Nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza từ nấm mốc a niger

Bộ giáo dục đào tạo Trường đại học bách khoa hà nội - - Luận văn thạc sĩ khoa học Ngành: Công nghệ sinh học Nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza từ nấm mốc A niger Lê thiên minh hà nội, 2006 Bộ giáo dục đào tạo Trường đại học bách khoa hà nội - ♣ - Luận văn thạc sĩ khoa học Nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza từ nấm mốc A niger Ngành: Công nghệ sinh học Mà Số: Lê thiên minh Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thuỳ Châu hà nội, 2006 Mục lục Đặt vấn đề Ch­¬ng Tỉng quan vỊ phytaza 1.1 Những nghiên cứu axit phytic 1.1.1 Chức sinh lý cña axit phytic 1.1.2 HiƯu øng kh¸ng dinh d­ìng cđa axit phytic 1.1.3 Nguån gốc phân bố axit phytic tự nhiên 1.2 Những nghiên cứu phytaza 10 1.2.1.Kh¸i niƯm vỊ phytaza 10 1.2.2 Phân loại phytaza 11 1.2.3 Đặc điểm cấu tạo tính chất phytaza 11 1.2.3.1 Đặc điểm cấu tạo cña phytaza 11 1.2.3.2 TÝnh chÊt cña phytaza 13 1.2.4 Nguồn nguyên liệu để thu phytaza 17 1.2.4.1 Phytaza tõ nguån thùc vËt 17 1.2.4.2 Phytaza tõ nguån ®éng vËt 17 1.2.5 C¸c yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp phytaza 21 1.2.5.1 Các nhân tố vật lý 21 1.2.5.2 ¶nh h­ëng cđa c¸c u tè dinh d­ìng 23 1.2.5.3 ảnh hưởng chất hoạt ®éng bỊ mỈt 25 1.2.6 Thu hồi tạo chế phẩm phytaza 26 1.2.7 øng dơng cđa phytaza 28 1.2.7.1 øng dơng n«ng nghiƯp 29 1.2.7.2 øng dơng c«ng nghiƯp sản xuất giấy 30 1.2.7.3 Điều chÕ c¸c dÉn xt myo-inositol phosphate øng dơng y häc 30 1.3 Gen phyA vµ mét sè gen kh¸c m· hãa cho phytaza tõ vi sinh vËt 31 1.3.1 Gen phyA m· hãa cho phytaza cña Aspergillus 31 1.3.2 Mét sè gen kh¸c m· hãa cho phytaza tù nhiªn 32 1.3.2.1 Gen phyC m· hãa phytaza cña Bacillus 32 1.3.2.2 Gen m· hãa phytaza cña E.coli 33 1.3.2.3 Gen m· hãa phytaza cña nÊm men 33 Chương Vật liệu Phương pháp .34 2.1 VËt liÖu 34 2.1.1 Địa điểm đối tượng nghiên cứu 34 2.1.2 Ho¸ chÊt 34 2.1.3 M«i tr­êng 36 2.1.3.1 M«i tr­êng tun chän c¸c chđng A niger sinh phytaza cao 36 2.1.3.2 Môi trường lên men sinh tổng hợp phytaza 36 2.1.3.3 Môi trường dùng cho kü tht sinh häc ph©n tư 37 2.1.4 ThiÕt bÞ 37 2.2 Phương pháp nghiên cøu 37 2.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ phytaza 37 2.2.1.1 Hoá chất dung dÞch enzym 38 2.2.1.2 Cách tiến hành 40 2.2.2 Phương pháp lên men chìm sục khí qui mô 100 lít/mẻ cho sản xuất phytaza 41 2.2.2.1 Quá trình khử trùng toàn bé hƯ thèng lªn men 41 2.2.2.2 Quá trình điều chế môi trường quy mô 100 lít/mẻ 41 2.2.2.3 Quá trình tiếp giống 42 2.2.2.4 §iỊu khiển oxy hòa tan, nhiệt độ pH trình lên men 42 2.2.3 Nghiªn cøu thu håi enzym b»ng muèi trung tÝnh ((NH ) SO ) 42 R R R R R R 2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein 43 2.2.5 Nghiªn cøu ảnh hưởng pH lên đặc tính enzym 43 2.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên đặc tính enzym 44 2.3.7 Tách dòng đọc trình tự gen PhyA từ chủng A niger b»ng kü thuËt PCR 44 3.7.1 T¸ch chiÕt DNA hƯ gen cđa nÊm mèc 44 2.2.7.2 Định lượng DNA quang phæ kÕ 45 2.2.7.3 §iƯn di kiĨm tra DNA hƯ gen trªn gel agaroza 1% 46 2.2.7.4 Kỹ thuật PCR nhân gen phyA 47 2.2.7.5 Phản ứng nối ghép gen (tạo dòng đoạn DNA đặc hiƯu cđa gen phyA) 48 2.2.7.6 BiÕn nạp sản phẩm ghép gen (plasmid tái tổ hợp) sèc nhiƯt vµo E coli IVNαF’ 49 2.2.7.7 T¸ch chiÕt DNA plasmid tõ E coli IVNαF’ 50 2.2.7.8 Xư lý DNA b»ng enzym giíi h¹n EcoRI 51 2.2.7.9 Tách tinh DNA plasmid lượng lớn 51 2.2.7.10 Xác định trình tự nucleotit gen phyA 51 Chương Kết thảo luận 52 3.1 Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp phytaza hoạt lực cao 52 3.1.1 Tun chän s¬ vòng phân giải natri-phytat 53 3.1.2 Hoạt độ phytaza sinh tổng hợp từ chủng nấm mốc A niger 54 3.2 Nghiên cứu công nghệ lên men chủng A niger cho sinh tổng hợp phytaza 55 3.2.1 Lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp phytaza hoạt lực cao 55 Ký hiƯu chđng 55 3.2.2 ¶nh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính phytaza cña chñng A niger MP2 57 3.3.3 ¶nh hưởng nhiệt độ lên men đến hoạt tính phytaza cña chñng A niger MP2 58 3.2.4 ¶nh hưởng độ oxy hoà tan đến hoạt độ phytaza cña chñng A niger MP2 60 3.2.5 Nghiªn cøu thu håi phytaza tõ A niger MP2 62 3.2.5.1 Khảo sát nồng độ (NH ) SO kÕt tña phytaza tõ A niger MP2 62 R R R R R R 3.2.5.2 Kiểm tra độ tinh phytaza sau kết tủa 63 3.3 Xác định tính chất cña phytaza tõ chñng A niger MP2 64 3.3.1 Xác định pH tối ưu phytaza sinh tổng hợp tõ chñng A niger MP2 64 3.3.2 Khả chịu nhiệt phytaza từ chủng A.niger MP2 65 3.3.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm phytaza 66 3.4 T¸ch dòng đọc trình tự gen phyA mà hóa phytaza tõ nÊm mèc A niger MP2 68 3.4.1 T¸ch chiÕt DNA hƯ gen cđa A niger 68 3.4.2 Nhân gen phyA kü thuËt PCR 70 3.4.3 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR  2.1 71 P P 3.4.4 BiÕn nạp vectơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli IVNαF’ 72 3.4.5 T¸ch chiÕt DNA plasmid tõ E.coli IVNαF’ 73 3.4.6 C¾t kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzym giới hạn EcoRI 74 3.4.7 Xác định trình tự đoạn DNA ®Ỉc hiƯu cđa gen phyA tõ chđng A niger MP2 75 Ch­¬ng kÕt luËn 79 Tµi liƯu tham kh¶o 80 Đặt vấn đề Ngũ cốc họ đậu chiếm 90% diện tích trồng trọt giới Vì đóng vai trò nguồn cung cấp dinh dưỡng cho người vật nuôi Ngoài cung cấp chất khoáng đa lượng, vi lượng Một số chất khoáng đa lượng cần cho phát triển người vật nuôi photpho, đặc biệt phát triển xương trình trao đổi chất Tuy nhiên, photpho có chứa nguyên liệu hạt có tới 50- 80% nằm dạng phân tử phytat axit phytic Photpho tồn dạng khó tiêu hoá loài động vật có dày đơn ngăn gia cầm, lợn.Hơn nữa, phytat axit phytic thể điểm bất lợi khó hấp thụ, chúng ngăn cản khả kết hợp ion kim loại protein với axit không no, dẫn tới làm giảm khả tiêu hoá thức ăn động vật, gây hiệu ứng kháng dinh dưỡng Ngoài ra, axit phytic không phân huỷ thải môi trường theo phân động vật làm nghèo đất gây ô nhiễm môi trường Chính vậy, để tận dụng nguồn photpho có sẵn thành phần nguyên liệu thực vật, tăng hệ số sử dụng thức ăn vật nuôi, giảm lượng axit phytic thải môi trường việc chuyển hợp chất photpho dạng khó phân giải thành chất đơn giản dễ phân giải quan trọng Để đạt ®­ỵc ®iỊu ®ã, ng­êi ta ®· sư dơng phytaza ®Ĩ thủ ph©n axit phytic Phytaza (myo - inositol hexakisphosphate phosphohydrolase) enzym có khả xúc tác phản ứng thuỷ phân axit phytic (và muối axit này), giải phóng nhiều gốc phosphat vô tự myo inositol phân tử thấp, dạng chất dễ tiêu hoá hợp chất ban đầu Phytaza tất enzym khác, có sẵn mô, quan động, thực vật tế bào vi sinh vật Tuy nhiên, nghiên cứu để tách sản xuất phytaza, đặc biệt sản xuất với quy mô công nghiệp nguồn vi sinh vật nguồn để sản xuất enzym có ưu Có nhiều loài có khả sinh tỉng hỵp phytaza nh­ Aspergillus niger, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis nato, Escherrichia coli Phytaza phát vào năm 1907, đến năm 1994 ứng dụng phytaza bắt đầu đẩy mạnh Người ta đà sản xuất enzym phytaza dạng chế phẩm dạng bột, dạng nước dùng bổ sung vào thức ăn gia súc gia cầm, nhằm tăng hệ số sử dụng thức ăn vật nuôi giảm chi phí giá thành chăn nuôi Cuối kỷ XX, phytazađược coi chất phụ gia bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Lợi nhuận thu hàng năm vào khoảng 500 triệu USD có xu hướng tăng Vì tính chất ưu việt phytaza, nên số công trình nghiên cứu enzym hàng năm tăng lên rõ rệt Trong năm gần đây, việc phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp phytaza hoạt lực cao việc nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp cho suất cao hoàn thiện công nghệ sản xuất đà nhà khoa học cđa rÊt nhiỊu n­íc trªn thÕ giíi nh­ Mü, NhËt Bản, Hàn Quốc, Pháp, Đức đặc biệt quan tâm nước ta, việc nghiên cứu phytaza mẻ Trong năm qua, Nguyễn Thùy Châu cộng đà phân lập số chủng nấm mốc vi khuẩn có khả sinh phytaza cao từ Aspergillus niger, aspergillus ficuum vµ mét sè loµi vi khuÈn thuộc chi Bacillus Tác giả bước đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm phytaza từ chủng tự nhiên đà phân lập Các tác giả Dương Duy Đồng, Nguyễn Thị Hoài Trâm cộng đà thông báo khả ứng dụng chế phẩm phytaza Ronozyme P Thuỵ sĩ sản xuất vào thức ăn chăn nuôi Kết cho thấy phytaza làm tăng khả tiêu thụ thức ăn lợn làm tăng tỷ lệ đẻ trứng lên 2%, tăng suất trứng sau 12 tuần 1,86-1,99 quả/gà mái [1,4] Bên cạnh có số đơn vị nghiên cứu phytaza Bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại học Sư phạm tiến hành phân lập tuyển chän c¸c chđng vi sinh vËt sinh phytaza tõ vïng ngập mặt Các tác giả Trần thị Tuyết CS ®· sư dơng A niger NRRI 365 ®Ĩ s¶n xt phytaza phương pháp lên men bề mặt Để góp phần vào việc ứng dụng phytaza thức ăn chăn nuôi, việc tuyển chọn chủng giống cho suất cao nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza quy mô lớn quan trọng Chính vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu công nghƯ s¶n xt phytaza tõ nÊm mèc A niger Mơc tiêu nghiên cứu - Tìm yếu tố công nghệ thích hợp cho lên men thu hồi phytaza từ nấm mốc A.niger MP2 - Tách dòng đọc tr×nh tù gen m· hãa phytaza A tõ chđng A.nigerMP2, làm sở cho việc tạo chủng tái tổ hợp cho sản lượng phytaza cao Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thành phần môi trường, thời gian lên men cho sinh tổng hợp phytaza cao - Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, pH môi trường đến khả sinh tổng hợp phytaza - Nghiên cứu quy trình thu hồi phytaza - Xác định tính chất phytaza sinh từ nấm mốc A.nigerMP2 - Tách dòng ®äc tr×nh tù gen m· hãa phytaza A tõ nÊm mèc A niger cã ho¹t tÝnh phytaza cao Chương Tổng quan phytaza 1.1 Những nghiên cứu axit phytic Axit phytic axit hữu phân tử có chứa gốc phosphat Nó có mặt chủ yếu hạt loại ngũ cốc, đậu đỗ hạt có dầu Người ta đà xác định axit phytic giữ vai trò định có tác động ảnh hưởng đến tính chất dinh dưỡng loại hạt Axit phytic có công thức phân tử C H 18 O 24 P phân tử lượng R R R R R R R R 660,04 Danh ph¸p quèc tÕ axit phytic gọi myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisdihydrogen phosphate Thùc tÕ, axit phytic th­êng tån t¹i d­íi d¹ng muối kim loại hoá trị I, II (thường Kali- Magiê- Canxi) Các muối gọi phytat chúng xem kho dự trữ photpho lớn hạt thực vật Hình 1.1: Cấu tróc axit phytic - d­íi d¹ng mi phytate Cã nhiỊu nghiên cứu mô hình cấu trúc phân tử axit phytic nghiên cứu lại đưa đến kết luận khác Trong số nghiên cứu có hai nghiên cứu tiêu biểu hai nhóm chuyên gia khác biết đến nhiều Đó nghiên cứu Johnson phương pháp cộng hưởng điện từ hạt nhân 31 P P (31 P- NMR) [18] nghiên cứu Blank P P P 72 H×nh 3.4: Chđng E coli IVNαF’ Sau biến nạp nuôi cấy môi trường bổ sung Amp X - Gal Các khuẩn lạc xanh xuất vectơ pCR 2.1 mang operon lac P P hoạt động bình thường, tổng hợp - galactosidaza enzym có vai trò chuyển hoá chất X - gal thành hợp chất có màu xanh, khuẩn lạc trắng hình thành từ tế bào mang plasmid có operon lac không hoạt động đoạn DNA ngoại lai xen vào vị trí gen cấu trúc lac - Z dẫn đến không tổng hợp - galactosidaza cần cho chuyển hoá X - gal Kết đĩa mọc nhiều khuẩn lạc xanh, trắng riêng rẽ Việc lựa chọn khuẩn lạc trắng để tách plasmid loại bỏ phần lớn trường hợp không mong muốn, nhiên tất khuẩn lạc trắng mang đoạn DNA mà ta quan tâm Cho nên để thu vectơ tái tổ hợp mang đọan gen đích việc tách chiết lại plasmid từ khuẩn lạc trắng kiểm tra lại cách cắt với enzym giới hạn và giải trình tự DNA cần thiết 3.4.5 Tách chiết DNA plasmid từ E.coli IVNF Để chọn lọc dòng tế tế bào chứa plasmid có khả mang gen phyA, tiến hành chọn ngẫu nhiên 14 khuẩn lạc riêng rẽ màu trắng khuẩn lạc xanh làm đối chứng Nuôi cấy lắc khuẩn lạc riêng rẽ 73 ml môi trường LB lỏng cã bỉ sung Ampicillin ë nhiƯt ®é 37 o C, tốc độ 200 P P vòng/phút qua đêm Tiến hành tách DNA plasmid theo phương pháp Sambrook cộng Sản phẩm tách chiết điện di gel agaroza 1% để kiểm tra Kết điện di hình 3.4 Hình 3.5: Điện di kiểm tra plasmid gel agaroza 1% X: Plasmid đối chứng tách từ khuẩn lạc xanh - - 14: Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng Theo lý thuyết plasmid tái tổ hợp có mang theo DNA ngoại lai nên di chuyển chậm điện trường cho băng cao điện di đồ Nhìn điện di đồ, nhận thấy dòng plasmid 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11,12,13 14 tách từ khuẩn lạc màu trắng nằm cao so với dòng đối chứng tách từ khuẩn lạc màu xanh (đường chạy X) Như vậy, ta khẳng định đà có đoạn gen ngoại lai chèn vào dòng plasmid nói Để kết luận đoạn DNA ngoại lai chèn vào vectơ gen phyA hay không, đà tiến hành cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp đà chọn enzym giới hạn EcoRI 3.4.6 Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzym giới hạn EcoRI Do vectơ pCR2.1 có vị trí cắt enzym giới hạn EcoRI hai đầu vùng cắt gắn đa vị, sau cắt enzym trên, đoạn DNA ngoại lai 74 tách khỏi vectơ Chúng đà chọn ngẫu nhiên plasmid có khả mang gen phy A (tách từ dòng số 2, 14) để tiến hành cắt EcoRI, cắt enzym đoạn DNA ngoại lai tách khỏi vectơ Sản phẩm cắt điện di kiểm tra gel agaroza 1% Hình 3.6: Điện di gel agaroza kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR cắt EcoRI M: Chỉ thị phân tử DNA cắt phối hợp EcoRI HindIII Kênh 1: Sản phẩm PCR Các kênh 2,9,14: Plasmid dòng 2,9,14 cắt EcoRI Kết sau cắt cho thấy đoạn DNA tách khỏi vectơ từ dòng đà văng băng có kích thước sản phẩm PCR khoảng 1357 bp, phù hợp với tính toán Do đó, dòng plasmid tái tổ hợp mà đà chọn có khả mang đoạn gen phyA Plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen phyA đặt tên pCRphyA Từ kết thu trên, bước đầu khẳng định đà tách dòng thành công gen phyA vectơ pCR2.1 Tuy nhiên, thực phản ứng PCR xảy sai sót làm biến đổi thành phần nucleotit sản phẩm PCR gây lệch khung đọc đột biến nhầm 75 nghĩa ảnh hưởng đến sản phẩm protein đuợc biểu sau Chính vậy, để kiểm tra xác gen tách dòng gen phyA mong muốn, đà tiến hành đọc trình tự đoạn gen vectơ pCR2.1 so sánh trình tự với trình tự gen đăng ký Ngân hàng Gen quốc tế phầm mềm chuyên dụng 3.4.7 Xác định trình tự đoạn DNA đặc hiệu gen phyA từ chủng A niger MP2 §Ĩ cã thể khẳng định đoạn DNA à tách dòng úng l on gen phyA, đà tiến hành xác nh trình t đoạn gen theo phương pháp tổng hợp Sanger cs [35] đà nêu phần vật liệu phương pháp Các dòng plasmid tái tổ hợp tinh chế Kit QIA, sau sử dụng để làm phản ứng xác định trình tự Trình tự gen xác định tự động máy xác định trình tự ABI 3100 Avant víi bé kit BigDye Terminator 3.1 Gen phyA sau phân tích có trình tự sau: AGTCACCTCCGGACTGGCAGTCCCCGCCTCGAGAAATCAATCCACTTGCGATACGGTCGA 60 TCAGGGGTACCAATGCTTCTCCGAGACTTCGCATCTTTGGGGTCAATACGCACCGTTCTT 120 CTCTCTGGCAAACGAATCGGTCATCTCCCCTGAGGTGCCCGCCGGATGCAGAGTCACTTT 180 CGCTCAGGTCCTCTCCCGTCATGGAGCGCGGTATCCGACCGACTCCAAGGGCAAGAAATA 240 CTCCGCTCTCATTGAGGAGATTCAGCAGAACGCGACCACCTTTGATGGAAAATATGCCTT 300 CCTGAAGACATACAACTACAGCCTGGGTGCAGATGACCTGACTCCCTTCGGAGAACAGGA 360 GCTAGTCAACTCCGGCATCAAGTTCTACCAGCGATACGAATCGCTCACAAGGAACATCAT 420 TCCATTCATCCGATCCTCTGGCTCCAGCCGCGTGATCGCCTCCGGCAAGAAATTCATCGA 480 GGGCTTCCAGAGCACCAAGTTGAAGGATCCTCGTGCCCAGCCTGGCCAATCGTCGCCCAA 540 GATCGACGTGGTCATTTCCGAGGCCAGCTCATCCAACAACACGCTCGACCCAGGCACCTG 600 CACTGTCTTTGAAGACAGCGAATTGGCCGATACCGTCGAAGCCAATTTCACCGCCACGTT 660 CGTCCCCTCTATTCGTCAACGTCTGGAGAACGACCTGTCTGGCGTGTCTCTCACAGACAC 720 AGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACTATCTCCACTAACACCGTCGA 780 CACCAAACTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCCACGAAGAATGGATCAACTACGACTA 840 CCTCCAGTCCCTGAAAAAGTACTACGGTCATGGCGCCGGTAACCCGCTCGGCCCGACCCA 900 GGGCGTCGGCTACGCTAACGAGCTCATCGCCCGTCTCACCCACTCGCCTGTCCACGATGA 960 CACCAGCTCCAACCACACATTGGACTCTAACCCGACTACCTTTCCGCTCAACTCTACTCT 1020 76 CTACGCGGATTTTTCCCACGATAACGGTATCATCTCTATCCTCTTTGCTTTGGGTCTGTA 1080 TAACGGCACCAAGCCGCTGTCTACCACGACCGTGGAGAATATCACCCAGACAGATGGATT 1140 TTCGTCTGCTTGGACGGTTCCGTTTGCTTCGCGTCTGTACGTTGAGATGATGCAGTGTCA 1200 GGCCGAGCAGGAGCCGCTGGTCCGTGTCTTGGTTAATGATCGCGTTGTCCCGCTGCATGG 1260 TTGTCCGGCTGATGCTTTGGGGAGATGTACCCGGGATAGCTTTGTGAAGGGGTTGAGCTT 1320 TGCTAGATCTGGGGGTGATTGGGCGGAGTGTTTTGCTTAG 1357 Trình tự đoạn DNA m· hãa cho phytaza tõ chñng nÊm mèc A niger MP2 phân lập Việt Nam Sau xác định trình tự thu đoạn gen có chứa 1357 cặp bazơ tính toán theo lý thuyết Để xác định độ tương đồng gen mà ho¸ phytaza tõ chđng A niger MP2 cđa ViƯt Nam gen mà hoá phytaza từ nấm mốc Aspergillus đà công bố giới, đà sử dụng chương trình Fasta so sánh trình tự KÕt qu¶ cho thÊy gen phyA cđa chđng nÊm mèc A niger MP2 đạt độ tương đồng cao với gen phyA cña chñng A niger N1 cña Trung Quèc (99,7%) Bảng 3.12: So sánh trình tự gen phyA chđng A niger MP2 víi c¸c gen m· hãa phytaza từ Aspergillus đà công bố giới 22T16T 22TU Alignment DB:ID Source U22 T16T Length Identity% EM_FUN:AY426977 Aspergillus niger strain N14 1525 EM_FUN:AY745739 Aspergillus niger phytase gene 1506 EM_FUN:AF218813 Aspergillus niger myo-inosit 1528 Aspergillus niger var awamori EM_FUN:L02421 2379 ph Aspergillus niger phyA gene EM_FUN:Z16414 2000 Aspergillus niger myo-inistol EM_FUN:M94550 2665 he EM_FUN:AY513749 Aspergillus niger phytase (p 1506 EM_FUN:AB022700 Aspergillus niger gene for p 1515 10 EM_FUN:DQ266883 Aspergillus niger strain N-2 EM_FUN:AY615712 Aspergillus niger strain N-2 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 99.705 96.758 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 1347 1347 96.610 96.389 96.315 96.315 96.094 92.262 92.411 92.262 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T 28T Chóng t«i tiến hành dịch mà đoạn gen mà hoá phytaza cđa ViƯt Nam sang protein Tr×nh tù axit amin suy diƠn cđa phytaza ViƯt nam cã chiỊu 77 dµi lµ 452 axit amin có độ tương đồng đến 98% so phytaza tõ chñng A niger N1 cña Trung Quèc PhyAVN VTSGLAVPASRNQSTCDTVDQGYQCFSETSHLWGQYAPFFSLANESVISPEVPAGCRVTF 60 VTSGLAVPASRNQSTCDTVDQGYQCFSETSHLWGQYAPFFSLANES ISP+VPAGC+VTF PhyATQ PhyAVN VTSGLAVPASRNQSTCDTVDQGYQCFSETSHLWGQYAPFFSLANESAISPDVPAGCKVTF AQVLSRHGARYPTDSKGKKYSALIEEIQQNATTFDGKYAFLKTYNYSLGADDLTPFGEQE 75 120 AQVLSRHGARYPTDSKGKKYSALIEEIQQNATTFDGKYAFLKTYNYSLGADDLTPFGEQE PhyATQ AQVLSRHGARYPTDSKGKKYSALIEEIQQNATTFDGKYAFLKTYNYSLGADDLTPFGEQE 135 PhyAVN LVNSGIKFYQRYESLTRNIIPFIRSSGSSRVIASGKKFIEGFQSTKLKDPRAQPGQSSPK 180 LVNSGIKFYQRYESLTRNIIPFIRSSGSSRVIASGKKFIEGFQSTKLKDPRAQP QSSPK PhyATQ LVNSGIKFYQRYESLTRNIIPFIRSSGSSRVIASGKKFIEGFQSTKLKDPRAQPSQSSPK 195 PhyAVN IDVVISEASSSNNTLDPGTCTVFEDSELADTVEANFTATFVPSIRQRLENDLSGVSLTDT 240 IDVVISEASSSNNTLDPGTC VFEDSELADTVEANFTATFVPSIRQRL NDLSGVSLTDT PhyATQ IDVVISEASSSNNTLDPGTCAVFEDSELADTVEANFTATFVPSIRQRLGNDLSGVSLTDT 255 PhyAVN EVTYLMDMCSFDTISTNTVDTKLSPFCDLFTHEEWINYDYLQSLKKYYGHGAGNPLGPTQ 300 EVTYLMDMCSFDTIST+TVDTKLSPFCDLFTH+EWINYDYLQSLKKYYGHGAGNPLGPTQ PhyATQ EVTYLMDMCSFDTISTSTVDTKLSPFCDLFTHDEWINYDYLQSLKKYYGHGAGNPLGPTQ 315 PhyAVN GVGYANELIARLTHSPVHDDTSSNHTLDSNPTTFPLNSTLYADFSHDNGIISILFALGLY 360 GVGYANELIARLTHSPVHDDTSSNHTLDS+P TFPLNSTLYADFSHDNGIISILFALGLY PhyATQ GVGYANELIARLTHSPVHDDTSSNHTLDSSPATFPLNSTLYADFSHDNGIISILFALGLY 375 PhyAVN NGTKPLSTTTVENITQTDGFSSAWTVPFASRLYVEMMQCQAEQEPLVRVLVNDRVVPLHG 420 NGTKPLSTTTV+NITQTDGFSSAWTVPFASRLYVEMMQCQAEQEPLVRVLVNDRVVPLHG PhyATQ NGTKPLSTTTVQNITQTDGFSSAWTVPFASRLYVEMMQCQAEQEPLVRVLVNDRVVPLHG PhyAVN CPADALGRCTRDSFVKGLSFARSGGDWAECFA 452 CPADALGRCTRDSFV+GLSFARSGGDWAECFA PhyATQ CPADALGRCTRDSFVRGLSFARSGGDWAECFA 467 435 78 So sánh trình tự axit amin phytaza tõ nÊm A niger MP2 cđa ViƯt Nam vµ phytaza cña chñng A niger N1 cña Trung Quèc Nh­ vËy, đà tách dòng thành công gen phyA của nấm mốc A niger MP2 vectơ pCR2.1 Điều đà tạo tiền đề cho việc biểu gen m· ho¸ phytaza mét sè hƯ biĨu hiƯn kh¸c để nâng cao suất phytaza chủng tái tổ hợp 79 Chương kết luận - Đà tuyển chọn chủng A niger sinh phytaza từ sưu tập giống phòng nghiên vi sinh vật sau thu hoạch, chủng A niger MP2 cho sản lượng phytaza cao đạt 13,5 U/ml - Đà nghiên cứu yếu tố công nghệ lên men thích hợp cho sinh tổng hợp phytaza cao hệ thống lên men chìm sục khí quy mô 100 lít/mẻ: môi trường P3 gồm bột ngô muối khoáng, nhiệt độ lên men 30 C, độ oxy hòa tan từ thứ 49 trở 90%, sản P P lượng phytaza đạt 13,5 U/ml - Đà xác định tính chất phytaza từ chủng A niger MP2: nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính phytaza 50 C pHopt =5,5 P P - Đà tạo chế phẩm phytaza dạng bột có hoạt độ 465 U/g bao gåm: Tinh bét s¾n: 80g, nÊm men Saccharomyces: 10g, dầu ăn: 10ml, ZnSO4: 0.5g 160 ml phytaza đà cô đặc - Đà nhân thành công đoạn gen phyA tõ DNA hƯ gen cđa chđng nÊm mèc A niger MP2 cặp mồi phyAP1 phyAP2 - Đà xác định trình tự đoạn DNA mang gen phyA từ chủng A niger MP2 Đoạn có chiều dài 1357 nucleotit, mà hóa cho đoạn protein gồm 452 axit amin Tr×nh tù nucleotit cđa gen phyA cđa chủng nấm mốc A niger MP2 đạt độ tương đồng cao nhÊt víi gen phyA cđa chđng A niger N1 cđa Trung Qc (99,7%) - Tr×nh tù axit amin suy diƠn cđa phytaza ViƯt nam cã chiỊu dµi lµ 452 axit amin có độ tương đồng đến 98% so víi phytaza tõ chđng A niger N1 cđa Trung Qc 80 Tài liệu tham khảo Dương Duy Đồng (1999), Báo cáo kết thử nghiệm sử dụng enzym phytaza Ronozyme P cđa h·ng Roche khÈu phÇn thøc ăn chăn nuôi lợn gà đẻ Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh Lương Đức Phẩm (1998) C«ng nghƯ vi sinh vËt NXB N«ng nghiƯp trang 245 Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thắng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Lợi, Lưu Duẩn, Lê DoÃn Diên, 2000 Hoá sinh công nghiệp Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Thị Hoài Trâm, 2002 Báo cáo tổng kết đề tài R-D cÊp bé: “Nghiªn cøu øng dơng chÕ phÈm enzym sản xuất thức ăn chăn nuôi.Viện công nghệp thực phẩm Hà Nội Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998) Công nghệ enzym NXB n«ng nghiƯp trang 41-56, 310312 Al Asheh, S DNA Duvnjak, Z (1994) Characteristics of phytase produced by Aspergillus carbonarius NRC 401121 in canola meal Acta Biotechnol 14, p 223-233 Blank G E., Pletcher J., Sax M (1971) The structure of myoinositol hexaphosphate, dodecasodium salt octama-contahydrate: a single crystal x-ray analysis Biochem Biophys.Res Commun 44, 319-325 Ebune, A., Al-Asheh.S., DNA Duvnjak.Z (1995) Effect of phosphate, surfactants DNA glucoza on phytase production DNA 81 hydrolysis of phytic acid in canola meal by Aspergillus ficuum during solid state fermentation Biores Technol 54, p 241 - 247 Ebune, A., Al-Asheh.S., DNA Duvnjak.Z (1995) Effect of phosphate, surfactants DNA glucose on phytase production DNA hydrolysis of phytic acid in canola meal by Aspergillus ficuum during solid state fermentation Biores Technol 54, p 241 - 247 10 Feldthusen J.J., Lohscheidt Markus., Habich Andreas (2006), “Enzyme formulation”, Patent application WO2006056469 11 Ghosh, S (1997) Phytase of a thermophilic mould Sporotrichum thermophile Apinis M sc dissertation, Department of Microbiology, Unirversity of Delhi, Delhi 12 Greaves, M P., DNAerson, G DNA Webley, D M (1967) The hydrolysis of inositol phosphates by Aerobacter aerogenes Biochim Biophys Acta 132, p 412-418 13 Heeft F.C (1996) Phytaza Activity, Vanadate Manual Method in Mineral Feed from BASF ect Gist-brocades Method Nr 61696 14 Howson S J., Davis R J (1983) Production of phytaza-hydrolysing enzyme by fungi Enzyme Microbiol Technol 5, 377-382 15 Invitrogen life technologies (2002), “ TOPO – TA cloning kit” 16 Janne Kerovuo (2000) A Novel Phytase from Bacillus Characterization DNA Production of the Enzyme Thesis Faculty of Science of the University of Helsinki 17 Jareonkitmongol, S., Ohya, M., Watanabe, R., Takagi, H DNA Nakamori, S (1997) Partial purification of phytase from a soil isolate bacterium, Klebsiella oxytoca MO-3 J Ferment.Bioeng 83, p 393-394 82 18 Johnson L., Tate M (1969) The structure of myo-inositol pentaphosphates Ann A.N.Acad Sci 165, 526-535 19 Kerovuo J (2000) A novel phytaza from Bacillus Characterization DNA production of the enzyme Helsinki 20 Kerovuo J., Lauraeus M., Nurminen P., Kalkkinen N., Apajalahti J (1998), “Isolation, characterization, molecular gene cloning DNA sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis“, Appl Environ Microbiol 64, pp 2079-2085 21 Kim D.S., Godber S.J., Kim H.R (1999) Culture condition for a new phytaza-producing fungus” Biotechnology Letters 21, 10771081 22 Kim, Y O., Lee, J K., Kim, H K., Yu, J H DNA Oh, T K (1998) Cloning of the thermostable phytase gene (phy) from Bacillus sp DS11 DNA its overexpression in Escherichia coli FEMS Microbiol Lett 162, p 185-191 23 Kui Hong, Yan Ma, DNA Meiqiu Li (2001) Solid - state fermentation of phytase from cassava dregs Applied Biochemistry DNA Biotechnology Vol p 91-93 24 Laboure A.M., Gagnon J., Lescure A.M (1993) Purification DNA characterization of a phytaza ( myo-inositol hexakisphosphate) accumulated in maize (zea mays) seedlings during germination Biochem J ,295,413-419 25 Lima J.F.D., Bordin M., Markussen K., Levring K.B., Bonde M., Marcusen E., Sangman G (2002) “Enzyme containing granules and process for the 2002/0173441A1 production thereof”, patent application VS 83 26 MDNAviwala T.N., Khire J.M (2000) Production of high activity thermostable phytaza from thermotoleant Aspergillus niger in solid state fermentation Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 24, 237243 27 Moore E., Helly V.R., Conneely O.M., Ward P.P., Power R.F., Headon D.R (1995), “Molecular cloning expression DNA evaluation of phosphohydrolases for phytate-degrading activity”, J Ind Microbiol 14, pp 396-402 28 Pasamontes L., Haiker M., Wyss M., Tessier M., van Loon A.P.G.M (1997a), “Gene cloning, purification, DNA characterization of a heat-stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus”, Appl Environ Microbiol 63, pp 1696-1700 29 Pasamontes, L., Haiker, M., Henriquez-Huecas, M., Mitchell, D B DNA van Loon, A P G M (1997) Cloning of the phytases from Emericella nidulans DNA the thermophilic fungus Talaromyces thermophilus Biochim Biophys Acta 1353, p 217-223 30 Powar, V K DNA Jagannathan, V (1982) Purification DNA properties of phytate-specific phosphatase from Bacillus subtilis J Bacteriol 151, p 1102-1108 31 Quan, C.S., Zhang, L H., Wang, Y J., DNA Ohta, Y Y (2001) Production of phytase in a low phosphate medium by a novel yeast CDNAia kruisei J Biosci Bioeng 92 (2), p 154-160 32 Roland B., Martin L., Markuss W (2000) “phytase formulation”, patent application EP0969089 33 Sambrook J., Fistch F., Maniatis T (1989), “Moleculer cloning I, II, III” A loboratory mannual Cold Spring Harbo Laboratory Press 84 34 Sambrook J., Russell D W (2001), “Molecullar cloning”, A laboratory manual, rd ed, Cold spring Harbor laboratory press, Cold P P spring harbor, NY 35 Sanger F., Nicklen S., Coulson A., R (1977), “ DNA sequencing with chain termination inhibitors”, Proceeding of the national academy of sciences of the USA, 74, pp: 5463-5467 36 Sano, K., Fukuhara, H., DNA Nakamura Y (1999) Phytase of the yeast Arxula adeninivorans, Biotechnol Lett 21, p 33 -38 37 Sequeilha, L., Lambrechts, C., Boze, H., Moulin, G DNA Galzy, P (1992) Purification DNA properties of the phytase from Schwanniomyces castelii J Ferment Bioeng 74, p 7-11 38 Shieh, T R DNA Ware, J H (1968) Survey of microorganisms for the production of extracellular phytase Appl Microbiol 16, p 13481351 39 Siren, M (1995) Method of treating pain using inositol triphosphate U.S Patent 5407924 40 Siren, M (1998) Use of an ester of inositoltriphosphate for the preparing of medicaments U.S Patent 5846957 41 Stoscheck, CM 1990 Quantitation of Protein Methods in Enzymology 182: p 50-69 42 Sreenramulu G, Srinivasa D S., NDNA K., DNA Joseph R (1996) Lactobacillus amylovorus as a phytase producer in submerged culture Lett Appl Microbiol 23, p 385 - 388 43 Van Hartingsveldt W., van Zeijl C.M.J., Harteveld G.M., Gouka R.J., Suykerbuyk M.E.G., Luiten R.G.M., Van Paridon P.A., 85 Selten G.C.M., Veenstra A.E., van Gorcom R.F., van den Hondel C.A (1993), “Cloning, chracterization DNA overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger”, Gene 127, pp 8794 44 Volfova O., Dvorakova J., Hanzlikova A., JDNAera A (1994) Phytaza from Aspergillus niger Folia Microbiol 39, 481-484 45 Wyss M., Brugger R., Kronenberger A., Remy R., Fimbel (1999) Biochemical characterization of fungal phytazas (myo-inositol haxakisphosphate phosphohydrokase): catalytic properties Appl Environ Microbiol 65, 367-373 46 Wyss M., Pasamontes L., Friedlein A., Remy R., Tessier M., Kronenberger A., Middendorf A., Lehmann M., Schnoebelen L., Rothlisberger U., Kusznir E., Wahl G., Muller F., Lahm H W., Vogel K., van Loon A P G M (1999a), “Biophysical characterization of fungal phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases): molecular size, glycosylation pattern, DNA engineering of proteolytic resistance”, Appl Environ Microbiol 65, pp 359-366 47 Xiong A.S., Yao Q.H., Peng R.H., Fan H.Q., Guo M.J., Zhang S.L (2004), “Isolation, Characterization and molecular cloning of the cDNA encoding a novel phytase from Aspergillus niger 113 and high expression in pichia pastoris”, J.Biochem Mol Biol 37, PP 282-291 48 Yamada K., Minoda Y., Yamamoto Y (1968) Phytase from Aspergillus terrus Production, purification DNA some general properties of the enzyme Agric Biol Chem 32, 1275-1282 86 49 Yang W J., Matsuda Y., Inomata M., Nakagawa (1991b) Developmental DNA dietary induction of 90 kDa subunit of rat intestinal phytase Biochim Biophys Acta 1075, 83-87 50 Yang W J., Matsuda Y., Sano S., Masutani H., Nakagawa (1991a) Purification DNA characterization of phytase from rat intestinal mucosa Biochim Biophys Acta 1075, 75-82.67 51 Yansura D G., Henner D J (1984) Use of the Escherichia coli lac repressor DNA operator to control gene expression in Bacillus subtilis Proc Natl Acad Sci 81, 439-443 52 Yoon S J., Choi Y J., Min H K., Cho K K., Kim J W., Lee S C., Jung Y H (1996) Isolation DNA identification of phytase-producing bacterium, Enterobacter sp 4,DNA enzymatic properties of phytase enzyme Enzyme Microbiol Technol 18, 449-454 53 Zyta, K., DNA gogol, D (2002) In vitro efficacies of phosphorolytic enzymes synthesized in mycelial cells of Aspergillus niger AbZ4 grown by a liqid surface fermentation J Agric Food Chem 50 (4), p 899-905 ... quan trọng Chính vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza từ nấm mốc A niger Mục tiêu nghiên cứu - Tìm yếu tố công nghệ thích hợp cho lên men vµ thu håi phytaza. .. nÊm mèc A. nigerMP2 - Tách dòng đọc trình tự gen mà h? ?a phytaza A tõ nÊm mèc A niger cã ho¹t tÝnh phytaza cao 4 Ch­¬ng Tỉng quan vỊ phytaza 1.1 Những nghiên cứu axit phytic Axit phytic axit hữu... tổng hợp phytaza ngoại bào có hai loài lµ Bacillus vµ Enterobacter Mét sè nÊm men nh­ Sacharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida có khả sinh phytaza ­u ®iĨm c? ?a phytaza tõ ngn