Ly trích DNA
Phn 4Kt qu v tho lun 4.1.Sn phm DNA li trớchLi trớch DNA l mt bc khi u rt quan trng, vỡ nú quyt nh s thnh cụng cho phn ng PCR sau ny. i vi lỏ cacao, vic li trớch gp mt s khú khn do lỏ cacao cú lp ngoi bỡ b cutin húa rt mnh, bờn trong mụ lỏ cha hm lng ln polysaccharide, polyphenol v cỏc sc t khỏc. (Hong Th Liu, 2004). Qui trỡnh li trớch DNA ca chỳng tụi t hiu qu vỡ DNA li trớch cú tinh khit cao, khụng b ln tp DNA l. Vỡ qui trỡnh li trớch ny, trong dch trớch DNA cú cht mercapto cú kh nng phỏ v thnh t bo rt mnh. Bc Rnase s phõn hy RNA cú trong mu li trớch, gúp phn hn ch lng DNA tp tng hp t RNA trong phn ng PCR sau ny. c bit s cú mt ca mui sodium acetate cú kh nng lm bin tớnh enzyme phõn hy DNA. Mt khỏc, bc s dng Chloroform c lp li 2 ln liờn tip kt hp vi li tõm ó loi b ht protein v polysaccharide cú trong mu. Do ú, DNA thu c rt tt, m bo cho phn ng PCR xy ra Kt qu nh lng DNA bng quang ph k cho thy DNA ca cỏc mu em li trớch cú tinh sch tng i cao vi t l OD260nm/OD280nm nm trong khong 1.5 n 2.2 v lng DNA cú trong mi mu trung bỡnh khong 50ng/àl.Hỡnh 4.1: Kt qu in di sn phm li trớch DNA Nhng mu cú t l OD thp, tinh sch khụng cao, chỳng tụi vn cú th chy PCR t kt qu tt bng cỏch x lý nh sau: pha loóng mu 2-3 ln, ri 50 li tâm ở 12000 vòng, trong 5 phút ở 4oC để lắng cặn xuống đáy ống, rồi nhẹ nhàng hút DNA ở khoảng giữa ống để thực hiện phản ứng PCR, trong trường hợp này thể tích DNA trong phản ứng PCR được tăng lên gấp đôi (4µl thay vì 2µl) và giảm thể tích nước đi 2µl. Bước pha loãng mẫu sẽ giúp giảm nồng độ tạp chất còn lẫn trong sản phẩm li trích sau cùng, bước li tâm tiếp theo sẽ giúp thu được DNA tinh sạch với nồng độ thấp ở khoảng giữa ống và không bị lẫn tạp chất đã lắng xuống đáy ống. 4.2.Sản phẩm PCRQui trình PCR cho kết quả ổn định với cả 5 cặp primer. Tuy nhiên primer mTcCIR11 thường cho những band rất mờ do mức độ khuếch đại thấp hơn các primer khác. Vì vậy khi pha trộn mẫu với primer mTcCIR11 cần tăng nồng độ DNA lên gấp đôi. Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer mTcCIR7Qui trình PCR cho kết quả tương đối ổn định. Những mẫu có nồng độ DNA li trích cao sẽ cho kết quả tốt khi chạy multiplex PCR, cho các band điện di sáng, rõ. Do đó khi thực hiện phản ứng multiplex PCR cần tăng nồng độ DNA lên gấp đôi.Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR51 4.3.Dữ liệu Microsatellite để định danh 21 dòng cacaoSản phẩm PCR có thể đưa vào phân tích ngay trên máy giải trình tự DNA mà không cần phải qua bước tinh sạch. Vì kết quả so sánh giữa 2 nghiệm thức tinh sạch và không tinh sạch cho kết quả phân tích như nhau. Do đó sản phẩm PCR không cần phải tinh sạch trước khi phân tích để giảm tốn kém. Ngoài ra để giảm thời gian (1 giờ cho mỗi 16 giếng trên đĩa) và hóa chất phân tích (size standard và hidi formamide), chúng tôi tiến hành trộn 3 sản phẩm PCR riêng biệt (0.5µl/1sản phẩm) với cùng một lượng size standard và hidi formamide như với 1 sản phẩm. Điều này giúp giảm chi phí xuống 3 lần mà vẫn cho kết quả phân tích tốt. Những mẫu có sản phẩm PCR không xuất hiện band nào trên gel điện di hoặc band điện di quá mờ vẫn có thể cho kết quả khi phân tích trên máy giải trình tự DNA bằng cách tăng lượng mẫu PCR lên gấp đôi (1µl thay vì 0.5µl) trong hỗn hợp mang điện di.Trong trường hợp không nhận được kết quả khi phân tích microsatellite (No data), chúng tôi tiến hành hoàn thiện phản ứng bằng cách nâng lượng mẫu trong phản ứng PCR lên gấp đôi (4µl thay vì 2µl). Do đó chúng tôi thu được kết quả phân tích của tất cả các mẫu với 5 primer.Kết quả phân tích 21 dòng cacao khảo sát với 5 cặp pimer được tóm tắt ở 2 bảng 4.1 và 4.2 với các cặp al đặc trưng sau khi đã loại trừ những allele dropping (xem trang 54). Từ kết quả này, chúng tôi nhận thấy 5 primer sử dụng có thể phân biệt được 21 kiểu gen khác nhau. Với đặc tính đồng trội (codominant), những cặp al khác nhau được gọi là dị hợp (VD: al 235- al 250), còn những cặp al giống nhau được gọi là đồng hợp (VD: al 288- al 288).Dựa vào 2 bảng dữ liệu dưới đây chúng tôi có thể định danh được 21 dòng cacao khảo sát dựa vào đặc điểm microsatellite của chúng cũng như xây dựng được bảng dữ liệu microsatellite của 21 dòng cacao phục vụ cho công tác định danh và phân tích đa dạng di truyền.52 Bảng 4.1: Dữ liệu microsatellite thu được với 3 primerThứ tự Tên dòngmTcCIR 8 mTcCIR 11 mTcCIR 15A1 A2 A1 A2 A1 A21 BAL 209 288 290 298 305 252 2542 BAL 244 292 292 295 314 244 2463 BR 25 302 305 298 308 235 2444 KKM 225 286 286 295 298 235 2445 PBC 123 288 290 295 305 235 2506 PBC 154 288 305 298 305 232 2527 PBC 157 288 302 295 305 235 2508 PBC 159 288 302 298 305 235 2449 PBC 230 286 288 305 314 235 25010 PBC 236 290 290 298 305 235 25011 QH 1213 288 290 295 298 252 25412 QH 22 288 302 295 298 232 25213 QH 441 288 288 295 295 232 25214 CT1 288 288 141 314 248 25015 CT3 288 290 141 305 244 24816 CT4 269 269 150 150 242 25217 CT5 288 294 305 314 244 24818 CT6 288 288 288 314 252 25219 CT7 286 294 141 314 248 25020 CT8 288 288 288 288 248 25021 CT9 286 286 150 314 248 250Bảng 4.2: Dữ liệu microsatellite thu được với 2 primerThứ tự Tên dòngmTcCIR 7 mTcCIR 18A1 A2 A1 A21 BAL 209 155 157 344 3462 BAL 244 157 157 337 3443 BR 25 153 155 331 3444 KKM 225 153 155 331 3465 PBC 123 155 157 331 3426 PBC 154 153 157 342 3447 PBC 157 155 157 331 3468 PBC 159 155 157 331 3469 PBC 230 155 157 331 34210 PBC 236 153 157 342 34411 QH 1213 153 157 344 34612 QH 22 153 157 342 34413 QH 441 157 157 342 34414 CT1 153 153 335 34415 CT3 153 157 333 34416 CT4 153 157 333 33517 CT5 153 157 333 33518 CT6 155 157 344 34419 CT7 153 153 342 34220 CT8 153 153 342 34221 CT9 153 153 335 34253 Allele droppingAllele dropping là những al chỉ xuất hiện 1 lần trong 3 lần lặp lại thí nghiệm. Đó là những al xuất hiện không ổn định, có thể do nồng độ mẫu quá thấp, hoặc bị tạp nhiễm với 1 kiểu gen khác trong quá trình thí nghiệm, hoặc do việc thêm vào một nucleotid adenosine (A) vào đầu 3’ của đoạn DNA khuếch đại (Smith et al., 1996), hoặc do lỗi phân tích của máy ABI 3100. Những al đó cần được ghi nhận để loại bỏ trong những lần phân tích sau.Trong quá trình thí nghiệm, một số mẫu được lặp lại 2-3 lần với cùng một primer để tìm nồng độ pha loãng thích hợp và để định danh lại mẫu mã hóa. Từ đó, chúng tôi ghi nhận được sự xuất hiện allel dropping của một số dòng như sau: Dòng PBC 159 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15: al 246. Dòng PBC 154 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15:al 244. Dòng PBC 154 có 1 allele dropping với primer mTcCIR18:al 331. Dòng BAL 209 có 1 allele dropping với primer mTcCIR18:al 331.Có 6 mẫu dưới đây chỉ mới lặp lại thí nghiệm 2 lần, do đó cần lặp lại thí nghiệm một lần nữa để khẳng định allele dropping, bao gồm: Dòng BAL 209 có 1 allele dropping với primer mTcCIR11: al 295. Dòng PBC 123 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15: al 244. Dòng QH 441 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15: al 244. Dòng QH 441 có 1 allele dropping với primer mTcCIR11: al 298 Dòng BAL 244 có 1 allele dropping với primer mTcCIR11: al 150. Dòng QH 1213 có 2 allele dropping với primer mTcCIR15: al 235, al 244. Al dropping 246 54 Hình 4.4: Giống PBC 159 có 1 allele dropping 246 với primer mTcCIR15.4.4.Kết quả nhận diện các mẫu được mã hóaVới dữ liệu microsatellite của 3 primer mTcCIR15, mTcCIR18 và mTcCIR8 (bảng 3.7), chúng tôi tiến hành định danh bằng cách phân tích mức độ đồng nhất di truyền giữa 13 mẫu mã hóa với 13 dòng cacao tương ứng với chúng bằng phần mềm Cervus dựa trên các chỉ tiêu sau: 3 loci được đưa vào phân tích. Có ít nhất 2 loci có al hoàn toàn giống nhau. Số loci sai khác cho phép là 1.Sự chênh lệch giữa số lượng loci đưa vào phân tích và số loci giống nhau càng cao thì kết quả phân tích mức độ đồng nhất di truyền có độ tin cậy càng cao, hay kết quả định danh sẽ càng chính xác và ngược lại. Còn nếu số loci sai khác càng cao thì độ tin cậy của kết quả càng thấp, việc định danh do vậy cũng không chính xác.Hình 4.5: Các chỉ tiêu để kiểm tra mức độ đồng nhất di truyền 55 Kết quả phân tích cho ra 10 cặp cá thể đồng nhất di truyền thỏa mãn các chỉ tiêu trên, đồng thời cũng là kết quả nhận diện hay định danh tương ứng với 10 mẫu mã hoá. Kết quả định danh có độ chính xác cao do hoàn toàn không có loci sai khác (mismatching loci bằng 0). Bảng 4.3: Kết quả nhận diện trong phần mềm Cervus**** Parameters ****Number of loci: 3Minimum number of loci needed for match: 2Number of mismatching loci allowed: 1**** Genotype matches ****The following individuals had matching genotypes in the genotype file:ID1 Loci typed ID2 Loci typed Matching loci Mismatching lociBAL209 3 A10 3 3 0 BR25 3 A9 3 3 0 KKM225 3 A5 3 3 0 PBC154 3 A12 3 3 0 PBC157 3 A11 3 3 0 ]PBC159 3 A8 3 3 0 PBC230 3 A13 3 3 0 PBC236 3 A6 3 3 0 QH1213 3 A7 3 3 0 QH22 3 A4 3 3 0 TOTAL: 10Còn lại ba mẫu mã hóa A2, A3, A14 và 3 dòng cacao là BAL 244, PBC 123 và QH441 chưa được nhận diện. Kết quả phân tích microsatellite cho thấy:- Dữ liệu microsatellite với 3 primer mTcCIR18, mTcCIR15, mTcCIR8 của mẫu A2 và BAL244 hoàn toàn giống nhau với 2 loci của primer mTcCIR18 và mTcCIR8, chúng chỉ khác nhau ở 1 loci của primer mTcCIR15: mẫu A2 bị thiếu mất một al 246 (xem phụ lục trang 65 ).- Dữ liệu microsatellite với 3 primer mTcCIR18, mTcCIR15, mTcCIR8 của mẫu A3 và PBC123 hoàn toàn giống nhau với 2 loci của primer mTcCIR18 56 và mTcCIR8, chúng chỉ khác nhau ở 1 al của loci xác định bởi loci của primer mTcCIR15:al 250 là al đặc trưng của mẫu A3, nhưng ở mẫu PBC123 thì al 250 không phải là al đặc trưng mà thay vào đó là al 244 (xem phụ lục trang 66).- Dữ liệu microsatellite với 3 primer mTcCIR18, mTcCIR15, mTcCIR8 của mẫu A14 và QH441 hoàn toàn giống nhau với 2 loci của primer mTcCIR18 và mTcCIR8, chúng chỉ khác nhau ở 1 al của loci xác định bởi primer mTcCIR15: al 252 là al đặc trưng của mẫu A14, nhưng ở mẫu QH441 thì al 252 không phải là al đặc trưng mà thay vào đó là al 244 (xem phụ lục trang 77).Sự sai khác ở 1 al như trên là do hiện tượng allele dropping xảy ra trong quá trình phân tích trình tự microsatellite. Tuy có sự sai khác ở 1 al nhưng kết quả phân tích trên đủ để kết luận mẫu A2 mã hóa cho dòng cacao BAL244, mẫu A3 mã hóa cho dòng cacao PBC123, và mẫu A14 mã hóa cho dòng cacao QH441.Bảng 4.4: Kết quả nhận diện các mẫu mã hóaGiống lấy mẫu Mẫu mã hóa Giống nhận diện Đánh giá kết quảBAL 244PBC 123QH 22KKM22PBC 236QH 1213PBC 159BR 25BAL 209PBC 157PBC 154PBC 230QH 441A2A3A4A5A6A7A8A9A10A11A12A13A14BAL 244PBC 123QH 22KKM225PBC 236QH 1213PBC 159BR 25BAL 209PBC 157PBC 154PBC 230QH 441Sai khác 1 alSai khác 1 alChính xácChính xácChính xácChính xácChính xácChính xácChính xácChính xácChính xácChính xácSai khác 1 alViệc định danh này không sử dụng sự hỗ trợ của việc nhận diện kiểu hình nhưng trên thực tế việc định danh luôn có sự hỗ trợ bằng cách nhận diện kiểu hình dựa vào 57 kinh nghiệm (như nhận diện qua hình dạng, màu sắc của hoa, quả) nên sẽ đơn giản và thuận tiện hơn. Nhưng lợi thế của phương pháp định danh bằng microsatellite là có thể áp dụng từ giai đoạn cây con còn đang được ươm trong nhà lưới, chưa có hoa hay quả để giúp cho việc nhận diện bằng kiểu hình. Uu điểm của việc định danh từ giai đoạn cây con là giúp loại bỏ kịp thời những cây bị nhầm lẫn giống trước khi đem ra vườn trồng.4.5. So sánh dữ liệu microsatellite Khi so sánh dữ liệu microsatellite của 3 giống cacao NA33, AMAZ15/15, PA107 tại vườn sưu tập giống cacao, Đại Học Nông Lâm, với dữ liệu tương ứng của chúng trên ngân hàng cacao thế giới ICGD chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt ở ít nhất 2 primer (được trình bày ở 3 bảng 4.4, 4.5 và 4.6). Như vậy 3 giống cacao NA33, AMAZ15/15, PA107 trong bộ sưu tập giống cacao của Đại Học Nông Lâm và Ngân hàng cacao thế giới ICGD không giống nhau, có thể do nguồn gốc lai tạo khác nhau. Tuy nhiên, kết quả này cũng cho thấy phương pháp và kỹ thuật phân tích của chúng tôi đúng với phương pháp phân tích microsatellite của ngân hàng cacao thế giới. Điều này sẽ hỗ trợ cho việc so sánh sự đa dạng di truyền giữa các giống cacao tại Đại Học Nông Lâm với các giống cacao trên thế giới dựa trên dữ liệu về Microsatellite.Bảng 4.5: Dữ liệu microsatellite của giống NA33NA33- ICGDNA 33Kết quả thí nghiệmKết quả trong cơ sở dữ liệu ICGDPrimer 8 290 290 289 293Al đồng hợp Al dị hợpPrimer11 295 305 305 305Al dị hợp Al đồng hợpPrimer 18 333 342 333 343Al dị hợp Al dị hợpBảng 4.6: Dữ liệu microsatellite của giống AMAZ15/1558 AMAZ15/15- ICGDAMAZ15/15 Kết quả thí nghiệmKết quả trong cơ sở dữ liệu ICGDPrimer 8 288 292 289 293Al dị hợp Al dị hợpPrimer15 244 254 245 257Al dị hợp Al dị hợpPrimer 18 333 346 340 340Al dị hợp Al đồng hợpBảng 4.7: Dữ liệu microsatellite của giống PA107PA107-ICGD PA107Kết quả thí nghiệmKết quả trong cơ sở dữ liệu ICGDPrimer 8244 244 242 242Al đồng hợp Al đồng hợpPrimer18 337 346 337 347Al dị hợp Al dị hợp4.6.Kết quả phân tích multiplex PCRMột trong các lợi thế của kỹ thuật microsatellite thực hiện trên máy giải trình tự là có thể thực hiện cùng lúc nhiều phản ứng PCR, hoặc cùng lúc điện di nhiều sản phẩm PCR nhưng thiết bị vẫn có thể nhận diện từng sản phẩm. Lợi thế này cho phép sự kết hợp thực hiện cùng lúc nhiều phản ứng PCR hay multiplex PCR để giảm chi phí hóa chất và thời gian thí nghiệm. Phản ứng multiplex PCR được thực hiện với 3 primer có cùng nhiệt độ bắt cặp 46oC và có màu huỳnh quang khác nhau: mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15.Kết quả phân tích microsatellite của sản phẩm multiplex PCR giúp phân biệt nhanh chóng những mẫu có kết quả giống nhau ở 1 đến 2 cặp primer. Ví dụ 2 mẫu QH441 và BAL244 có kết quả giống nhau với primer mTcCIR8 nhưng có thể phân biệt chúng dễ dàng vì kết quả của 2 primer còn lại khác nhau. Do đó chỉ cần 1 lần phân tích thay vì 3 lần với 3 primer riêng biệt. Quan trọng nhất là kết quả này có hiệu quả kinh tế cao, vì giúp giảm chi phí cho cả giai đoạn PCR lẫn giai đoạn phân tích microsatellite. 59 . lỏ cha hm lng ln polysaccharide, polyphenol v cỏc sc t khỏc. (Hong Th Liu, 2004). Qui trỡnh li trớch DNA ca chỳng tụi t hiu qu vỡ DNA li trớch cú tinh. b ht protein v polysaccharide cú trong mu. Do ú, DNA thu c rt tt, m bo cho phn ng PCR xy ra Kt qu nh lng DNA bng quang ph k cho thy DNA ca cỏc mu em