045.5 M66 1.25*10 10 14345.3 + + M60 1.15*10 15565.6 + + M10 1.25*10 14378.9 + - M29 1.17*10 10 19343.8 + - M64 8.49*10 11865.8 + - M69 5.73*10 11224.6 + - M23 5.27*10 9942.3 - - M63 1.41*10 9255.7 + + 10 M45 5.21*10 9943.5 + + 11 M73 3.55*10 7345.5 12 M40 8.00*10 8345.3 + + - 13 M41 6.09*10 9565.6 + - 14 M75 1.15*10 9378.9 + - 15 M4 1.04*10 6743.8 + - P P P P P P P P P P P P P P P 60 16 M32 7.94*10 865.8 - - 17 M18 1.43*10 10 14224.6 + - 18 M59 6.16*10 13342.3 - - 19 M56 1.94*10 6855.7 + 20 M17 3.89*10 7943.5 21 M35 5.41*10 9345.5 22 M77 2.37*10 23 M78 24 25 P P P P P + - 4645.3 + + - 1.69*10 10865.6 + - M61 6.78*10 8678.9 + + M30 1.04*10 4943.8 + - P P P P P Víi kÕt qu¶ so sánh HBV DNA nồng độ cao dấu ấn khác HBV nhận thấy, nồng độ HBV DNA tăng cao, nồng độ HBsAg tăng theo tỉ lệ thuận, kèm theo tỉ lệ HBeAg dương tính chiếm đa số, âm tính anti-HBe Điều hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu TS Nguyễn Thu Thuỷ cộng sự-Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, Nồng độ vi rút yếu tố dự đoán tỉ lệ ung thư xơ gan viêm gan B vrus Bệnh nhân giai đoạn nặng bệnh, cần có biện pháp điều trị tích cực, để tránh nguy bệnh diễn tiến theo chiều hướng bất lợi 61 Kết luận Từ kết bàn luận, rút số kết luận sau; - Cặp primer probe mà thiết kế có độ nhạy cao khoảng 10 coppies/ml P P - Cặp primer thiết kế có độ đặc hiệu cao, chúng bắt cặp với DNA HBV mà không bắt cặp với chủng đối chứng - Kỹ thuật real-time PCR định lượng HBV với cặp mồi thiết kÕ cã thĨ sư dơng réng r·i thùc tÕ nghiên cứu khoa học - Nồng độ HBV DNA yếu tố quan trọng chẩn đoán điều trị bệnh viêm gan B virus, có liên quan mật thiết đến nồng độ HBsAg, tỉ lệ dương tính HBeAg AntiHBe 62 Kiến nghị Kỹ thuật real time có độ nhạy, độ đặc hiệu cao việc định lượng nồng độ virus, nhiên chưa ứng dụng phổ biến y học nghiên cứu khoa học giá thành đắt, cần có nghiên cứu để tìm điều kiện phản ứng tối ưu nhằm giảm giá thành đảm bảo độ xác phương pháp Nồng độ virus có ý nghĩa quan trọng chẩn đoán điều trị bệnh viêm gan virus để đánh giá cách chuẩn xác tiến triển bệnh, y học cần phải đánh giá thêm số dấu ấn khác Virus viêm gan B 63 TàI LIệU THAM KHảO tiếng Việt Trịnh Thị Minh Liên (2000), ý nghĩa lâm sàng tiên lượng viêm gan virút B dựa vào số thông số miễn dịch, Luận án Tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Võ Văn Huy (2000), ứng dụng kỹ thuật PCR để phát virút viêm gan B huyết người cho máu, Luận án thạc sĩ y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Vũ Bằng Đình (1985), Viêm gan virút, NXB Y học, Hà Nội Nguyễn Xuân Thành (2003), Nghiên cứu mối liªn quan cđa HBV DNA víi chØ sè men gan số dấu ấn khác virút viêm gan B bệnh nhân viêm gan B mạn hoạt động, Tạp chí y học, (3), tr.83-85 Bùi Hữu Hoàng, Đinh Dạ Lý Hương, Trần Thiện Tuấn Huy, Trần Ngọc Bảo (2000), Virút viêm gan B, NXB Đà Nẵng, TP Hồ Chí Minh Trần Thị Chính cộng (1999), Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase (PCR), Tài liệu giảng dạy sau đại học, tr.1-9 Vũ Bằng Đình (1987), Đặc điểm dịch tễ viêm gan virut qua 10 năm Viện Quân y 108 từ 1972-1981, Tạp chí Y häc ViƯt Nam, 137(2), tr.16-21 Ngun Quang Th¹ch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Phạm Thị Thu Thủy (2005), Nồng độ virus yếu tố dự đoán tử vong ung thư tế bào gan bệnh gan mạn tính viêm gan B mạn tính, Web site Dr Thu Thuỷ 64 10 Phạm Thị Thu Thủy, Hồ Tấn Đạt, Xác định kiểu gen virut viêm gan B đột biến kháng thuốc kỹ thuật giải trình tự chuỗi, Web site Dr Thu Thuỷ Tiếng Anh 11 Maimuna E Mendy, Steve Kaye, Marianne van der Sande, Pura Rayco Solon, Pauline A Waight, Deborah Shipton, Dorka Awi, Paul Snell, Hilton Whittle, Samuel J McConkey (2006), “Application of real-time PCR to quantify hepatitis B virus DNA in chronic carriers in The Gambia”, Virology Journal, 3(23); 29TU http://www.virologyj.com/ content/3/1/23 U 29T 12 M.Tevfik DORAK, MD PhD, Real-Time PCR, School of Clinical Medical Sciences, Newcastle University, U.K 13 http://www.molecular-beacons.org 14 Real-Time PCR Detection for Gene Expression Analysis, SuperArray Bioscience Corporation 15 Wendy Groffke, Quantitative PCR Update The Scientist 2003 Apr;17(8):41 16 van der Velden VH, Hochhaus A, Cazzaniga G, Szczepanski T, Gabert J, van Dongen JJ Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects Leukemia 2003 Jun;17(6):1013-34 17 Rohr UP, Wulf MA, Stahn S, Steidl U, Haas R, Kronenwett R Fast and reliable titration of recombinant adeno-associated virus type-2 using quantitative real-time PCR J Virol Methods 2002 Oct;106(1):81-8 18 Asselbergs FA, Widmer R Rapid detection of apoptosis through realtime reverse transcriptase polymerase chain reaction measurement of 65 the small cytoplasmic RNA Y1 Anal Biochem 2003 Jul 15;318(2):221-9 19 Papin JF, Vahrson W, Dittmer DP SYBR green-based real-time quantitative PCR assay for detection of West Nile Virus circumvents false-negative results due to strain variability J Clin Microbiol 2004 Apr;42(4):1511-8 20 Panicker G, Myers ML, Bej AK Rapid detection of Vibrio vulnificus in shellfish and Gulf of Mexico water by real-time PCR Appl Environ Microbiol 2004 Jan;70(1):498-507 21 Maeda H, Fujimoto C, Haruki Y, Maeda T, Kokeguchi S, Petelin M, Arai H, Tanimoto I, Nishimura F, Takashiba S Quantitative real-time PCR using TaqMan actinomycetemcomitans, and SYBR Green Porphyromonas for Actinobacillus gingivalis, Prevotella intermedia, tetQ gene and total bacteria FEMS Immunol Med Microbiol 2003 Oct 24;39(1):81-6 22 Ponchel F, Toomes C, Bransfield K, Leong FT, Douglas SH, Field SL, Bell SM, Combaret V, Puisieux A, Mighell AJ, Robinson PA, Inglehearn CF, Isaacs JD, Markham AF Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence: An alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions BMC Biotechnol 2003 Oct 13;3(1):18 23 Mikula M, Dzwonek A, Jagusztyn-Krynicka K, Ostrowski J Quantitative detection for low levels of Helicobacter pylori infection in experimentally infected mice by real-time PCR J Microbiol Methods 2003 Nov;55(2):351-9 24 Malinen E, Kassinen A, Rinttila T, Palva A Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot 66 hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria Microbiology 2003 Jan;149(Pt 1):269-77 25 Yin JL, Shackel NA, Zekry A, McGuinness PH, Richards C, Putten KV, McCaughan GW, Eris JM, Bishop GA Real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) for measurement of cytokine and growth factor mRNA expression with fluorogenic probes or SYBR Green I Immunol Cell Biol 2001 Jun;79(3):213-21 26 Schmittgen TD, Zakrajsek BA, Mills AG, Gorn V, Singer MJ, Reed MW Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods Anal Biochem 2000 Oct 15;285(2):194-204 27 Komurian-Pradel F, Paranhos-Baccala G, Sodoyer M, Chevallier P, Mandrand B, Lotteau V, Andre P Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry J Virol Methods 2001 Jun;95(1-2):1119 28 Chen, BY, Janes HW and Chen S Computer programs for PCR primer design and analysis Methods Mol Biol., 2002, 192, 19-29 29 Lee, W.M 1997 Hepatitis B virus infection N Engl J Med 337, 17331745.Chen, D.S 1993 From hepatitis to hepatoma: Lessons from type B viral hepatitis Science 262, 369-370 30 Chu, C.M and Liaw, Y.F 1997 Natural history of chronic hepatitis B virus infection: An immunopathological study J Gastroenterol Hepatol 12, S218-S222 31 Suzan D.P., Fries Edwin, Man R.A de, Osterhaus Albert D.M.E and Niesters H.G.M 2000 Development of a Quantitative Real-Time 67 Detector Assay for Hepatitis B virus DNA and Comparison with Two Commercial Assays J Clin Microbiol 38, 2897-901 32 Krajden M., Minor J., Cork L and Comanor L 1998 Multimeasurement method comparison of three commercial hepatitis B virus DNA quantification assays J Viral Hepatol 5, 415-22 33 Weinberger K.M., Wiedenmann E., Bohm S and Jilg W 2000 Sensitive and accurate quantitation of hepatitis B virus DNA using a kinetic fluorescence detection system (Taq Man PCR) J Virol Methods 85, 75-82 34 http://www biotech.uiuc.edu 35 http://www wzw.tum.de 36 Davidson College (2006), Real-Time PCR: The TaqMand Method 68 Phô lôc Danh sách bệnh nhân: TT Họ tên Tuổi Địa Ngày nghiệm Trần Mạnh Thu 38 Phố Huế 13/05/06 Nguyễn Thị Bích 35 Nam Định 13/05/06 Trần Đình Muôn 37 Hưng Yên 13/05/06 Nguyễn Hồng Đức 19 Hà Nội 15/05/06 Nguyễn Thị Hiền Vi 21 Hà Nam 13/05/06 Vũ Tiến Lợi 45 Hà Nội 15/05/06 Trần Thị Mai 31 Hà Nội 13/05/06 Hoàng Bình 36 Hà Tây 15/05/06 Nguyễn Ngọc Duy Anh 19 Hà Nội 13/05/06 10 Lê Tiến Liêm 30 Hà Nội 15/05/06 11 Trịnh Phương Dung 35 Hà Nội 13/05/06 12 Nguyễn Thị Hương Giang 27 Hà Nội 15/05/06 13 Lê Hồng Chiến 26 Hà Tây 24/05/06 14 Lê Văn Chung 24 Hà Tây 24/05/06 15 Nguyễn Văn Mai 57 Hà Nội 30/05/06 16 Phạm Minh Tuấn 30 Ninh Bình 01/06/06 17 Phạm Đăng Hường 28 Hưng Yên 01/06/06 18 Phan Ngäc H 24 B¾c Ninh 01/06/06 19 Nguyễn Thị Lan 36 Thái Nguyên 04/06/06 20 Phạm Thị Lan 58 Hà Tây 07/06/06 21 Tống Thị Lệ 45 Hà Tây 14/06/06 xét 69 22 Nguyễn Thị Loan 24 Hà Nội 24/06/06 23 Nguyễn Thị Hải 57 Thanh Hoá 30/06/06 24 Nguyễn Thị ánh 37 Hải Dương 03/07/06 25 Đào Thanh Bình 35 Phú Thọ 03/07/06 26 Nguyễn Hoàng Thái 59 Bắc Giang 03/07/06 27 Lưu Việt Hưng 29 Hà Nội 03/07/06 28 Phan Anh Việt 38 Hưng Yên 03/07/06 29 Tạ Văn Hương 50 Hải Phòng 03/07/06 30 Nguyễn Kiên Cường 27 Thanh Hoá 03/07/06 31 Nguyễn Trung Phi 19 Thái Bình 03/07/06 32 Lê Xuân Phú 45 Nam Định 03/07/06 33 Trần Huy Phúc 30 Ninh Bình 03/07/06 34 Nguyễn Văn Tình 43 Bắc Giang 03/07/06 35 Lê Xuân Phương 31 Phú Thọ 03/07/06 36 Đinh Thanh Xuân 53 Hà Tây 03/07/06 37 Nguyễn Như Nhung 56 Quảng Ninh 03/07/06 38 Nguyễn Minh Diệm 59 Hà Nội 03/07/06 39 Lê Văn Minh 36 Hà Tây 03/07/06 40 Vũ Xuân Trường 23 Hà Tây 03/07/06 41 Nguyễn Quang Vinh 46 Hà Tây 03/07/06 42 Nguyễn Văn Tâm 50 Hà Nội 03/07/06 43 Trịnh Thị Tình 52 Hà Tây 01/06/06 44 Vũ Mạnh Thắng 54 Hưng Yên 04/06/06 45 Bùi Hữu Tưởng 27 Thái Bình 07/06/06 46 Nguyễn Thanh Thắng 36 Hà Nam 14/06/06 47 Nguyễn Như Sức 60 Hà Tây 24/06/06 48 Bùi Thanh Bình 60 Hải Dương 30/06/06 70 49 Nguyễn Quang Hồng 60 Hà Tây 03/07/06 50 Chu Thị Phiến 60 Hà Nội 03/07/06 51 Mai Quang Đức 54 Thanh Hoá 03/07/06 52 Nguyễn Minh Diện 60 Ninh Bình 03/07/06 53 Phạm Văn Thái 55 Hà Tây 03/07/06 54 Nguyễn Thị San 57 Nam Định 03/07/06 55 Nguyễn Mạnh Hiền 55 Hưng Yên 01/08/06 56 Phùng Nam 39 Hải Dương 01/08/06 57 Nguyễn Thị Tú 50 Hà Nội 01/08/06 58 Nguyễn Văn Hoạt 58 Hà Tây 01/08/06 59 Ngô Thị Thu 40 Thanh Hoá 01/08/06 60 Bạch Vi Chủ 48 Nam Định 01/08/06 61 Lê Bá Huyên 41 Hà Giang 01/08/06 62 Đinh Hải Minh 56 Hà Nam 01/08/06 63 Nguyễn Hồng Sơn 32 Hà Nội 01/08/06 64 Phạm Thành Trung 45 Hải Dương 01/08/06 65 Nguyễn Thành Đô 46 Hà Tây 01/08/06 66 Phạm Thu Hương 43 Hà Nội 01/08/06 67 Đào Viết Minh 35 Hải Phòng 01/08/06 68 Trần Quang Bình 54 Hà Tây 01/08/06 .. .B? ?? GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC B? ?CH KHOA HÀ NỘI TRẦN THỊ NGUYÊN DUNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ REAL- TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG HBV DNA TRONG HUYẾT THANH B? ??NH NHÂN NHIỄM VIÊM GAN B. .. sinh học phân tử real time PCR định lượng Virut HBV DNA huyết b? ??nh nhân mắc viêm gan siêu vi B Mục đích: Đánh giá độ nhạy đặc hiệu quy trình kỹ thuật Real- time PCR định lượng virút viêm gan B huyết. .. đoán vi rút viêm gan B mức độ phân tử (Đó xét nghiệm phân tích phân tử di truyền HBV DNA) Nhờ ứng dụng kỹ thuật phân tích DNA HBV mà giải hạn chế kỹ thuật miễn dịch cò phân tích DNA giúp có sở