Nghiên cứu và thu nhận β glucosidase tái tổ hợp

NGUYỄN VŨ HOÀI PHƯƠNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN VŨ HOÀI PHƯƠNG NGHIÊN CỨU VÀ THU NHẬN β-GLUCOSIDASE TÁI TỔ HỢP CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2009 Hà Nội – 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN VŨ HOÀI PHƯƠNG NGHIÊN CỨU VÀ THU NHẬN β-GLUCOSIDASE TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM Hà Nội – 2011 Đại học Bách khoa Hà Nội MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT T 3T DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ T T DANH MỤC CÁC BẢNG T 3T MỞ ĐẦU T 3T CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU T T 1.1 Cấu tạo β-glucosidase T T 1.1.1 Cấu trúc β–glucosidase T T 1.1.2 Khối lượng phân tử T T 1.2 Cơ chế xúc tác β-glucosidase T T 1.3 Một vài đặc tính β-glucosidase 12 T T 1.3.1 Tính đặc hiệu chất 12 T T 1.3.2 Nhiệt độ pH hoạt động β-glucosidase 15 T T 1.3.3 Sự kìm hãm đường glucose 17 T T 1.3.4 Ảnh hưởng etanol tới hoạt độ β-glucosidase 18 T T 1.4 Các nguồn thu β-glucosidase 18 T T 1.5 Thu nhận β-glucosidase tái tổ hợp 20 T T 1.5.1 Gen mã hóa β-glucosidase 20 T T 1.5.2 Hệ thống biểu 23 T 3T 1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp β-glucosidase 25 T T 1.6 Tách tinh enzym 27 T T 1.7 Ứng dụng β-glucosidase 28 T T 1.7.1 Ứng dụng công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học 28 T T i Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách khoa Hà Nội 1.7.2 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 30 T T 1.7.3 Ứng dụng công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 31 T T 1.7.4 Ứng dụng công nghệ sử lý rác thải sản xuất phân bón 31 T T CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 T T 2.1 Vật liệu nghiên cứu 33 T 3T 2.1.1 Chủng vi sinh vật 33 T 3T 2.1.2 Hóa chất 33 T 3T 2.1.3 Thiết bị 33 T 3T 2.1.4 Môi trường nuôi 34 T 3T 2.2 Phương pháp nghiên cứu 35 T T 2.2.1 Hoạt hóa chủng 35 T 3T 2.2.2 Xác định điều kiện cho sinh tổng hợp β-glucosidase cao 35 T T 2.2.3 Xác định hoạt độ β-glucosidase 35 T T 2.2.4 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 37 T T 2.2.5 Xác định đường khử phương pháp DNS 38 T T 2.2.6 Tách thu chế phẩm β-glucosidasetừ canh trường nuôi 38 T T 2.2.7 Cô đặc dịch kỹ thuật lọc dòng ngang (bộ lọc 10kDa) 39 T T 2.2.8 Kết tủa β-glucosidase etanol 39 T T 2.2.9 Điện di protein gel polyacrylamide 39 T T PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 T T 3.1 Xác định điều kiện sinh tổng hợp β-glucosidase từ P.pastoris 2.2 cho hoạt độ T cao 42 3T 3.1.1 Đặc điểm nuôi cấy 42 T 3T 3.1.2 Ảnh hưởng lượng giống cấy truyền 42 T T ii Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách khoa Hà Nội 3.1.3 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi 43 T T 3.1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi 44 T T 3.1.5 Ảnh hưởng nồng độ metanol 45 T T 3.2 Nghiên cứu tách, tinh β-glucosidase tái tổ hợp 48 T T 3.2.1 Cô đặc kỹ thuật lọc dòng ngang (10 kDa) 48 T T 3.2.2 Xác định nồng độ etanol kết tủa phân đoạn β-glucosidase 49 T T 3.3 Nghiên cứu số đặc tính β-glucosidase tái tổ hợp 54 T T 3.3.1 Tính đặc hiệu chất đặc tính xúc tác chế phẩm β-glucosidase từ T chủng P.Pastoris 2.2 54 3T 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 55 T T 3.3.3 Ảnh hưởng pH 57 T 3T 3.3.4 Ảnh hưởng ion kim loại 58 T T 3.3.5 Ảnh hưởng nồng độ glucose 59 T T 3.3.6 Ảnh hưởng etanol 60 T T KẾT LUẬN 63 T 3T KIẾN NGHỊ 64 T 3T TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 T 3T iii Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách khoa Hà Nội CÁC CHỮ VIẾT TẮT - CMC: Carboxyl-methyl cellulose - DNS: Dinitro salicylic - P-NPG: p-nitrolphenyl-β- D-glucopyranozit - kDa: Kilodalton - MW: Molecular Weight - SDS: Sodium Dodecyl Sulfate - DTT: dithio threitol - P-CMB: P-chloromercuribenzoic acid - 43T EDTA: etilendiamin tetraaxetic acid 43T 43T - BMGY: Buffered Glycerol-complex Medium - BMMY: Buffered Metanol-complex Medium Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách khoa Hà Nội DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 2.1 Đường chuẩn p-NPG 36 U T T U Hình 2.2: Đường chuẩn xác định hàm lượng protein 37 U T T U Hình 2.3: Đường chuẩn glucose 38 U T T U Hình 3.1:Hình thái khuẩn lạc tế bào P.Pastoris 2.2 sau 24h nuôi cấy 42 U T T U Hình 3.2: Ảnh hưởng mật độ giống cấy truyển đến khả biểu 43 U T T U Hình 3.3: Ảnh hưởng pH đến khả biểu β-glucosidase U T P.pastoris 2.2 44 3T U Hình 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi đến biểu β-glucosidase U T P pastoris 2.2 (canh trường 96 giờ) 45 T U Hình 3.5: Ảnh hưởng nồng độ MeOH đến biểu β-glucosidase P U T pastoris 2.2 (canh trường 96 giờ) 46 T U Hình U T 3.6: Động thái trình sinh tổng hợp β-glucosidase P pastoris 2.2 47 3T U Hình 3.7: Kết điện di protein gel SDS-PAGE 51 U T T U Hình 3.8: Sơ đồ quy trình thu nhận chế phẩm kỹ thuật β-glucosidase từ chủng nấm U T men Pichia pastoris 2.2 53 3T U Hình 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả xúc tác β-glucosidase 55 U T T U Hình 3.10: Ảnh hưởng nhiệt độ tới độ bền nhiệt β-glucosidase 56 U T T U Hình 3.11 : Ảnh hưởng pH đến hoạt tính β-glucosidase 57 U T T U Hình 3.12: Độ bền pH β-glucosidase 58 U T T U Hình 3.13: Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt tính β-glucosidase 59 U T T U Hình 3.14: Ảnh hưởng glucose tới khả xúc tác chế phẩm 60 U T T U Hình 3.15 : Ảnh hưởng nồng độ etanol đến hoạt tính β-glucosidase 61 U T T U Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách khoa Hà Nội DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Enzym β-glucosidase tái tổ hợp từ nguồn khác 20 U T T U Bảng 2.1: Thành phần gel polyacrylamide 40 U T T U Bảng 3.1: Thu nhận β-glucozidase lọc dòng ngang 49 U T T U Bảng 3.2: Ảnh hưởng nồng độ cồn đến khả thu hồi β-glucosidase 50 U T T U Bảng 3.3 : Kết tách tinh enzym 50 U T T U Bảng 3.4: Khả phân cắt chất chế phẩm β-glucosidase 55 U T T U Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Mở đầu MỞ ĐẦU Thế hệ nhiên liệu sinh học dựa đường, tinh bột dầu thực vật, 10T khơng có ứng dụng rộng rãi cơng nghiệp ngun vật liệu sử dụng làm thức ăn Lignocellulose xem hệ nhiên liệu sinh học thứ hai nguồn sinh khối dồi rẻ tiền Nó có mặt chế phẩm 10T nơng nghiệp (rơm rạ), phụ phẩm công nghiệp sản xuất giấy, công nghiệp chế biến gỗ (mùn cưa), công nghiệp thực phẩm (bã mía) Sinh khối lignocellulose cấu thành hợp phần chính: cellulose, hemicellulose lignin Cellulose có chất polymer mạch thẳng D-glucose liên kết với liên kết β (1-4), sản phẩm thủy phân cellulose nguồn chất chủ yếu cho trình lên men cồn sau Việc thủy phân cellulose enzym hiệu tốc độ chuyển hóa cellulose thành đường cao Theo đường sinh học, để thuỷ phân hoàn tồn cellulose thành glucose sản phẩm hịa tan phải nhờ hiệp trợ xúc tác phức hệ cellulase từ vi sinh vật Cho tới khoa học biết có kiểu enzym tham gia vào phức hệ Đó endoglucanase-EG (EC.3.2.1.4), exoglucanase-CBH (EC 3.2.1.91) β-glucosidase (EC 3.2.1.21) Trong βglucosidase (EC.3.2.1.21) enzym chủ yếu thủy phân hoàn toàn xellulose thành glucose nhờ khả phân cắt liên kết glucozit Enzym tác động diglucozit, oligosaccarit mà liên kết alkyl, aryl glucozit Sự tạo thành phức hệ cellulase vi sinh vật thường hay thiếu hụt βglucosidase dẫn đến làm giảm tốc độ thủy phân cellulose Để khắc phục hạn chế này, thực tế người ta tiến hành theo hai hướng sau: - Nuôi kết hợp số chủng vi sinh vật để thu phức hệ cellulase hỗn hợp chứa đầy đủ cân đối enzym Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội - Mở đầu Tìm điều kiện nuôi tối ưu nhằm nâng cao lực tổng hợp β-glucosidase số chủng vi sinh vật tạo enzym tái tổ hợp Việc nghiên cứu tạo chế phẩm enzym tái tổ hợp dùng làm nguồn enzym dạng tự để bổ sung vào phức hệ cellulase quan tâm nghiên cứu từ nhiều năm Trình tự gen mã hóa β-glucosidase xác định nhiều loài sinh vật khác Candida pelliculosa, Kluyveromyces fragilis, Saccaromycopsis fibuligera, Trichoderma reesei, Volvariella volvacea Do vậy, đề tài “Nghiên cứu thu nhận β-glucosidase tái tổ hợp cho hoạt tính cao’’ thực nhằm góp phần vào việc nghiên cứu tạo nguồn chế phẩm β-glucosidase tái tổ hợp phục vụ cho mục đích sản xuất cồn nhiên liệu Để thực mục đích trên, nội dung đề tài bao gồm ba phần sau: - Xây dựng quy trình thu nhận β-glucosidase tái tổ hợp cho hoạt độ cao - Xây dựng qui trình tách, tinh chế phẩm enzym kỹ thuật từ dịch nuôi - Khảo sát số đặc tính β-glucosidase tái tổ hợp Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Kết & thảo luận Kết thu hình 3.10 cho thấy enzym có khoảng nhiệt độ hoạt động rộng (từ 400C-600C) Khi nhiệt độ tăng từ 300C, hoạt độ β-glucosidase P P P P P P chủng nghiên cứu tăng dần đạt cực đại 500C Khi nhiệt độ lớn P P 700C, hoạt độ enzym giảm mạnh 800C hoạt độ enzym khoảng 12% so P P P P với hoạt độ 500C Như nhiệt độ tối ưu cho xúc tác β-glucosidase từ chủng P P nấm men P pastoris 2.2 500C Kết thấp chút so với công bố P P nhiệt độ hoạt động tối ưu β-glucosidase thu từ chủng nấm mốc Aspergilus niger PBC (600C) P P * Độ bền nhiệt enzym β-glucosidase Để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tới khả bền nhiệt chế phẩm β-glucosidase enzym biểu diễn % so với hoạt độ ban đầu chưa xử lý nhiệt Kết biểu diễn hình 3.11 30 độ C 60 độ C 40 độ C 70 độ C 50 độ C 80 độ C Hoạt độ tương đối (%) 120 100 80 60 40 20 0 10 20 30 40 Thời gian (h) Hình 3.10: Ảnh hưởng nhiệt độ tới độ bền nhiệt β-glucosidase Phân tích kết thu ta thấy enzym bền nhiệt độ 400C Trong P P khoảng nhiệt độ từ 300C-400C, sau thời gian 6h, β-glucosidase giữ P P P P khoảng 80% hoạt tính Tuy nhiên giữ enzym 700C 1h, hoạt độ enzym P P giảm xuống khoảng 20% so với ban đầu Kết tương tự 56 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Kết & thảo luận công bố độ bền nhiệt β-glucosidase thu từ chủng gốc 3.3.3 Ảnh hưởng pH * Xác định pH xúc tác tối ưu Để tìm pH tối ưu cho hoạt động β-glucosidase, tiến hành khảo sát thay đổi hoạt độ enzym giá trị pH từ 3-7 (nhiệt độ phản ứng 500C P P cho tất mẫu) Kết thể hình 3.12 cho thấy β-glucosidase từ chủng tái tổ hợp có pH hoạt động mạnh vùng 5-6.5 cho hoạt độ cực đại pH5.5 Khi tiến hành phản ứng môi trường axit pH3-4 hoạt độ tương đối enzym thấp khoảng 20-30% so với hoạt độ enzym pH5.5 Điều cho thấy vùng pH hoạt động chế phẩm từ P.Pastoris cao so với chủng gốc Aspergilus niger PBC (pH otp từ 4-5) R R Hoạt độ tương đối (%) 120 100 80 60 40 20 3,5 4,5 5,5 6,5 pH Hình 3.11 : Ảnh hưởng pH đến hoạt tính β-glucosidase * Độ bền pH β-glucosidase Để khảo sát ảnh hưởng pH tới độ bền chế phẩm β-glucosidase, tiến hành thí nghiệm xác định hoạt độ lại chế phẩm điều kiện pH khác (từ 3-7) sau khoảng thời gian 1h, 6h, 12h, 24h, 36h Hoạt độ lại enzym mẫu thí nghiệm biểu diễn phần trăm so với hoạt độ enzym thời điểm ban đầu 57 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Kết & thảo luận pH pH 4.5 pH 120 pH 3.5 pH pH 6.5 pH pH 5.5 pH 20 30 Hoạt độ tương đối (%) 100 80 60 40 20 0 10 40 Thời gian (h) Hình 3.12: Độ bền pH β-glucosidase Kết biểu diễn hình 3.13 cho thấy enzym tương đối bền vùng pH 5.5-6.5 gần tương tự với khoảng pH hoạt động tối ưu enzym Sau 24h hoạt độ enzym giữ 50% so với ban đầu Cũng theo kết thu cho thấy vùng pH thấp 3-4.5 hoạt độ enzym giảm nhanh thời gian tăng Đặc biệt pH 3, sau 12h hoạt độ enzym giảm 90% so với ban đầu Kết tương tự kết công bố độ bền pH β-glucosidase thu từ nấm mốc 3.3.4 Ảnh hưởng ion kim loại Ion kim loại có ảnh hưởng lớn đến hoạt độ enzym Tùy thuộc vào chất cấu tạo enzym mà tác động ion tới chúng khác Trong thí nghiệm chế phẩm enzym ủ vào với đệm có chứa số ion kim loại 30' nhiệt độ phịng 300C Sau chế phẩm lấy xác định hoạt độ P P 58 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Kết & thảo luận 120% 100% Hoạt độ tương đối 100% 90% 93% 86% 77% 80% 84% 79% 71% 60% 40% 34% 20% 0% control K+ Ca2+ Na+ Fe2+ Mg2+ Mn2+ Cu2+ ion kim loai Zn2+ Hình 3.13: Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt tính β-glucosidase Từ kết phân tích hình 3.14 cho thấy hoạt độ xúc tác enzym bị ảnh hưởng ion kim loại thử nghiệm Với ion kim loại nặng Mn2+, Fe2+, Cu2+ có tác động kìm hãm rõ rệt Đặc biệt nồng độ 10-3mM ion P P P P P P Mn2+ ức chế mạnh hoạt động enzym (hoạt độ enzym giảm 70% so với mẫu P P đối chứng) Kết ngược lại so với enzym thu từ chủng gốc hoạt độ enzym không bị ảnh hưởng bới số ion kim loại Na+, K+, Mn2+ hoạt hoá P P P P P P chút it ion Ca2+ P P 3.3.5 Ảnh hưởng nồng độ glucose Chế phẩm β-glucosidase tái tổ hợp ứng dụng chủ yếu để thủy phân hoàn toàn cellulose thành glucose sản xuất cồn nhiên liệu Tuy nhiên tạo thành glucose gây ức chế tới khả hoạt động enzym Đây đặc điểm chung hầu hết β-glucosidase đặc điểm hạn chế khả ứng dụng chúng trình phân huỷ lên men nguyên liệu giàu 59 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Kết & thảo luận cellulose Do việc xác định ảnh hưởng hàm lượng glucose tới khả hoạt động enzym chế phẩm cần thiết 120 Hoạt độ tương đối (%) 100 100 93 88 79 80 62 60 52 44 35 40 20 0 12 Nồng độ glucose (g/l) 15 18 Hình 3.14: Ảnh hưởng glucose tới khả xúc tác chế phẩm Tiến hành phản ứng thủy phân có mặt glucose nồng độ khác nhau: 0; 1; 3; 6; 9; 12; 15 18(g/l) Ảnh hưởng hàm lượng đường tới hoạt tính enzym đánh giá thơng qua hoạt tính tương đối chế phẩm có đường so với khơng có mặt glucose Kết khảo sát hình 3.15 cho thấy hoạt độ β-glucosidase nghiên cứu bị ức chế glucose Ở nồng độ đường thấp từ 1-3g/l hoạt tính enzym thay đổi không đáng kể, tăng nồng độ glucose lên 9g/l chế phẩm giữ khoảng 60% hoạt độ Nồng độ đường tăng 15g/l hoạt độ enzym giảm 60% so hoạt độ ban đầu Kết tương tự kết công bố enzym thu từ chủng gốc 3.3.6 Ảnh hưởng etanol Enzym β-glucosidase ứng dụng chủ yếu sản xuất cồn nhiên liệu Do việc xác định ảnh hưởng etanol đến hoạt độ enzym chế phẩm từ 60 Nguyễn Vũ Hồi Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Kết & thảo luận đưa lượng etanol thích hợp có mơi trường phản ứng cần thiết Ảnh hưởng nồng độ etanol tới hoạt độ β-glucosidase chế phẩm đánh giá thông qua việc xác định hoạt độ enzym hỗn hợp dịch phản ứng có hàm lượng etanol sau: 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 50 % (v/v) Hoạt độ tương ứng β Hoạt độ tương đối (%) -glucosidase thu mẫu tính theo mẫu cho hoạt độ cao 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 73 80 88 94 100 98 92 81 67 29 12 15 18 21 24 50 Nồng độ EOH (%) Hình 3.15 : Ảnh hưởng nồng độ etanol đến hoạt tính β-glucosidase Qua kết thí nghiệm thể hình 3.16 cho thấy etanol làm tăng hoạt tính xúc tác chế phẩm Khi có mặt cồn, hoạt tính xúc tác chế phẩm tăng rõ rệt so với Hoạt độ enzym β-glucosidase tăng cực đại nồng độ cồn 12% tăng khoảng 30% so với khơng có mặt etanol Khi tăng lượng etanol môi trường phản ứng từ 24% hoạt độ chế phẩm 67% , 50% nồng độ etanol hoạt tính enzym giảm 70% hoạt độ Từ kết thu cho thấy β-glucosidase từ P.pastoris 2.2 hoạt hóa có mặt etanol với nồng độ khoảng 3-21% (v/v) Như β-glucosidase từ chủng nghiên cứu có khả chịu etanol cao chế phẩm thu tương ứng với chủng gốc (enzym hoạt hóa nồng độ cồn từ 3-12%) Khả hoạt hóa etanol giải thích hoạt tính glycosyltranferase β-glucosidase Khi mơi trường có mặt etanol dễ dàng tiếp 61 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Kết & thảo luận nhận gốc glycosyl giải phóng nhanh cho enzym trạng thái tự Kết làm tốc độ phản ứng tăng lên nhiều so với mơi trường khơng có etanol Khả chịu cồn enzym lợi đảm bảo cho chúng sử dụng có hiệu số đồ uống có cồn 62 Nguyễn Vũ Hồi Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Kết luận KẾT LUẬN Xác định điều kiện nuôi cấy tối thích cho sinh tổng hợp β –glucosidase cao từ chủng P.pastoris 2.2: - Tỷ lệ giống cấy truyền môi trường biểu có giá trị OD đạt (mật độ tế bào 10.105 tế bào/ml) P - P Chủng nuôi to= 300C, pH 7.5, tốc độ lắc 200 vòng/phút Định 24h kỳ P P P P bổ sung metanol đến nồng độ cuối đạt 1% - Sau ngày nuôi cấy, hoạt độ chế phẩm đạt 8.2 U/ml Xây dựng quy trình tách, tinh chế phẩm β –glucosidase từ chủng tái tổ hợp P.pastoris 2.2: - Cơ đặc thể tích kỹ thuật lọc dòng ngang (màng lọc 10kDa) nhiệt độ 40C, 20-25 psi, áp suất 85-90 rpm, thời gian 4h thể tích dịch thô cô đặc P P lần so với ban đầu - Kết tủa dịch enzym sau lọc dòng ngang etanol phân đoạn 30% 75% độ bão hòa Hiệu suất thu hồi đạt 73.56%, độ chế phẩm β – glucosidase 3.66 lần Đã xác định số đặc tính β –glucosidase: - Nhiệt độ tối ưu 500C, enzym bền vùng nhiệt độ 300C-400C - pH tối ưu 5, enzym bền vùng pH5.5-6.5 - Enzym có tính đặc hiệu chất tương đối rộng, co khả khả thuỷ phân P P P P P P aryl, oligosaccarit - Các ion kim loại, đặc biệt Mn2+, Fe2+, Cu2+ kìm hãm khả hoạt động P P P P P P enzym - Nồng độ glucose 9g/l gây ức chết đến hoạt tính enzym - Nồng độ etanol hoạt hóa khả xúc tác enzym 10-12% (v/v) 63 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Kiến nghị KIẾN NGHỊ Để nâng quy mô hệ thống lên men lớn, tiếp tục khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp enzym β –glucosidase từ chủng P.Pastoris 2.2 để như: tốc độ khuấy, lượng O cung cấp R R Tiếp tục khảo sát khả ứng dụng β –glucosidase sản xuất cồn nhiên liệu từ lignocellulose Nghiên cứu thiết kế vetor tái tổ hợp tổng hợp β –glucosidase cho hoạt tính cao 64 Nguyễn Vũ Hồi Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO Giang Thế Bính, Hồng Thị Lê Hằng, Đặng Kim Tuyến, Lê Năng Công (2000), Thu nhận ứng dụng beta-glucosidase để khử vị đắng nước mơ, Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng CNSH & CNTP giai đoạn 1996-2000, NXBKH&KT HN, 136-144 Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ Enzym, Nhà xuất nông nghiệp Hồ Chí Minh, Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, NXBGD Nguyễn Đức Lượng (1996), Nghiên cứu tính chất số vi sinh vật có khả tổng hợp xellulase cao ứng dụng công nghệ xử lý chất thải hữu cơ, Luận án phó tiến sĩ khoa học kỹ thuật, Trường ĐHBK Hà nội Lê Thị Hồng Mai (1989), Sinh tổng hợp số đặc tính cellulase (typ CMCase) Aspergillus niger VS-1 nuôi cấy mơi trường đặc, Luận án phó tiến sỹ sinh học, Trường đại học Tổng hợp, Hà nội Nguyễn Thị Xuân Sâm (2000), Nghiên cứu trình kết tạo hạt tự cố định beta-Glucosidase từ chủng nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium BK01 khả ứng dụng chúng, Luận án tiến sĩ, Trường ĐHBK Hà Nội Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Tô Kim Anh (1997), Thí nghiệm hóa sinh cơng nghiệp, Trường Đại học BK Hà nội Angela Martino, Pier G Pifferi & Giovanni Spagna (1997), Production of beta-glucosidase by Aspergillus niger Using Carbon Sources Derived from Agricultural Wastes J Chem, Tech Biotechnol, 60, pp 247-252 Arunik Sanyan, Ramendra K Kundu, S Dube and Dipak K Dube (1988), Extracellular cellulolytic enzym system of Aspergillus japonicus: Purification and characterization of an inducible extracellular betaglucosidase, Enzym Microb Technol., vol 10, February 10 Badal, C.Saha-Shelby, N freer –Rodney, J Bothast, Production, 65 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Tài liệu tham khảo purification, and properties of a Thermostable beta -glucosidase from a color Variant Strain of Aureobasidium pullulans, Applied and Environmental Microbiology, pp 3774-3780 11 Bhatia, Y., Mishra, S., and Bisaria, V S (2005), Purification and 3T characterization of recombinant Escherichia coli-expressed Pichia etchellsii beta-glucosidase II with high hydrolytic activity on sophorose, Applied microbiology and biotechnology 66, pp 527-535 12 Cameron, Randal (2000), Purification and characterization of betaglucosidase from citrus Sinensis Var Valencia Fruit Tissue Journal of Agricultural and Food Chemistry 13 Chritine Riou, Jean-Michel Salmon, Mảie-Jose Vallỉe, Ziya Gunata and Pierrer Barre (1998), Purification, Characterization, and Substrate Specificity of a Novel Highly Glucose- Tolerant beta-Glucosidase from A niger oryzae Appl Environ Microbiol, 40, pp 3607-3614 14 Chaudhary K., Mittal S L and Tauro P (1985), Control of cellulose hydrolysis by fungi Biotech Letters, 6, pp 455-456 15 Daniel M.Bollag & Stuart J.Edelstein (1992), Protein methods Ajohn Wiley & sons Inc, Publication 16 Duff S J B., Murray W D (1996), Bioconversion of forest product industry 3T waste cellulosics to fuel etanol: a review, Biorecour Technol, 55 pp 1-33 17 Galas E, Romanowska I (1997), Purification and some properties of betaglucosidase from Aspergillus niger IBT-90, Acta Microbiol Pol, 46 (3), pp 241-52 18 Giovanni Spagna, Riccardo N Barbagallo, Pier Giorgio Pifferi (2000), Stabilization of beta-glucosidase from Aspergillus niger by binding to an amine agarose gel Journal of Molecular Catalysis B., Enzymatic 11, 63 19 Giovanni Spagna, Riccardo N Barbagallo, Pier Giorgio Pifferi (2002) Properties of endogenous beta-glucosidase of Pichia anomala strain isolated from Sicilian musts and Wines, Enzyme and Microbial Technology 66 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Tài liệu tham khảo 20 Giovanni Spagnaa, Riccardo N Barbagalloa, Rosa Palmeria, Cristina Restucciaa, Paolo Giudicib (2002), Properties of endogenous betaglucosidase of Saccaromyces cerevisiae strain isolated from Sicilian musts and wines Enzym and Microb Technology 31, pp 1030-1035, Oxford University 21 G Tuncel - M.J.R Nout - L Brimer (1998), Degradation of cyanogenic glycosides of bitter apricot seeds by endogenous and added enzymes as affected by heat treatments and particle size, Food chemistry, Vol 63, No.1, pp 65-69 22 Hahn-Hägerdal, B.; Galbe, M.; Gorwa-Grauslund, M.F Lidén, G.; Zacchi, G 3T (2006), Bio-etanol – the fuel of tomorrow from the residues of today, Trends in Biotechnology 24 (12), 549-556 23 Himmel, M.E., adney, W.S., Fox, J W., Mitchell, D.J., Baker, J.O -1993 Isolation and characterization of two froms of beta-glucosidase from Aspergillus niger, Applied Biochemical Biotechnology, pp 213-225 24 Hong, J., Tamaki, H., Kumagai, H (2007), Cloning and functional 3T expression of thermostable beta-glucosidase gene from Thermoascus aurantiacus, Applied microbiology and biotechnology 73, pp 1331-1339 25 Huang.H.T (1995), Decolorization of Anthocianins by fungal enzymes, Agricultural Food Chemical, Vol.3, pp 141-146 26 Invitrogen Pichia expression kit, a manual of methods for expression of 3T recombinant proteins in Pichia pastoris, Catalog no K1710-01 27 Kawai, R., Yoshida, M., Tani, T., Igarashi, K., Ohira, T., Nagasawa, H., 3T Samejima, M (2003), Production and characterization of recombinant Phanerochaete chrysosporium beta-glucosidase in the methylotrophic yeast Pichia pastoris, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 67, pp 1-7 28 Kazuhiro Iwashita, Kuichi Todoroki, Hitoshi Kimura, Hitoshi Shimor and Kiyoshi Ito (1998), Purification and Characterization of Extracellar and Cell 67 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Tài liệu tham khảo Wall Bound beta-Glucosidases from Aspergillus kawachii Biosci Biotech Biochem, 62(10), pp 1938-1946 29 Kengen S W M., Luesink E J, Stám A J M., Zehnder A J B (1993), Purification and characterization of an extremely thermostable betaglucosidases from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus Eur J Biochem, 213, pp 305-312 30 Kohchi, C., M.Hayashi, and S Nagai (1985), Purification and properties of the beta-glucosidase from Candida pelliculosa Agricultural, Biotechnology, Chemical, Vol.49, pp 779-784 31 Li, X., Pei, J., Wu, G., and Shao, W (2005), Expression, purification and 3T characterization of a recombinant beta-glucosidase from Volvariella Volvacea, Biotechnology letters 27, pp 1369-1373 32 M R Jisnuson Svasti et al (1998), Characterization of a Novel Rotenoid beta-glucosidase enzyme and its Natural substrate from Thai Rosewood http://www.iupac.org/symposia/proceedings/phuket 97/svasti.html 33 Marie-Paule Le Traon-Masson, and Patrce Pellerin (1998), Purification and characterization of two beta-D-glucosidases from an Aspergillus nigerenzym preparation, Enzym and Microbiol Technology, chapter 22, pp 374-382 34 M K Gowthaman,*K S M S Raghava Rao, N P Ghildyal *and N G Karanth (1993), Gas concentration and temperature gradients in a packed bed solid-state fermentor Biotech Adv Vol 11, pp 611-620 35 Mercedes concordia carrao et al.(2000), Activity of beta-glucosidase and levels of isoflavone glucosides in soybean cultivars affected by the environment Pesq agropec brasinlia, Vol.35, pages 873-878 36 Naz S, Ikram N, Rajoka MI, Sadaf S, Akhtar MW (2010), Enhanced 3T 3T 3T 3T 3T T T T T T production and characterization of a beta-glucosidase from Bacillus halodurans expressed in Escherichia coli, Biochemistry (Mosc), pp 13 T T 37 Nout, M.J.R., Tuncel, G andBrimer,L (1995), Microbial degradation of amygdalin of bitter apricot seeds, International Food Microbiology, Vol.24 68 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Tài liệu tham khảo 38 Paolo Riccio - Rocco Rossano -Mara Vinella et al (1999), Extraction and immobilization in one step of two beta-glucosidase released from a yeast strain of Debaryomyces hansenii, Enzyme and Microbial Technology, vol.24, February 15, March, pp 123-129 39 P.F.Fox (1991), Food enzymology, University College Cork, Ireland 40 Rashid MH, Siddiqui KS (1997), Purification and characterization of a betaglucosidase from Aspergillus niger Folia Microbiol (Praha), pp 544-50 41 Rodionova, N.A, I.M.Tavobilov, L.I.Martinovich, T.S.Buachidze (1987) beta-glucosidase from cellulolytic fungi Aspergillus terrus, Geotrichum candium, and Trichderma longibrachiatum as typical glucosidases, Biotechnology Applied Biochemistry, Vol 9, pp 239-350 42 Ruth Birk,1, Ariel Ikan,1, Benami Bravdo,1 Sergei Braun,3 And Oded Shoseyov*,1,2 (1997), Synthesis of isopropyl-1-Thio-beta-D-Glucopyranozit (IPTGLc), an Inducer of Aspergillus niger B1 beta-glucosidase Production Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 66 43 S.Doonan Humana Press Inc Totowa NJ Methods in Molecular Biology, Vol 59: Protein Purification Protocols, Chapter 32 pp 339-355 44 Stutzenberger, F.(1990), Thermostable fungal beta-glucosidase, Applied Microbiology, Vol 11, pp 173-178 45 Teunissen, M.J., J.H.J.Huis and G.D.Vogels (1992), Purification and characterization of an extracellular beta-glucosidase from anaeribic fungus Pyromyces sp strain E2, Archaic Microbiology, Vol.158, pp 276-281 46 Umezurike, G.M (1991), The octameric structure of beta-glucosidase from Botryodiplodia theobromae, Biochemical, Vol 275 pp 721-725 47 Yannick Gueguen, Patrick Chemardin, Guilhem Janbon, Alain Arnaud, * and Pierre Galzy (1996), A very efficient beta-Glucosidase Catalyst for the Hydrolysis of Flavor Precursors of Wines and Fruit Juices J Agric, Food Chem, 44, pp 2336-2340 69 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Tài liệu tham khảo 48 Y Ziya Gunata, Claude L Bayonove, Claude Tapiero, and Robert E Cordonnier (1990), Hydrolysis of Grape Monoterpenyl beta-D-Glucozits by Various beta-Glucosidases J Agric, Food Chem, 38, pp.1232-1236 49 Watanabe, T., Sato, T., Yoshioka, S., koshujima, T., Kuwahara, M.(1986), Purification and properties of beta-glucosidase from Aspergillus niger Biochemical, ol.209, pp 651-659 50 Witte, K., Wartenberg Purification and Properties of two beta-glucosidases Isolated from Aspergillus niger, Acta Biotechnol, 9(1989) 2, pp 179-190 51 Wu S and Letchworth G J High efficiency transformation byelectroporation of Pichia pastoris pretreatedwith lithium acetate anddithiothreitol, BioTechniques (2004) 36: pp.152-154 52 Zhao Xin, Qu Yinbo (1999), The influence of glucose concentration on beta-Glucosidase production and morphology of Aspergillus niger in batch and culture, Enzym Microbiol Technology, , 25(8), pp.710-717 70 Nguyễn Vũ Hoài Phương ... Thu nhận β- glucosidase tái tổ hợp 1.5.1 Gen mã hóa β- glucosidase Việc nghiên cứu tạo chế phẩm β- glucosidase tái tổ hợp quan tâm nghiên cứu từ nhiều năm Gen mã hóa enzym β- glucosidase nghiên cứu. .. volvacea Do vậy, đề tài ? ?Nghiên cứu thu nhận β- glucosidase tái tổ hợp cho hoạt tính cao’’ thực nhằm góp phần vào việc nghiên cứu tạo nguồn chế phẩm β- glucosidase tái tổ hợp phục vụ cho mục đích... hưởng etanol tới hoạt độ β- glucosidase 18 T T 1.4 Các nguồn thu β- glucosidase 18 T T 1.5 Thu nhận β- glucosidase tái tổ hợp 20 T T 1.5.1 Gen mã hóa β- glucosidase 20