Thẩm định hiv aids của một số bệnh nhân ở tỉnh hòa bình bằng kỹ thuật sinh học phân tử

đại học thái nguyên Tr-ờng đại học KHOA HọC NGUYN S T THẩM ĐịNH HIV/AIDS CủA MộT Số BệNH NHÂN TỉNH HòA BìNH BằNG Kỹ THUậT SINH HọC PHÂN Tử LUN VN THC S TON HC thái nguyên - năm 2014 đại học thái nguyên Tr-ờng đại học KHOA HọC NGUYN S T THẩM ĐịNH HIV/AIDS CủA MộT Số BệNH NHÂN TỉNH HòA BìNH BằNG Kỹ THUậT SINH HäC PH¢N Tư LUẬN VĂN THẠC SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THANH HÒA Thái Nguyên, 2014 i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập hồn thành luận văn, tơi nhận giúp đỡ tận tình thầy giáo, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Trước hết tơi xin bày tỏ lịng kính trọng, biết ơn đến PGS.TS Lê Thanh Hịa tận tình hướng dẫn tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học Đại học Thái Nguyên, Khoa Khoa học sống, Phòng Đào tạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Tơi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trung tâm Phòng chống HIV/AIDS tỉnh Hồ Bình, bạn đồng nghiệp tạo điều kiện giúp đỡ thời gian làm việc thực đề tài Tôi xin cảm ơn anh chị, bạn đồng nghiệp Phòng Miễn dịch học (Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam) nhiệt tình giúp đỡ tơi thời gian thực nghiệm hồn thành luận văn Sau cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân gia đình, người bạn thân thiết tơi chia sẻ khó khăn dành cho tơi tình cảm, chăm sóc q báu q trình học tập hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên cao học Nguyễn Sĩ Tú ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi thầy giáo hƣớng dẫn Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Sĩ Tú iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nội dung nghiên cứu .2 Chƣơng - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc virus HIV .3 1.2 Dịch tễ học HIV/AIDS 1.2.1 Tình hình nhiễm HIV giới .4 1.2.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS Việt Nam .8 1.3 Phân tích chiều hƣớng lây truyền HIV nhóm quần thể 10 1.4 Tình hình nhiễm HIV khu vực tỉnh Hịa Bình 12 1.5 Cấu trúc hình thái hệ gen virus HIV 13 1.5.1 Cấu trúc hình thái 13 1.5.2 Cấu trúc hệ gen virus HIV 15 1.6 Các đƣờng lây truyền HIV .16 1.6.1 Lây truyền qua đƣờng tình dục 17 1.6.2 Lây truyền qua đƣờng máu 17 1.6.3 Lây truyền từ mẹ sang 18 1.7 Chƣơng trình phịng chống HIV/AIDS Việt Nam 18 1.8 Giám sát dịch tễ học HIV/AIDS 20 1.8.1 Nội dung giám sát HIV/AIDS .20 1.8.2 Mục tiêu giám sát HIV 21 1.9 Xét nghiệm HIV 21 1.9.1 Mục tiêu xét nghiệm HIV 21 1.9.2 Các phƣơng cách xét nghiệm .21 iv 1.9.3 Các phƣơng pháp thu thập mẫu máu 22 1.10 Chƣơng trình điều trị nghiện chất dạng thuốc phiện thuốc Methadone 22 1.11 Sự cần thiết xác định HIV/AIDS phƣơng pháp sinh học phân tử .24 Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.3 Vật liệu nghiên cứu 25 2.3.1 Mẫu nghiên cứu 25 2.3.2 Hóa chất nghiên cứu .25 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .26 2.4.1 Phƣơng pháp làm xét nghiệm ELISA Genscreen HIV1/2 nguyên lý 26 2.4.2 Phƣơng pháp làm xét nghiệm Serodia 1/2 HIV 28 2.4.3 Phƣơng pháp phân tích số liệu .28 2.5 Phƣơng pháp sinh học phân tử xác định HIV 29 2.5.1 Tách chiết ARN tổng số (genomic ARN) 29 2.5.2 Thiết kế mồi cho HIV 30 2.5.3 Thực RT-PCR .30 2.5.4 Đối chiếu so sánh xử lí số liệu 31 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .32 3.1 Kết thực trạng nhiễm HIV Hịa Bình (2009 – 2013) 32 3.2 Đặc điểm trƣờng hợp nhiễm HIV địa bàn tỉnh Hịa Bình 33 3.2.1 Phân bố tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS theo địa phƣơng nhóm tuổi 33 3.2.2 Phân bố tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS theo giới tính .35 3.2.3 Phân bố tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS theo nhóm đối tƣợng 36 3.2.4 Phân bố tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS theo đƣờng lây truyền .38 3.2.5 Phân bố tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS theo nhóm nghề nghiệp 39 3.3 Tỷ lệ nhiễm HIV số đối tƣợng có nguy giai đoạn 2009 - 201340 3.4 Một số yếu tố liên quan đến nhiễm HIV tỉnh Hịa Bình 42 3.4.1 Ƣớc tính số lƣợng nhóm có hành vi nguy cao 42 3.4.2 Hành vi nguy nhóm ngƣời NCMT 42 v 3.4.3 Các yếu tố liên quan khác 45 3.5 Thẩm định virus HIV phƣơng pháp sinh học phân tử 45 3.5.1 Thực RT-PCR, tách dòng thu nhận đoạn gen pol mẫu HIV 46 3.5.2 Kết truy cập Ngân hàng gen 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic AIDS Acquired Immunodeficiency Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc Syndrome phải ngƣời ARN Ribonucleic acid Axit ribonucleic HIV Human Immunodeficiency Virus gây suy giảm miễn dịch Virus ngƣời BN Bệnh nhân MD Mại dâm MSM Men who have sex with men Quan hệ tình dục đồng giới nam STDs Sexually Transmitted Diseases Bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục NCMT Nghiện chích ma túy NCC Nguy cao UNAIDS United Nation Progame on Chƣơng trình Phối hợp Liên HIV/AIDS Hợp Quốc HIV/AIDS UBQGPC Ủy ban Quốc gia phòng, chống QHTD Quan hệ tình dục VAAC Vietnam Administration for Cục Phịng, chống HIV/AIDS Việt HIV/AIDS Control Nam Viện Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng VSDTTW WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Lũy tích nhiễm HIV từ 2009-2013 32 Bảng 3.2 Nhiễm HIV theo địa phƣơng độ tuổi (2009-2013) 34 Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm HIV theo giới tính (2009-2013) 35 Bảng 3.4 Tỷ lệ % nhiễm HIV theo giới tính từ năm 2009-2013 .37 Bảng 3.5 Các trƣờng hợp nhiễm HIV theo đƣờng lây truyền từ năm 2009-2013 38 Bảng 3.6 Các trƣờng hợp nhiễm HIV theo nghề nghiệp 2009-2013 .39 Bảng 3.7 Kết giám sát trọng điểm HIV giai đoạn 2009 - 2013 41 Bảng 3.8 Kết truy cập Ngân hàng gen chuỗi gen pol sử dụng chƣơng trình BLAST NCB 49 Bảng 3.9 Tỷ lệ (%) tƣơng đồng thành phần nucleotide gen pol chủng nghiên cứu so sánh với số chủng virus HIV-1 Việt Nam giới .53 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1A: Virus HIV nhìn dƣới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 13 Hình 1.1B: Mơ hình cấu trúc virus HIV 13 Hình 1.2: Mơ hình cấu trúc hệ gen gen HIV-1 15 Hình 2.2 Minh họa cấu trúc hệ gen HIV vị trí gen pol để thực RT-PCR thu nhận đoạn gen pol cặp mồi HIVF – HIVR (~170 nucleotide) 30 Hình 3.1 Số nhiễm HIV phát từ 2009-2013 32 Hình 3.2 Phân bố nhiễm HIV theo nhóm tuổi (2009-2013) 35 Hình 3.3 Phân bố trƣờng hợp nhiễm HIV theo giới từ năm 2009-2013 36 Hình 3.4 Tỷ lệ % nhiễm HIV theo giới tính từ năm 2009-2013 36 Hình 3.5 Tỷ lệ nhiễm HIV theo đối tƣợng (2009-2013) 37 Hình 3.6 Tỷ lệ nhiễm HIV theo đƣờng lây truyền từ năm 2009-2013 38 Hình 3.7 Tỷ lệ % nhiễm HIV theo nghề nghiệp 2009-2013 40 Hình 3.8 Xu hƣớng nhiễm HIV nhóm có nguy cao từ năm 2009-2013 41 Hình 3.9 Mức độ quan hệ với bạn nghiện đối tƣợng sử NCMT .42 Hình 3.10 Hình thức sử dụng ma tuý đối tƣợng NCMT 43 Hình 3.11 Tỷ lệ sử dụng lại bơm kim tiêm ngƣời khác 43 Hình 3.12 Phƣơng pháp làm bơm kim tiêm .44 Hình 3.13 Hành vi sử dụng bao cao su đối tƣợng tiêm chích ma túy .44 Hình 3.14: Điện di kiểm tra ARN tổng số virus HIV thạch agarose 1% .46 Hình 3.15: Sản phẩm RT-PCR virus HIV kiểm tra thạch agarose 1% .47 Hình 3.16: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm ADN tái tổ hợp gen pol virus HIV vector tách dòng 48 Hình 3.17 So sánh trình tự chuỗi nucleotide gen pol chủng (HIV-T1; HIV-T2; HIV-T3; HIV-T4; HIV-T5; HIV-T6; HIV-T7; HIV-T8) với chủng virus HIV-1 Việt Nam giới 52 46 3.5.1 Thực RT-PCR, tách dòng thu nhận đoạn gen pol mẫu HIV Tiến hành tách ARN tổng số, thực RT-PCR, tách dòng thu nhận đoạn gen pol mẫu HIV ARN tổng số đƣợc tách kit QiAmp viral mini kit (hãng Qiagen theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Kiểm tra ARN tổng số điện di gel agarose 1% Sử dụng kit RT–PCR bƣớc (one-step RT–PCR Kit) hãng QIAGEN (Mỹ) Thành phần phản ứng RT–PCR thực với khn có chứa ARN HIV, đƣợc hỗn hợp ống nghiệm PCR (ống plastic chịu nhiệt, có dung tích 0,2 ul), bao gồm dung môi phản ứng, mồi xuôi, mồi ngƣợc, enzyme chép ngƣợc, nƣớc khn, tổng dung tích 25 ul Chƣơng trình cho chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR, bao gồm: Bƣớc 1: 450C phút: chu kỳ Bƣớc 2: 950C 10 phút: chu kỳ - Các bƣớc 3, 4, đƣợc thực lặp lặp lại 35 chu kỳ: Bƣớc 3: 940C 20 giây Bƣớc 4: 550C 20 giây Bƣớc 5: 720C 40 giây Bƣớc 6: 720C phút: chu kỳ Bảo quản sản phẩm nhiệt độ lạnh 40C kiểm tra sản phẩm Hình 3.14: Điện di kiểm tra ARN tổng số virus HIV thạch agarose 1% 47 M: thị phân tử marker Lamda cắt Hind III 1.ARN tổng số HIVT1; ARN tổng số HIVT2; ARN tổng số HIVT3; ARN tổng số HIVT4; ARN tổng số HIVT5; ARN tổng số HIVT6;7 ARN tổng số HIVT7; ARN tổng số HIVT8 Hình 3.15: Sản phẩm RT-PCR virus HIV kiểm tra thạch agarose 1% M: thị phân tử marker Lamda cắt Hind III M2: thị phân tử marker kb (-): Mẫu đối chứng âm.1 Sản phẩm RT-PCR HIVT1; Sản phẩm RT-PCR HIVT2; Sản phẩm RT-PCR HIVT3; Sản phẩm RT-PCR HIVT4; Sản phẩm RT-PCR HIVT5; Sản phẩm RT-PCR HIVT6; Sản phẩm RT-PCR HIVT7; Sản phẩm RT-PCR HIVT8 Từ nguồn khuôn ARN tách chiết, thu nhận đƣợc sản phẩm RTPCR có độ dài khoảng 170 bp (Hình 3.15) Trên hình ảnh điện di cho thấy, sản phẩm RT-PCR cho băng có độ dài tƣơng ứng với dự kiến (~ 170 bp) Sản phẩm RT-PCR đƣợc tinh kit Qiaqiuck (Qiagen) gắn vào vector tách dòng pCR2.1 tiến hành tách tái tổ hợp, thu đƣợc clone có khả chứa đoạn gen pol có độ dài khoảng 170 bp, chọn lọc để giải trình trình tự (Hình 3.16) Trên hình ảnh điện di cho thấy: - Mẫu HIVT1 HIVT2 HIVT3 tất clone (cl1, cl2, cl3) có độ dài khoảng 170 bp - Mẫu HIVT4 có clone có khả chứa gen pol (cl2, cl3, cl4) vector; - Mẫu HIVT5 có clone (cl3) mẫu HIVT6 có clone (cl1); - Mẫu HIVT7 có clone (cl1 cl3) có khả mang tái tổ hợp gen pol - Mẫu HIVT8 clone có khả chứa gen pol (cl1, cl2, cl3) 48 Hình 3.16: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm ADN tái tổ hợp gen pol virus HIV vector tách dòng M: thị phân tử marker Lamda cắt Hind III Các sản phẩm ADN tái tổ hợp gen pol: (A) HIVT1 + HIVT2; (B) HIVT3; (C) HIVT4; (D) HIVT5 + HIVT6; (E) HIVT7; (F) HIVT8, clone có độ dài tƣơng ứng gen pol (~170 bp) đƣợc đánh dấu mũi tên (→) Vector pCR 2.1 có độ dài 3,9 kb 49 Nhƣ vậy, gen pol mẫu HIV nghiên cứu đƣợc thu nhận tách dịng thành cơng để tiến hành giải trình trình tự Sau giải trình trình tự, chúng tơi thu đƣợc chuỗi nucleotide gen pol có kích thƣớc khoảng 170 bp, chuỗi sử dụng đƣa vào Blast để thu nhận chuỗi đăng ký Ngân hàng gen (Genbank), đối chiếu xác định với chuỗi khác giới (Bảng 8) 3.5.2 Kết truy cập Ngân hàng gen Chuỗi nucleotide đoạn gen ARN-polymerase (pol) có kích thƣớc 170 bp virus HIV sau giải trình tự đƣợc dùng làm chuỗi truy cập chƣơng trình Blast Ngân hàng gen nhằm tìm kiếm chuỗi đích đƣợc đăng ký Ngân hàng gen dựa vào mức độ tƣơng ứng nucleotide Kết truy cập đƣợc trình bày Bảng Hầu hết chủng HIV tƣơng đồng có nguồn gốc Châu Á: Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông, Thái Lan, Đài Loan… Qua kết truy cập nhận thấy, chủng HIV lƣu hành vùng Nam Á Đông Nam Á có chung nguồn gốc Bảng 3.8 Kết truy cập Ngân hàng gen chuỗi gen pol sử dụng chƣơng trình BLAST NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Điểm Tổng Mức Số đăng ký Tƣơng đồng truy cập tối số độ so đa điểm sánh AY238114.1 AY238108.1 AY238094.1 AY238086.1 HIV-1 isolate vr82 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate vr100 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate vr186 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate vr124 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds Mức Hệ độ số tƣơng đồng 315 315 100% 5e-83 100 315 315 100% 5e-83 100 315 315 100% 5e-83 99 315 315 100% 5e-83 99 50 AY238060.1 AY238058.1 AY238052.1 AY238050.1 AY238049.1 AY238011.1 AY238003.1 AY237999.1 AY237982.1 AY237975.1 AF368824.1 DQ130722.1 AF283704.1 AY008714.1 HIV-1 isolate vr156 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate vr153 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate vr146 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate vr142 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate vr140 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate vr55 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate vr48 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate vr43 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate vr37 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate vr26 from Viet Nam reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 98THMZ44 from Thailand reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate G743 from Thailand reverse transcriptase (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate 98THMC46 from Thailand (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate 97CNGX-2F from China, complete genome 315 315 100% 5e-83 99 315 315 100% 5e-83 98 315 315 100% 5e-83 98 315 315 100% 5e-83 98 315 315 100% 5e-83 98 315 315 100% 5e-83 98 315 315 100% 5e-83 98 315 315 100% 5e-83 98 315 315 100% 5e-83 98 315 315 100% 5e-83 97 315 315 100% 5e-83 96 315 315 100% 5e-83 96 315 315 100% 5e-83 96 315 315 100% 5e-83 96 51 AF009388.1 DQ831439.1 JQ312345 JQ312361 HIV-1 isolate 92TH018 from Thailand, pol polyprotein (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate Ca8W6R from Cambodia (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate 08IVVI0128 from Viet Nam pol protein (pol) gene, partial cds HIV-1 isolate 08IVVI0199 from Viet Nam pol protein (pol) gene, partial cds 315 315 100% 5e-83 96 313 313 100% 2e-82 95 315 315 100% 315 315 100% 1e82 1e82 3.5.3 Phân tích so sánh tương đồng HIV Việt Nam giới So sánh thành phần nucleotide đoạn gen pol nghiên cứu với chủng giới Trên sở liệu chủng nghiên cứu so với chủng virus đƣợc chọn lựa, dựa vào trình tự nucleotide trình tự acid amin đƣợc mã hóa gen nghiên cứu, xác định type HIV, phân tích, khảo sát sơ đồ phả hệ chủng virus HIV cập nhật với chủng Việt Nam giới Bằng phƣơng pháp truy cập Ngân hàng gen địa chỉ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, thu nhận đƣợc chuỗi cần thiết để so sánh (Bảng 8) phân tích mức độ tƣơng đồng chủng Kết so sánh đối chiếu chuỗi nucleotide đƣợc trình bày Hình 3.17 Khi so sánh thành phần nucleotide gen pol chủng nghiên cứu với chủng HIV giới Việt Nam, có số vị trí sai khác chủ yếu (vị trí 10, 22, 54, 109), bên cạnh cịn có vài sai khác điểm chuỗi gen pol Điều cho thấy chủng HIV-1 vùng địa lý gần gũi (Nam Đông Nam Á) có biến đổi khác thành phần nucleotide (Hình 3.17) 95 95 52 * 20 * 40 * 60 HIV-T1 HIV-T2 HIV-T3 HIV-T4 HIV-T5 HIV-T6 HIV-T7 HIV-T8 HIV-1-08IV HIV-1-09.V HIV-1-09.V HIV-1-1244 HIV-1-1246 HIV-1-1355 HIV-1-VN-A HIV-1375-0 HIV-pol-KC : : : : : : : : : : : : : : : : : ACCAGGAATCAGATATCAGTATAATGTGCTGCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATT G A C A C .T .C T G .T .C A C C A .G .G C C G C C .T C C A .G T C G T C : : : : : : : : : : : : : : : : : 63 63 63 63 63 63 63 63 63 63 63 63 63 63 63 63 63 HIV-T1 HIV-T2 HIV-T3 HIV-T4 HIV-T5 HIV-T6 HIV-T7 HIV-T8 HIV-1-08IV HIV-1-09.V HIV-1-09.V HIV-1-1244 HIV-1-1246 HIV-1-1355 HIV-1-VN-A HIV-1375-0 HIV-pol-KC : : : : : : : : : : : : : : : : : * 80 * 100 * 120 CCAGTGTAGCATGACAAAAATCTTAGAGCCCTTTAGAATAAAAAATCCAGAAATAGTTATCTA T .T .G A G A T A C C C C .C G C G .G .T .G .C G M G .G G GC GG : : : : : : : : : : : : : : : : : 126 126 126 126 126 126 126 126 126 126 126 126 126 126 126 126 126 HIV-T1 HIV-T2 HIV-T3 HIV-T4 HIV-T5 HIV-T6 HIV-T7 HIV-T8 HIV-1-08IV HIV-1-09.V HIV-1-09.V HIV-1-1244 HIV-1-1246 HIV-1-1355 HIV-1-VN-A HIV-1375-0 HIV-pol-KC : : : : : : : : : : : : : : : : : * 140 * 160 * TCAATACATGGATGACTTGTATGTAGGATCTGATTTAGAAATAG R C G.A R R G : : : : : : : : : : : : : : : : : 170 170 170 170 170 170 170 170 170 170 170 170 170 170 170 170 170 Hình 3.17 So sánh trình tự chuỗi nucleotide gen pol chủng (HIV-T1; HIV-T2; HIV-T3; HIV-T4; HIV-T5; HIV-T6; HIV-T7; HIV-T8) với chủng virus HIV-1 Việt Nam giới Ghi chú: dấu (.): biểu thị trình tự giống gen pol); sai khác nucleotide chủng khác so với chủng Việt Nam thể chữ ký hiệu chúng 53 Bảng 3.9 Tỷ lệ (%) tƣơng đồng thành phần nucleotide gen pol chủng nghiên cứu so sánh với số chủng virus HIV-1 Việt Nam giới NC AA 10 11 12 13 14 15 16 17 99 98 98 98 97 97 97 100 97 97 97 97 97 96 94 94 97 98 97 98 98 97 99 97 97 96 97 97 95 94 94 97 96 95 95 99 98 95 95 95 95 95 94 92 92 97 96 96 96 98 96 96 95 97 95 95 93 92 95 95 95 98 95 95 95 95 95 94 92 92 98 95 97 95 95 94 95 95 94 92 92 95 97 95 95 94 95 95 94 92 92 97 95 95 94 95 94 94 92 92 97 97 97 97 97 96 94 94 10 97 98 97 95 98 94 92 11 97 97 95 96 93 93 12 97 95 97 94 92 13 97 96 94 92 14 94 95 94 15 93 92 16 92 17 Ghi chú: HIV-T1; HIV-T2; HIV-T3; HIV-T4; HIV-T5; HIV-T6; HIVT7; HIV-T8; HIV-1-08IVVI0199 (số đăng ký Ngân hàng gen: JQ312361); 10 HIV1-09.VL968Hs (số đăng ký:HQ852902); 11 HIV-1-09.VL987 (số đăng ký: HQ852915); 12 HIV-1-1244-0810 (số đăng ký: KC841222); 13 HIV-1-1246-0512 (số đăng ký: KC841228); 14 HIV-1-1355-0312(số đăng ký: KC841240); 15 HIV-1-VN (số đăng ký: AB519630); 16 HIV-1375-0711 (số đăng ký: KC841243; 17 HIV-pol (KC841244) Khi so sánh mức độ tƣơng đồng chủng, nhận thấy, chủng HIV nghiên cứu có mức độ tƣơng đồng 99-100% với chủng số (HIV1-08IVVI0199 (số đăng ký Ngân hàng gen: JQ312361) Việt Nam) Mức độ tƣơng đồng thấp (92-93%) số chủng (16 HIV-1375-0711 (số đăng ký: 54 KC841243; 17 HIV-pol(số đăng ký: KC841244) (Bảng 9) Trong số 17 chủng so sánh, rõ ràng có dịng HIV-1 có mức độ tƣơng đồng gen pol khác Đối với HIV mẫu bệnh phẩm thu nhận Hịa Bình, cặp mồi HIVF-HIVR cho sản phẩm RT-PCR có độ dài 170 bp, có độ đồng cao với chủng HIV-1 Việt Nam công bố Ngân hàng gen Qua so sánh thành phần chuỗi nucleotide cho thấy, tính đặc hiệu phản ứng RT-PCR đƣợc kiểm nghiệm phƣơng pháp giải trình trình tự phân tích đoạn gen cặp mồi đặc hiệu loại để khẳng định xác loại virus đối tƣợng cần chẩn đốn, điều tạo điều kiện xây dựng kit chẩn đoán đa phân tử tƣơng lai Việt Nam 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KIẾN NGHỊ - Do đặc điểm dịch HIV/AIDS Hịa Bình nhƣ yếu tố liên quan tới dịch, cần triển khai mạnh mẽ chƣơng trình can thiệp giảm hại dự phòng lây nhiễm HIV Trƣớc mắt nên tập trung vào nhóm đối tƣợng nghiện chích ma túy, gái mại dâm thông qua hoạt động cụ thể nhƣ giáo dục đồng đẳng/tiếp cận cộng đồng, triển khai chƣơng trình phân phát/trao đổi hay tiếp thị xã hội bơm kim tiêm, bao cao su Trong tƣơng lai cần huy động nguồn lực để triển khai chƣơng trình điều trị thay nghiện chất dạng thuốc phiện Methadone - Cần tăng cƣờng dịch vụ tƣ vấn, chăm sóc HIV/AIDS, tƣ vấn xét nghiệm HIV tự nguyện; cần theo dõi, đánh giá chƣơng trình có Giám sát trọng điểm đề cốt lõi; Đẩy mạnh hoạt động tuyên truyền HIV/AIDS, Tiếp cận điều trị HIV/AIDS thuốc kháng virus đặc hiệu (ARV) thơng qua Phịng khám ngoại trú mơ hình để triển khai thiết kế, chƣơng trình, dự án phịng, chống HIV/AIDS cách đồng bộ, có hiệu toàn diện - Cần áp dụng triển khai ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR chẩn đoán bội nhiễm virus HIV-1 loại virus khác: virus viêm gan C (Hepatitis C virus- HCV) hay HGV để xây dựng kit chẩn đoán đa (Multi-plex PCR – PCR đa mồi) KẾT LUẬN Tỷ lệ nhiễm HIV Hịa Bình tăng dần qua năm Dịch HIV/AIDS diễn biến ổn định, khơng có đột biến số lƣợng nhiễm HIV có xu hƣớng tăng chậm lại Xác định xác đối tƣợng ngƣời bệnh nhiễm virus HIV Hịa Bình thuộc HIV-1 (type 1) phƣơng pháp sinh học phân tử, từ kết cho phép sử dụng đoạn gen pol có kích thƣớc 170 nucleotide chẩn đốn 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phạm Nhật An (1995), “Nhiễm HIV/AIDS y học sở, lâm sàng phòng chống”, Nhà xuất Y học, Hà Nội, 26-51 Bộ Y tế (2009), “Ƣớc tính dự báo nhiễm HIV/AIDS Việt Nam năm 2007-2012” Bộ Y tế (2014), “Báo cáo Tổng kết cơng tác phịng, chống HIV/AIDS năm 2013 định hƣớng kế hoạch năm 2014” ngày 06 tháng 01 năm 2014 Cục Phòng, chống HIV/AIDS Việt Nam - Bộ Y tế (2009), “ Báo cáo kết nghiên cứu, đánh giá đáp ứng nhanh tình hình sử dụng ma túy, HIV/AIDS hoạt động phối hợp liên ngành công tác can thiệp giảm tác hại tỉnh Hịa Bình”, Hà Nội Cục Phòng, chống HIV/AIDS Việt Nam - Bộ Y tế (2010), “Báo cáo cơng tác Phịng, chống HIV/AIDS năm 2009”, Hà Nội Nguyễn Ý Đức (2009), “Hiện trạng bệnh HIV/AIDS, Hoa Kỳ”, Y Dược Ngày Nay, 23-26 Phan Trọng Hồng, Ngơ Văn Trƣờng, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà (2007), “Tách dịng biểu gen mã hóa tiểu đơn vị p66 enzyme phiên mã ngƣợc virus HIV-1”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (5), tr:463470 Nguyễn Duy Hƣng (2010), "Giám sát số bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục gắn kết với giám sát HIV số đối tƣợng dân cƣ tỉnh/ thành phố Việt Nam", Da liễu học Việt nam, 2, tr:39-45 Nguyễn Thị Hồng Loan, Hồ Xuân Hùng, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2010), “Nhân dòng bƣớc đầu biểu gen mã hóa protease HIV type phân lập Việt Nam”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(2), tr:227-233 10 Trần Chí Liêm (11-2001), “Xét nghiệm chẩn đoán HIV”, Hà nội, tr:4-28 11 Phạm Thị Minh Phƣơng (2013), “Tình trạng nhiễm HIV, nhiễm trùng lây qua đƣờng tình dục phụ nữ bán dâm quận Hà Nội hiệu số biện pháp can thiệp”, Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Dịch tễ học 57 12 Nguyễn Minh Quang Ngơ Văn Tồn, Đỗ Hịa Bình (2012), "Một số hành vi nguy nhiễm trùng đƣờng sinh dục dƣới phụ nữ bán dâm vào Trung tâm Giáo dục lao động xã hội thành phố Hà nội năm 2010", Tạp chí Y học dự phịng, 6(133), tr:64-73 13 Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, Vũ Thị Hiền, Hà Thị Thu, Nguyễn Thị Hoa, Lê Phƣơng Hằng, Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Xuân Bắc, Đồng Văn Quyền, Lê Văn Phủng, Đinh Duy Kháng (2011), “Biểu protein GP41 virus HIV phân type CRF01_AE E coli ứng dụng để phát kháng thể kháng HIV huyết bệnh nhân Western blot ELISA”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 9, tr:29-36 14 Đồng Văn Quyền, Hoàng Anh, Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thanh Tùng, Lê Thị Tâm, Đinh Duy Kháng (2008), “ Tách dòng biểu gen p24 từ chủng HIV lƣu hành Việt Nam nghiên cứu phản ứng protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV huyết bệnh nhân”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học 6(1), tr:27-34 15 Phạm Song (2006), HIV/AIDS tổng hợp, cập nhật, đại Nhà xuất Y học, Hà Nội 16 Đoàn Thị Thu Dƣơng Thị Hƣơng (2013), "Giám sát trọng điểm HIV Hải Phòng", Y học dự phòng, 3(139), tr:61-65 17 Trung tâm phòng, chống HIV/AIDS tỉnh Hòa Bình (2010), Kế hoạch hoạt động phịng, chống HIV/AIDS tỉnh Hịa Bình năm 2005; 2006; 2007; 2008; 2009, Hịa Bình 18 Ủy ban AIDS Châu Á (2008), Nhận định lại tình hình AIDS Châu Á - Phác thảo cách ứng phó hiệu quả, Thái Lan 19 Uỷ ban Quốc gia phòng chống AIDS phòng chống tệ nạn ma túy mại dâm (2004), “Chiến lược quốc gia phòng chống HIV/AIDS nam đến năm 2010 tầm nhìn 2020”, Nhà xuất y học, Hà Nội 20 Uỷ ban quốc gia phòng chống AIDS phòng chống tệ nạn ma túy mại dâm (2013) “Báo cáo tiến độ phòng chống AIDS Việt nam năm 2012”, Hà Nội 58 21 Uỷ ban Quốc gia phòng chống AIDS phòng chống tệ nạn ma tuý mại dâm (2004) “ Chiến lƣợc quốc gia phòng chống HIV/AIDS Việt Nam đến năm 2010 tầm nhìn 2020”, Nhà xuất Y học, Hà Nội 22 Trung tâm phịng, chống HIV/AIDS tỉnh Hịa Bình (2010), “Báo cáo kết Hoạt động phịng, chống HIV/AIDS tỉnh Hịa Bình năm 2009”, Hịa Bình 23 Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ƣơng - Bộ Y tế (2001), Xét nghiệm HIV, Hà Nội Tiếng Anh 24 Abdul A.W and Eric O.F., (2010), “ The Role of Lipids in Retrovirus Replication”, Viruses, Review, 2:1146-1180 25 Barre-Sonoussi F., Ross A.L., Delfraissy J.F., (2013), “Past, present and future: 30 years of HIV research” Nat Rev Microbiol 211(12):877-883 26 Canto C.L.M., Segurado A.C., Pannut C et al (2006) Detection of HIV and HCV ARN in semen from Brazilian co-infected men using multiplex PCR before and after semen washing Rev Inst Med trop S Paulo, 48(4):201206 27 Caudai C., Padula M.G., Bettini V., Valensin P.E (1998) “Detection of HCV and GBV-C/HGV infection by multiplex PCR in plasma samples of transfused subjects” J Virol Methods 70:79–83 28 Chang, S.Y., Sheng, W.H., Lee, C.N., Sun, H.Y., Kao, C.L., Chang, S.F., Liu, W.C., Yang, J.Y., Wong, W.W., Hung, C.C and Chang, S.C (2006) “Molecular Epidemiology of HIV Type subtypes in Taiwan: Outbreak of HIV type CRF07)BC infection in intravenous drug users” AIDS Res Hum Retroviruses 22(11): 1055-1066 29 Clavel F., Guétard D., Brun-Vézinet F., Chamaret S., Rey M.A., SantosFerreira M.O., Laurent A.G., Dauguet C., Katlama C., Rouzioux C., (1986), “Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS” Science 18;233(4761): 343-346 30 De Cock K.M., (2001), “Epidemiology and the emergence of human immunodeficiency virus and acquired immune deficiency syndrome” Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 29:356(1410):795-798 59 31 Fischl M.A., Richman D.D., Grieco M.H., 1987 “The efficacy of azidothymidine (AZT) in the treatment of patients with AIDS and AIDSrelated complex” A double-blind, Plazebo-controlled trial N Engl J Med; 317:185-191 32 Gao F., Bailes E., Robertson D.L., (1999), “Origin of HIV-1 in the chimpanzee Pan troglodytes troglodytes" Nature, 397 (6718): 436–441 33 Goldsby R.A., Kindt T.J., Osborne B.A., (2000), “AIDS and other immunodefi-ciences”, Kuby immulogy 4thed New York: WH Freeman and Company: 467-496 34 Gottlieb M.S., (2006), “Pneumocystis pneumonia-Los Angeles” Am J Public Health, 96(6):980-983 35 Hu D.J., Dondero T.J., Rayfield M.A., George I.R., Schochetman G., Jaffe H.W., Luo C.C., Kalish M.L., Weniger BG., Pau C.P., Schable C.A., Curran J.W (1996), “The emerging genetic diversity of HIV The importance of global surveillance for diagnostics, research and prevention” JAMA 275:210-216 36 Ishizaki A., Cuong N H., Thuc P.V., Trung N.V., Saijoh K., Kageyama S., Ishigaki K., Tanuma J., Oka S., Ichimura H (2009), “Profile of HIV type infection and genotypic resistance mutations to antiretroviral drugs in treatment-naive HIV type 1-infected individuals in Hai Phong, Viet Nam”, AIDS Res Hum Retrovir, 25:175-182 37 Kato K., Kusagawa S., Motomura K., Yang R., Shiino T., Nohtomi K., Sato H., Shibamura K., Nguyen T.H., Pham K.C., Pham H.T., Duong C.T., Nguyen C.Q., Bui D.T., Hoang T.L., Nagal Y and Takebe Y (2001), "Closely related HIV-1 CRF01_AE variant among injecting drug users in northern Vietnam: evidence of HIV spread across the Vietnam–China border" AIDS Res Hum Retroviruses 17:113–123 38 Liao H., Tee K.K., Hase S., Uenishi R., Li X.Z., Kusagawa S., Pham H.T., Pybus O.G., Takebe Y (2009), "Phylodynamic analysis of the dissemination of HIV-1 CRF01_AE in Vietnam", Virology 391:51-56 60 39 Ly T.D., Laperche S., Courouce A.M (2001), “Early detection of human immunodeficiency virus infection using third and fourth generation screening assays” Eur J Clin Microbiol Infect Dis 20:104-110 40 Nguyen T.H.L., Recordon-Pinson P., Pham V.H., Nguyen T.V.U., Truong T.X.L., Huynh T.T., Garrigue I., Schrive M.H., Pellegrin I., Lafon M.E., Aboulker J.P., Barre'-Sinoussi F and Fleury H.J (2003), "HIV type isolates from 200 untreated individuals in Ho Chi Minh City (Vietnam): ANRS 1257 study Large predominance of CRF01_AE and presence of major resistance mutations to antiretroviral drugs", AIDS Res Hum 41 Phan T.T.C., Ishizaki A., Phung D.C., Bi X., Oka S and Ichimura H (2010), "Characterization of HIV type genotypes and drug resistance mutations among drug- 27 naive HIV type 1-infected patients in Northern Vietnam", AIDS Res Hum Retroviruses 42 Rose J.R., Saltol R and Craik C.S (1993), "Regulation of Autoproteolysis of the HIV-1 and HIV-2 proteases with engineered amino acid substitutions", J Biol Chem 268: 11939-11945 43 Tan Y.L., Lim S.G., Hong W., (2006), “Understanding human immunodeficiency virus type1 and hepatitis C virus coinfection” Curr HIV Res, 4(1):21-30 44 WHO (2007), “Everybody business : strengthening health systems to improve health outcomes : WHO’s framework for action.” Geneva: WHO 45 WHO (2009) "HIV/AIDS programme hightlights 2008-2009" 46 UNAIDS (2010), Getting to zero: 2011-2015 strategy, Geneva, UNAIDS 47 WHO, Global health sector strategy on HIV/AIDS (2011-2015) ...đại học thái nguyên Tr-ờng đại học KHOA HọC NGUYN S T THẩM ĐịNH HIV/ AIDS CủA MộT Số BệNH NHÂN TỉNH HòA BìNH BằNG Kỹ THUậT SINH HọC PHÂN Tư LUẬN VĂN THẠC SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chun ngành:... HIV/ AIDS tỉnh Hịa Bình Chúng tơi tiến hành đề tài: Thẩm định HIV/ AIDS số bệnh nhân tỉnh Hịa Bình kỹ thuật sinh học phân tử Mục tiêu nội dung nghiên cứu Các mục tiêu nghiên cứu Xác định loại HIV/ AIDS. .. Thu thập đánh giá số lƣợng ngƣời nhiễm HIV/ AIDS tỉnh Hịa Bình từ năm 2009 – 2013 - Sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử thẩm định virus HIV số bệnh nhân nhiễm HIV/ AIDS tỉnh Hịa Bình 3 Chƣơng -