Định danh nấm Phytophthra spp

Định danh nấm Phytophthra spp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * NGUYỄN HUỲNH HOÀNG MINH ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN HUỲNH HOÀNG MINH KS. TRỊNH THỊ PHƢƠNG VY KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY * * * * * IDENTIFYING Phytophthora spp. BY MOLECULAR TECHNOLOGIES GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: PhD. LE DINH DON NGUYEN HUYNH HOANG MINH Bs. TRINH THI PHUONG VY TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 iv LỜI CẢM ƠN - Em xin chân thành gửi lời cảm ơn của mình đến cán bộ giáo viên Trường Đại Học Nông Lâm, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này. - Em rất biết ơn sự hướng dẫn của thầy Tiến sĩ Lê Đình Đôn, Kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy, Kỹ sư Nguyễn Văn Lẫm đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thợc hiện đề tài. - Cảm ơn thầy cô, anh chị giảng viên Phòng Công Nghệ Sinh Học – Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài. - Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn thực tập đề tài tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, đặc biệt là các bạn nhóm Bảo Vệ Thực Vật trong thời gian qua đã tận tình giúp đỡ. - Cảm ơn tập thể lớp Công nghệ sinh học khóa 28 đã cùng tôi chia sẽ những kỉ niệm buồn vui trong suốt thời gian bốn năm học vừa qua. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006 Sinh viên Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh v TÓM TẮT Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh, Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. “ ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ”. Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn KS. Trịnh Thị Phương Vy Nấm Phytophthora được xem là một trong những tác nhân nguy hiểm hàng đầu cho nền kinh tế nông nghiệp nước ta hiện nay. Dựa trên một số kết quả đạt được từ những nghiên cứu trước đây về hình thái và sinh thái của giống nấm này, chúng tôi đã đề nghị qui trình định danh giống nấm này trên cơ sở cấu trúc di truyền của chúng. Mục đích của đề tài bao gồm việc sử dụng kỹ thuật PCR, kỹ thuật giải trình tự nhằm khuếch đại và xác định vùng trình tự đặc trưng ITS1- 5,8S- ITS2. Kết quả của đề tài tạo cơ sở cho những nghiên cứu điều tra và kiểm soát mầm bệnh Phytophthora ở nước ta. Sau khi thực hiện toàn bộ qui trình, chúng tôi thu được một số kết quả sau: - Sản phẩm khuếch đại trong vùng ITS1- 5,8S- ITS2 của hai mẫu nấm trên tiêu Bà Rịa và sầu riêng Đồng Nai là 900 bp. Trong khi sản phẩm khuếch đại của hai mẫu nấm trên địa lan cho band 800 bp hoặc 900 bp hoặc cả hai band trên. - Kết quả giải trình tự hai mẫu nấm trên địa lan cho thấy trình tự của toàn vùng ITS1- 5,8S- ITS2 khoảng 800 bp. Trong đó vùng ITS1 khoảng 225 bp; vùng 5,8S là 160 bp và vùng ITS2 là 420 bp. vi MỤC LỤC .o0o . Trang Lời cảm ơn iv Tóm tắt . v Mục lục . vi Danh mục các hình ix Danh mục các bảng x Danh sách các chữ viết tắt xi 1. Giới thiệu . 1 1.1 Đặt vấn đề 2 1.2 Mục đích – yêu cầu của đề tài . 2 1.2.1 Mục đích của đề tài . 2 1.2.2 Yêu cầu của đề tài . 2 1.2.3 Giới hạn của đề tài 2 1.2.4 Đối tượng của đề tài . 2 2. Tổng quan 3 2.1 Giới thiệu về giống Phytophthora . 3 2.1.1 Cây tiến hoá của Phytophthora 4 2.1.2 Chu kì sống của Phytophthora . 4 2.1.3 Phân lập Phytophthora từ các bôl phận nhiễm bệnh của cây . 5 2.1.4 Một số môi trường phân lập Phytophthora từ mô bệnh . 6 2.1.5 Đặc điểm hình thái của giống Phytophthora 6 2.1.6 Phân biệt nấm Pythium và nấm Phytophthora . 7 2.2 Một số bệnh Phytophthora được nghiên cứu tại Việt Nam 7 2.2.1 Cà chua và khoai tây . 8 2.2.2 Khoai sọ 8 2.2.3 Dứa . 8 2.2.4 Họ cam chanh . 8 2.2.5 Sầu riêng 9 vii 2.2.6 Mận . 9 2.2.7 Cao su . 10 2.3 Các kỹ thuật phát hiện và định danh Phytophthora 11 2.3.1 Kỹ thuật quan sát hình thái trên môi trường nuôi cấy 11 2.3.2 So sánh sự tương xứng giữa sinh sản và sinh dưỡng . 12 2.3.3 Kỹ thuật protein profile 12 2.3.4 Isozyme . 13 2.3.5 Huyết thanh học và kit chuẩn đoán 13 2.3.6 Kỹ thuật RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ) . 14 2.3.7 Kỹ thuật probe acid nucleic, DNA fingerprinting . 14 2.3.8 Sự lai DNA-DNA . 15 2.3.9 Kỹ thuật PCR và RAPD . 15 2.4 Một số công trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora 15 2.4.1 Một số công trình nghiên cứu ngoài nước 15 2.4.2 Công trình nghiên cứu trong nước 17 2.5 Một số lưu ý trước khi thực hiện thí nghiệm . 18 2.5.1 Sơ lược về trình tự ITS . 18 2.5.2 Danh mục các loài Phytophthora được tìm thấy ở Việt Nam 19 3. Vật Liệu và phương pháp 21 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 21 3.1.1 Thời gian thực hiện . 21 3.1.2 Địa điểm thực hiện . 21 3.2 Vật liệu và hoá chất . 21 3.2.1 Tăng sinh và nhân sinh khối 21 3.2.2 Ly trích DNA 22 3.2.3 Điện di 22 3.2.4 Kỹ thuật PCR 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu . 23 3.3.1 Tăng sinh và nhân sinh khối . 23 3.3.2 Ly trích DNA 24 3.3.3 Kỹ thuật PCR 26 3.3.4 Kỹ thuật giải trình tự 28 viii 3.3.5 Xử lý kết quả giải trình tự 29 4. Kết quả và thảo luận 30 4.1 Quá trình tăng sinh và nhân sinh khối . 30 4.2 Quá trình ly trích 30 4.3 Quá trình PCR . 31 4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 35 4.5 Xử lý kết quả giải trình tự . 36 5. Kết luận và đề nghị 44 6. Tài liệu tham khảo . 45 7. Phụ lục . 47 ix Danh sách các hình Hình 2.1. Chu kì sống của Phytophthora 4 Hình 2.2. Một số bệnh do Phytophthora gây ra trên một số cây trồng . 10 Hình 2.3. Vùng trình tự ITS trong DNA ribosome . 18 Hình 4.1. Sản phẩm của qui trình 1 . 31 Hình 4.2. Sản phẩm của qui trình ly trích 2 31 Hình 4.3. Thang nồng độ DNA chuẩn . 32 Hình 4.4. Kết qủa phản ứng PCR 33 Hình 4.5. Sản phẩm PCR lần thứ hai . 34 Hình 4.6. Mẫu tinh sạch dùng cho phản ứng giải trình tự . 36 Hình 4.7. Cây phát sinh loài của hai mẫu địa lan 40 x Danh sách các bảng Bảng 2.1. Cây tiến hoá của nấm Phytophthora………………………………… 4 Bảng 2.2. Danh mục các loài nấm Phytophthora được tìm thấy ở Việt Nam . 19 Bảng 3.1. Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 l . 26 Bảng 3.2.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 l 27 Bảng 3.3.Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR . 27 Bảng 4.1. Các nguồn nấm trên ngân hàng gen được dùng để so sánh . 37 Bảng 4.2. So sánh trình tự nucleotide vùng ITS của hai mẫu DL1, DL2 . 38 Bảng 4.3. Kết quả so sánh từng vùng trên đoạn ITS1- 5,8S- ITS2 . 40 Bảng 4.4. Trình tự vùng gen (ITS1-5.8S-ITS2) của mẫu Phytophthora địa lan 42 [...]... phân tử DNA của các loài nấm từ đó cho phép việc định danh chúng một cách chính xác hơn Với sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và được sự hướng dẫn của Tiến Sĩ Lê Đình Đôn, Kỹ Sư Trịnh Thị Phương Vy ( Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật- Khoa Nông Học) Chúng tôi đã thực hiện đề tài ” ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ” nhằm hoàn thiện qui trình định danh nấm Phytophthora bằng... yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục đích của đề tài Định danh nấm Phytophthora.bằng các kỹ thuật sinh học phân tử Cụ thể là sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5 để khuếch đại vùng ITS1 và ITS2 trong ribosomal DNA của nấm Phytophthora Sau đó dùng kỹ thuật đọc trình tự để định danh các mẫu nấm trên 1.2.2 Yêu cầu của đề tài - Tăng sinh, nhân sinh khối các mẫu nấm Phytophthora trên nhiều loại cây trồng... cặp mồi ITS4 và ITS5 - Sử dụng kỹ thuật đọc trình tự để định danh các mẫu nấm đã phân lập ở trên 1.2.3 Giới hạn của đề tài Đề tài chỉ thực hiện được trên các mẫu nấm phân lập được ở một số cây trồng thuộc vùng Đông Nam Bộ Do đó, đề tài chỉ định danh được ở một mức độ giới hạn các loài nấm Phytophthora ở Việt Nam 1.2.4 Đối tƣợng của đề tài Các mẫu nấm được lấy từ nhiều loại cây khác nhau như: Tiêu, Sầu... dứa do P.nicotianae 2.3 Phát hiện và định danh Phytophthora Hiện nay để phát hiện Phytophthora, người ta dựa trên nhiều kỹ thuật khác nhau 2.3.1 Kỹ thuật quan sát những đặc điểm về hình thái của Phytophthora trên môi trƣờng nuôi cấy Đây được xem là kỹ thuật định danh cơ bản bởi vì nó xuất hiện sớm và được sử dụng rộng rãi trong quá trình phân lập, định danh các loài nấm cũng như vi khuẩn gây bệnh Những... vấn đề: Nấm Phytophthora được xem là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho cây do sức tàn phá mãnh liệt của nó Nó gây ra những căn bệnh như: bệnh thối rễ, thối lỡ cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá, thối trái và đặc biệt nguy hiểm là bệnh mốc sương trên khoai tây Việc phân lập và định danh nấm Phytophthora để tìm ra các phương cách phòng trừ hữu hiệu là một nhu cầu cấp thiết Hiện nay, người ta chỉ định danh được... probe acid nucleic, DNA fingerprinting và Molecular karyotyping Sử dụng DNA như probe phân tử để xác định các loài nấm bệnh Một đoạn DNA giới hạn được clone dòng và được dùng để xác định ở cấp độ loài nấm P.parasitica ( Goodwin và cộng sự, 1989) Hiệu quả của các probe acid nucleic khi 14 xác định các loài nấm phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau bao gồm cả mức độ đa dạng di truyền hiện diện trong các loài... các band DNA cho phép xác định sự đa dạng giữa chúng 15 2.4 Một số công trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora 2.4.1 Một số công trình nghiên cứu ngoài nƣớc: Sử dụng cặp mồi ITS để khuếch đại vùng ITS trên nấm Phytopthora Sản phẩm PCR đem đi phân tích mối quan hệ di truyền với hơn 35 loài bằng ba enzyme cắt AluI, TaqI, MspI hoặc được giải trình tự để so sánh với 17 loài nấm Phytophthora khác bằng... diện của một dòng 7 phân lập mọc đối trên cùng môi trường.Việc xác định loài nấm thuộc nhóm đồng tản hay dị tản phụ thuộc vào túi bào tử đực của chúng là amphigynuos (túi giao tử đực nằm quanh thân túi noãn) hay paragynuos (túi giao tử đực nằm tiếp theo túi noãn) 2.1.6 Phân biệt nấm Pythium và nấm Phytophthora Khi phân lập các loài nấm Phytophthora, một trong những vi sinh vật mà chúng ta thường đối... Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 3.2 Vật liệu và hóa chất: Chúng tôi tiến hành tăng sinh nhân sinh khối 2 mẫu nấm Phytophthora phân lập trên sầu riêng Đồng Nai, tiêu Bà Rịa và 2 mẫu nấm Phytophthora trên địa lan Đà Lạt của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy Các mẫu nấm này đã được định danh bằng kỹ thuật quan sát hình thái 3.2.1 Phục hồi và nhân sinh khối Vật liệu và hóa chất a Đường Glucose Agar Khoai... 1210C/ 1atm / 20 phút Cách cấy nấm sang môi trường nhân sinh khối - Sử dụng đĩa petri mang các khuẩn lạc nấm có đường kính 4 – 5 mm - Cắt nhỏ ( băm nhuyễn ) rìa mép tản nấm - Cấy mẫu nấm đã được băm nhuyễn sang bình chứa môi trường cà rốt Sau khi cấy, những bình nhân sinh khối phải được ủ tối từ 7 đến 10 ngày trong điều kiện nhiệt độ phòng, tĩnh lặng Quá trình thu sinh khối: mẫu nấm sau khi nhân sinh khối . thực hiện đề tài ” ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ” nhằm hoàn thiện qui trình định danh nấm Phytophthora bằng các. phân lập và định danh nấm Phytophthora để tìm ra các phương cách phòng trừ hữu hiệu là một nhu cầu cấp thiết. Hiện nay, người ta chỉ định danh được khoảng