Góp phần kiểm soát sự nhiễm tạp vi khuẩn trong quy trình sản xuất sữa tiệt trùng với sự hỗ trợ của kỹ thuật PCR

Bộ giáo dục đào tạo Trường đại học bách khoa hà nội Luận văn thạc sĩ khoa học Góp phần kiểm soát nhiễm tạp vi khuẩn qui trình sản xuất sữa tiệt trùng với hỗ trợ kỹ thuật PCR Ngành: Công nghệ sinh học Phùng Thị Thuỷ Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Xuân Sâm Hà Nội 2006 Mơc lơc Ch­¬ng I Tỉng quan 1 Hiện trạng ngành công nghiệp sữa Việt Nam 1.2 Tiêu chuẩn vi sinh vật cho số sản phẩm sữa 1.3 Vi sinh vật nhiễm tạp sữa 1.3.1 Các nhóm VSV thường gặp 1.3.2 Một số vi sinh vật gây bệnh gặp sữa 1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến mức độ nhiễm tạp vi sinh vật sữa 11 tươi nguyên liệu 1.4.1 ảnh hưởng nhóm vi sinh vật nhiễm tạp từ vú bò 11 1.4.2 ảnh hưởng nhóm vi sinh vật nhiễm tạp vú bò 12 1.4.3 ảnh hưởng trình vệ sinh thiết bị 13 1.4.4 ảnh hưởng thời gian nhiệt độ bảo quản 13 1.5 Một số nguyên nhân gây nhiễm tạp vi sinh vật qui trình sản xuất 14 sữa tiệt trùng 2.6 Các phương pháp ph¸t hiƯn vi sinh vËt mÉu thùc phÈm 17 1.6.1 Các phương pháp truyền thống 18 1.6.2 Các phương pháp phát nhanh 19 Chương II Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu thiết bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 26 26 29 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 30 2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử 32 Chương III Kết thảo luận 36 3.1 36 Khảo sát qui trình chế biến sữa tiệt trùng sở sản xuất 3.1.1 Qui trình chế biến sữa tiệt trùng 36 3.1.2 Phân tích điểm nguy nhiễm cao 38 3.2 39 Khảo sát khả nhiễm vi khn hiÕu khÝ tỉng sè 3.2.1 KiĨm tra nguyªn liƯu s¶n xt 39 3.2.2 Kiểm tra bán thành phẩm thành phẩm 42 3.3 Xác định số VSV có nguy lây nhiễm q trình sản xuất 44 3.3.1 Xác định mt s vi khuẩn cú nguy c lõy nhim sữa bột nguyên 44 liệu 3.3.2 Xác định mt s vi khuẩn cú nguy c lõy nhim bán thành 45 phẩm 3.3.3 Xác định mt s vi khuẩn nhim sản phẩm sữa hỏng 47 3.3 Xây dựng qui trình phát hiƯn mét sè vi sinh vËt s÷a tiƯt trïng dựa 49 kỹ thuật PCR 3.3.1 Xác định độ nhạy phản ứng PCR 50 3.3.2 Khảo sát khả loại bỏ protein sữa EDTA 53 3.3.3 Khảo sát khả ảnh hưởng việc bổ sung EDTA đến khả 54 tăng sinh vi sinh vật 3.3.4 Thit lp qui trình phát B cereus, Salmonella ssp, E.coli, 55 Staphylococcus aureus 3.2.5 Nghiên cứu khả phát B.ceures Salmonella ssp Trong sữa 60 tiƯt trïng cã sù xt hiƯn cđa c¸c vi sinh vật khác 3.2.6 Kiểm định phương pháp 62 Chương IV 64 Kết luận Lời cảm ơn Trước hết xin bầy tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, người đà tận tình hướng dẫn suốt qúa trình học tập, nghiên cứu để hoàn thiện luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS Lê Quang Hoà đà giúp đỡ nhiều trình nghiên cứu phòng thí nghiệm Công nghệ Protein enzym kỹ thuệt gen Qua xin chân thành cảm ơn đến toàn thể cán Viện CNSH CNTP Trường ĐHBK đặc biệt Phòng Hoá sinh nơi công tác đà tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu để hoàn thiện đề tài Xin Chân thành cảm ơn đến người thân gia đình đà động viên giúp đỡ trình làm luận văn Lời cam đoan Tôi xin cam đoan kết trình bầy luận văn hoàn toàn xác tiến hµnh NÕu cã bÊt cø sai sãt vµ tranh chÊp quyền xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật Hà Nội ngày 20/11/06 Người viết cam đoan Phùng thị Thuỷ Mở đầu Lượng sữa tiêu thụ thị trường Việt Nam ngày tăng Trong 10 năm vừa qua mức tiêu thụ đà tăng lên khoảng 15 lần ước tính từ đến năm 2010, nhu cầu sản phẩm sữa nước ta gia tăng khoảng 10-15% năm để đạt đến mức khoảng 10 kg/đầu người/năm Vốn thực phẩm bổ dưỡng, sản phẩm sữa môi trường thích hợp cho phát triển vi sinh vật gây bệnh Do vậy, công tác kiểm tra, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm sản phẩm sữa mối quan tâm hàng đầu nhà sản xuất lẫn người tiêu dùng Trong thực tiễn sản xuất, nhà máy có hệ thống đảm bảo chất lượng ISO 9001 hay HACCP, xảy tượng nhiễm vi sinh vật gây hại Các tượng nhiễm thông thường phát muộn, kết biện pháp xử lý kỹ thuật có hiệu nhà sản xuất phải huỷ bỏ lô hàng bị nhiễm gây lÃng phí lớn mặt kinh tế Bởi vậy, việc xác định nhóm vi sinh vật có khả nhiễm tạp cao gây hại lớn qui trình sản xuất sữa, từ thiết lập phương pháp, qui trình xác định nhanh vi sinh vật gây hại có khả ứng dụng thực tiễn sản xuất sữa cần thiết để giảm tổn thất cho nhà sản xuất bảo đảm sức khỏe cho người tiêu dùng Thực đề tài luận văn thạc sỹ Góp phần kiểm soát nhiễm tạp vi khuẩn qui trình sản xuất sữa tiệt trùng với mong muốn giảm thiểu tổn thất vi sinh vật nhiễm tạp sữa gây Nội dung luận văn bao gồm vấn đề sau: - Khảo sát vi sinh vật tổng số chúng loại số vi sinh vật nhiễm tạp qui trình sản xuất sữa tiệt trùng từ xác định nguồn nhiễm tạp chủng loại có khả nhiễm tạp cao - Xây dựng qui trình phát nhanh số chủng vi sinh vật có khả nhiễm tạp cao qui trình sản xuất sữa - Kiểm nghiệm qui trình mẫu sữa t­¬i Ch­¬ng I Tỉng Quan 1 HiƯn trạng ngành công nghiệp sữa Việt Nam Theo đánh giá nhà maketing ngành công nghiệp sữa Việt Nam có nhiều triển vọng nhà sản xuất nước đáp ứng 11% nhu cầu tiêu thụ Nhu cầu tiêu thụ sữa thị trường tăng không ngừng, năm 1990 tính bình quân đầu người mức 0,47kg/năm, đến năm 2000 số tăng lên đén 6,5 kg/năm đến năm 2005 đạt tới 9kg/năm Cùng với gia tăng nhu cầu tiêu thụ sản lượng sữa sản xuất nước tăng lên đáng kể Theo số liệu thống kê, năm 2000 sản lượng sữa nước đạt 54 000 tấn, năm 2003 tăng gấp hai lần (112 000 tấn) đến năm 2004 số đà tăng lên thành xấp xỉ 198 000 Sản lượng sữa dự báo tăng nhanh giai đoạn tới Mặc dù có tăng trưởng tốt sản lượng tiêu thụ sản xuất ngành sữa Việt nam có nhiều vấn đề cần giải thân nhà máy chế quản lý cho đảm bảo chất lượng sản phẩm quyền lợi người tiêu dùng Đà có nhiều chương trình chăn nuôi bò sữa vùng miền nhiên chưa đem lại lợi nhuận kinh tế đáng kể nguyên nhân mức đầu tư chưa lớn, kỹ thuật chưa đủ đáp ứng quản lý chưa hiệu Chính nguyên nhân mà ngành chăn nuôi bò sữa nhiều vấp phải vòng luẩn quẩn nguồn thu từ bán sữa tươi chưa đủ để đầu tư sở vật chất kỹ thuật tốt, đầu tư chưa tốt nên chất lượng sữa không đủ đáp ứng yêu cầu điều lại nguyên nhân làm cho thu nhập từ chăn nuôi bò sữa không cao Tại nhà máy chế biến sữa gặp phải số vấn đề Vào mùa hè lượng sữa tiêu thụ mạnh nhà máy phải sản xuất hết công xuất, đa số nhà máy đà áp dụng hệ thống phòng ngừa HACCP nhiên gặp phải cố nhiễm tạp vi sinh vật gây tổn thất lớn cho nhà sản xuất gây hại đến người tiêu dùng Về nguyên liệu, nguồn sữa tươi nguyên liệu sử dụng cho sản xuất sữa tiệt trùng nhà máy Việt Nam không đáp ứng đủ nhu cầu số lượng chất lượng nên nhà máy phải sử dụng lượng lớn sữa bột nhập Về đầu tư nhà máy hoạt động theo chế thị trường nên phải tối đa lợi nhuận đầu tư người sở vật chất cho kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm chất lượng sản phẩm (ví dụ phòng QA, QC, ) nhiều hạn chế Trong chưa có chế thoả đáng khuyến khích hợp tác sở nghiên cứu khoa học, quan quản lý chất lượng với nhà máy nhằm hỗ trợ mặt kỹ thuật cho nhà sản xuất để nâng cao chất lượng sản phẩm Tuy nhiên hạn chế sớm giải nước ta gia nhập WTO Khi sản phẩm sữa Việt Nam muốn bán thị trường nước cạnh tranh với sản phẩm nhập loại thị trường nước bắt buộc nhà sản xuất phải đầu tư để đảm bảo nâng cao chất lượng cạnh tranh giá 1.2 Tiêu chuẩn vi sinh vật cho số sản phẩm sữa Giới hạn tối đa vi sinh vật cho phép có mặt sản phẩm sữa khác khác Trong sản phẩm quốc gia khác giới hạn khác Tiªu chn ViƯt nam HiƯn ë ViƯt Nam áp dụng tiêu chuẩn giới hạn vi sinh vật sản phẩm sữa cụ thể bảng sau (theo Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31 tháng 08 năm 2001 Bộ trưởng Bộ Y tế) : Bảng 1.1 Giới hạn ô nhiễm vi sinh vật sản phẩm sữa Việt Nam Sản phẩm ChØ sè Tổng số vi khuẩn hiếu khí a Sữa khô, sữa bột b Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp Pasteur c Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp U.H.T TB/g 5.104 Coliforms 10 E.coli S.aureus Salmonella* Tổng số vi khuẩn hiếu khí 5.104 Coliforms 10 E.coli Salmonella* Tổng số vi khuẩn hiếu khí 10 Coliforms E.coli S.aureus Salmonella* d Sản phẩm chế biến của sữa : Tổng số vi khuẩn hiếu khí 104 bơ, sữa chua, pho- mat, (dựng trc Coliforms 10 68 Hình3.9 Phát Salmonella Hình 3.10 Phát Salmonella mẫu sữa nhiễm chủ động sau 5h mẫu sữa nhiễm chủ ®éng sau 5h ë c¸c mËt ®é kh¸c mËt ®é kh¸c GiÕng 1: 1CFU/25g; GiÕng 2: 3CFU/25g; GiÕng 3: 10 CFU/g; GiÕng 4: MÉu d­¬ng tÝnh; GiÕng 5: mẫu âm tính Kết bảng cho thấy tăng sinh hai loài 4h vạch sản phẩm mờ tính ổn định chưa cao Sau h vạch sản phẩm rõ nét ổn định Vậy chọn thời gian tăng sinh cho loài 5h 3.2.5 Nghiên cứu khả phát B.ceures Salmonella ssp Trong sữa tiệt trùng có sù xt hiƯn cđa c¸c vi sinh vËt kh¸c Trong mẫu sữa tiệt trùng loài vi sinh vật gây hỏng mà có nhiều loài khác gây hỏng, đòi hỏi qui trình phải phát vi sinh vật mục tiêu Theo số tài liệu [] cho thÊy Salmonella Ýt xt hiƯn s÷a trùng, B.ceures thường hay nhiễm sữa trùng Việt Nam, chọn sữa trùng để tiến hành thí nghiệm với Salmonella với B ceures sử dụng mẫu sữa tiệt trùng nhiễm đồng thời B ceures số chủng khác E.coli, staphylococcus, Salmonella, lactobacillus KÕt qu¶ thĨ hiƯn ë hình sau: 68 69 Hình 3.11 Phát Bacillus ceureus Hình 3.12 Phát Salmonella mẫu sữa có chứa Salmonella, sữa trùng nhiễm chủ động Staphylococcus, E.coli Salmonella 69 71 Từ kết cho thấy ®èi víi loµi Salmonella ssp Khi nhiƠm chđ ®éng vµo sữa trùng sau tăng sinh h phát xuất chúng mật độ 1CFU/25ml 3.2.6 Kiểm định phương pháp Với loài B.ceures Thí nghiệm kiểm định tiến hành mẫu sữa trùng với số lưọng mẫu mật độ tế bào B.ceures ban đầu kiểm tra phương pháp trải đĩa môi trường MYP Với Salmonella ssp Thí nghiệm kiểm định tiến hành phân tích mẫu sữa tiệt trùng có nhiễm chủ động Salmonella Kết thể bảng sau: Bảng 3.9 Kết phân tích thử mẫu sữa B.ceures STT Mật độ truyền mÉu nhiƠm ban thèng Salmonella PCR STT MËt ®é trun mẫu nhiễm ban thống đầu đầu (CFU/ (CFU/ml) 25ml) PCR 9.103 + + 0,5 - + 17.10 + + 0,87 + + 54.102 + + 1,25 + + 12.10 + + 1,75 + + 8.10 + + 1,0 + + 71 72 Kết thí nghiệm khiển định cho thấy phương pháp truyền thống qui trình phân tích cho kết tương đồng mẫu salmonella nhiễm chủ động 0,5CFU/ml cho kết âm tÝnh ë phwong ph¸p trun thèng cong ph­ong ph¸p PCR cho kết dương tính điều chứng tỏ phương pháp PCR nhậy phương pháp truyền thống Kết thí nghiệm cho thấy hoàn tòan sử dụng phương pháp phân tích hai laòi vi sinh vật qui trình chế biến sữa UHT 72 73 Chương IV Kết luận Vi sinh vật tổng số sữa tươi nguyên liệu chuẩn bị vào sản xuất tương đối cao khoảng 106 - 107 CFU/ml Trong mẫu sữa bột có chứa lượng nhỏ vi sinh vật đa số chủng Bacillus nên có khả chịu nhiệt tạo bào tử Trong công đoạn sản xuất sữa tiệt trùng vi sinh vật tiếp tục tăng nhiên đảm bảo chất lượng vệ sinh theo TCVN Không phát thấy vi sinh vật sữa UHT thành phẩm đạt chất lượng Các mẫu thành phẩm khơng phù hợp có mật độ vi sinh vật cao (từ 105đến 107CFU/ml) Đã phát thấy có B.cereur, B.sporothermoduran, micrococcus, steptococcus, enterobacteriecea sữa thành phẩm khơng phù hợp Xư lý mÉu b»ng EDTA víi nồng độ 20-25 àM cho khả loại bỏ tạp chất protein cao cặn tế bào Rửa cặn tế bào sau xử lý EDTA đệm cho kết tăng sinh tốt Qui trình phát B.ceures, Salmonella, staphylococcus aureus E.coli sữa tiệt trùng với mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/ml cần 4h tăng sinh 10.Qui trình phát B.ceures, Salmonella sữa tiệt trùng với mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/25ml cÇn 5h 73 74 11.Cã thĨ sư dơng qui trình phát B.ceures, Salmonella sữa tiệt trùng với mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/25ml cho sản phẩm sữa trùnh bán thành phẩm 74 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO Atherton, H.V and W.A Dodge 1970 Milk Under the Microscope Vermont Extension Service, University of Vermont BERTIL PETTERSSON, FRITZ LEMBKE, PHILIPP HAMMER, ERKO STACKEBRANDT 1996 Bacillus sporothermodurans, a New Species Producing Highly Heat-Resistant Endospores INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, July 1996, p 759–764 Vol 46, No 3 Bramley, A.J 1982 Sources of Streptococcus uberis in the dairy herd I Isolation from bovine feces and from straw bedding of cattle J Dairy Res 49:369 Bramley, A.J., C.H McKinnon, R.T Staker and D.L Simpkin 1984 The effect of udder infection on the bacterial flora of the bulk milk of ten dairy herds J Appl Bacteriol 57:317 Bramley, A.J and C.H McKinnon 1990 The microbiology of raw milk pp 163-208 In Dairy Microbiology, Vol Robinson, R.K (ed.) Elsevier Science Publishers, London Candrian U, Furrer B, Hofelein C, Meyer R, Jermini M, Luthy J : Int J Food Microbiol 1991 The polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify DNA sequences from the malB operon of Escherichia coli All E coli strains tested yielded the specific DNA fragment No amplification products were obtained with other Enterobacteriaceae Apr;12(4):339-51 Fenlon, D.R., D.N Logue, J Gunn, and J Wilson 1995 A study of mastitis bacteria and herd management practices to identify their relationship to high somatic cell counts in bulk tank milk Brit Vet J 151:17 Galton, D.M., R.W L.G Petersson, W.G Merrill, D.K Bandler, and D.E Shuster 1984 Effects of premilking udder preparation on bacterial counts, sediment and iodine residue in milk J Dairy Sci 67:2580 75 76 Gehringer, G 1980 Multiplication of bacteria during farm storage In Factors influencing the bacteriological quality of raw milk International Dairy Federation Bulletin, Document 120 10 Gonzalez, R.N., D.E Jasper, R.B Busnell, and T.B Farber 1986 Relationship between mastitis pathogen numbers in bulk tank milk and bovine udder infections J Amer Vet Med Assoc 189:442 11.Hansen M B, Leser T D, Hendriksen N B Polymerase chain reaction assay for the detection of bacillus cereus group cells FEMS Microbiol Lett 202: 209-213.2001 12.Hammer P, Lembke F, Suhren G & W Heeschen Characterization of a heat resistant mesophilic Bacillus species affecting quality of raw milk – a preliminary report Kiel Milchwirtsch Forschungsber 47: 303–311 1995 13 Hogan, J.S., K.L Smith, K.H Hoblet, D.A Todhunter, P.S Schoenberger, W.D Hueston, D.E Pritchard, G.L Bowman, L.E Heider, B.L Brockett and H.R Conrad 1989 Bacterial counts in bedding materials used on nine commercial dairies J Dairy Sci 72:250 14.http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/VSATTP/qddanhmuc/gioihano nhiem.asp 15.http://euro.who.int/document/fos/IsraelMicrostandard.pdf 16.http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/mr/mr03_en.pdf 17.http://wwww.cirad.fr/colloque/fao/pdf/11-faye.pdf 18.http://www.foodscience.cornell.edu/mqip/BACTmilkshelf-life.doc 19.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMe d&list_uids=6468029&dopt=Abstract 20 Jackson, H and F.L Clegg 1965 Effect of preliminary incubation on the microflora of raw bulk tank milk with observ of the microflora of milking equipment J Dairy Sci 48:407 21 Jeffrey, D.C and J Wilson 1987 Effect of mastitis-related bacteria on the total bacteria counts of bulk milk supplies J Soc Dairy Technol 40(2):23 76 77 22 Kurweil, R., and M Busse 1973 Total count and microflora of freshly drawn milk Milchwissenschaft 28:427 23 Richardson, G.H 1985 Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 15th ed American Public Health Association Washington D.C 24.Lê Thanh Mai cộng sự; Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men; NXB KHKT Haf Nooij, 2006 25 MacKenzie, E 1973 Thermoduric and psychrotrophic organisms on poorly cleaned milking plants and farm bulk tanks J Appl Bacteriol 36:457 26 McKinnon, C.H., G.J Rowlands, and A.J Bramley 1990 The effect of udder preparation before milking and contamination from the milking plant on the bacterial numbers in bulk milk of eight dairy herds J Dairy Res 57:307 27.M.C te Giffel1,*, A Wagendorp1, A Herrewegh1 & F Driehuis2 2002 Bacterial spores in silage and raw milk Antonie van Leeuwenhoek 81: 625–630 28 Olson, J.C Jr., and G Mocquat 1980 Milk and Milk Products P.470 In Microbial Ecology of Foods Vol II J.H Silliker, R.P Elliott A.C Baird-Parker, F.L Bryan, J.H Christion, D.S Clark, J.C Olson, and T.A Roberts (eds.) Academic Press, New York, NY 29 Palmer, J 1980 Contamination of milk from the milking environment In Factors Influencing the Bacteriological Quality of Raw Milk International Dairy Federation Bulletin, Doc 120 30 Pankey, J.W 1989 Premilking udder hygiene J Dairy Sci 72:1308 77 78 31 Pasteurized Milk Ordinance 1995 U.S Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Washington D.C 32.Te Giffel MC Isolation, identification and characterization of Bacillus cereus from the dairy environment Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands ISBN 90-5485-694-7 1997 33 Thomas, S.B 1974 The microflora of bulk collected milk-part Dairy Ind Int 39:237 34 Thomas S.B., R.G Druce and K.P King 1966 The microflora of poorly cleansed farm dairy equipment J Appl Bacteriol 29:409 35.Tiêu chuẩn Việt Nam 6264:1997; 6263:1997 36 Tolle, A 1980 The microflora of the udder p In Factors Influencing the Bacteriological Quality of Raw Milk International Dairy Federation Bulletin, Document 120 37 Zehner, M.M., R.J Farnsworth, R.D Appleman, K Larntz, and J.A Springer 1986 Growth of environmental mastitis pathogens in various bedding materials J Dairy Sci 69:1932 78 79 Phụ lục I Cây truy vết sản phẩm không phù hợp Sản phẩm KPH Cấy ríc rắc Trực khuẩn (Rodss) Cầu khuẩn (cocci) Nhuộm gram Phản ứng catalase - + - Bacillus - Actinomyc es - Pseudomona s - Enterobacteria Ph¶n øng catalase + - Bacillus - Actinomy - Micrococci - Staphylococcc i - Steptococci - Pediococci Ph¶n øng oxidase - Lactobaci llus + - Pseudomon as - Enterobacteri aceae - Micrococci - Staphylococ cci 79 80 80 81 81 82 82 ... Góp phần kiểm soát nhiễm tạp vi khuẩn qui trình sản xuất sữa tiệt trùng với mong muốn giảm thiểu tổn thất vi sinh vật nhiễm tạp sữa gây Nội dung luận văn bao gồm vấn đề sau: - Khảo sát vi sinh... số vi sinh vật nhiễm tạp qui trình sản xuất sữa tiệt trùng từ xác định nguồn nhiễm tạp chủng loại có khả nhiễm tạp cao - Xây dựng qui trình ph¸t hiƯn nhanh mét sè chđng vi sinh vËt cã khả nhiễm. .. gây nhiễm tạp qui trình sản xuất sữa tiệt trùng nguyên liệu đặc biệt sữa tươi Như phần đà phân tích có nhiều nguyên nhân gây nhiễm tạp vi sinh vật sữa tươi Vi? ??c hạn chế nguyên 21 22 nhân gây nhiễm