Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp trong aspergillus niges D15LCC1 và khảo sát khả năng ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE TÁI TỔ HỢP TRONG ASPERGILLUS NIGER D15#26LCC1 VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI – 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƢƠNG MAI NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE TÁI TỔ HỢP TRONG ASPERGILLUS NIGER D15#26LCC1 VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học thực phẩm Mã số: 62 54 02 05 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TÔ KIM ANH TS LÊ QUANG HÒA Hà Nội - 2012 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Những số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chƣa đƣợc tác giả khác công bố Hà Nội, ngày…….tháng………năm 2012 Nguyễn Thị Phương Mai i LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Tô Kim Anh – Viện trƣởng – Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hƣớng dẫn, dìu dắt cấp kinh phí cho tơi suốt q trình nghiên cứu Tơi xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Lê Quang Hòa GS.TS Đặng Thị Thu – Phịng Hóa Sinh – Vi sinh Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hƣớng dẫn, dìu dắt cho tơi thực nghiên cứu Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Xn Sâm – Trƣởng mơn Hóa sinh – Vi sinh Sinh học phân tử thầy, giáo vá cán phịng Hóa sinh – Vi sinh Sinh học phân tử tận tình giúp đỡ, dạy bảo động viên tơi q trình học tập nghiên cứu khoa học Tơi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Tuấn Anh – giảng viên mơn Hóa sinh-Vi sinh Sinh học phân tử, Th.s Lê Tuân - cán nghiên cứu mơn Hóa sinh-Vi sinh Sinh học phân tử học viên hƣớng dẫn tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu môn Tôi xin đƣợc cảm ơn TS Trƣơng Quốc Phong – Trƣởng phịng thí nghiệm Proteomic, cán học viên Trung tâm nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội động viên, hƣớng dẫn tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực nghiên cứu Cuối cùng, xin cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Cao đẳng Cộng đồng Hà Tây gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên, khích lệ tạo điều kiện tốt cho học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày…… tháng…….năm 2012 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Phƣơng Mai ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT viii BẢNG VIẾT TẮT CÁC THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC ix DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LACCASE 1.1.1 NGUỒN THU LACCASE 1.1.1.1 Laccase tự nhiên 1.1.1.2 Laccase tái tổ hợp 1.1.2 CẤU TRÖC CỦA LACCASE 1.1.3 CƠ CHẾ XÖC TÁC CỦA LACCASE 1.1.3.1 Xúc tác chuyển hóa hợp chất phenol 1.1.3.2 Xúc tác chuyển hóa hợp chất khác 10 1.1.4 ĐẶC TÍNH CỦA LACCASE 11 1.1.4.1 Khối lƣợng phân tử 11 1.1.4.2 Tính đặc hiệu chất 12 1.1.4.3 Các số động học phản ứng laccase 12 1.1.4.4 pH tối ƣu độ bền pH 14 1.1.4.5 Nhiệt độ tối ƣu độ bền nhiệt 15 1.1.4.6 Các chất kìm hãm 15 iii 1.2 ỨNG DỤNG CỦA LACCASE 16 1.2.1 Laccase phân hủy hợp chất mạch vòng 16 1.2.2 Ứng dụng công nghiệp giấy 17 1.2.3 Ứng dụng laccase công nghiệp dệt nhuộm 17 1.2.4 Laccase công nghiệp thực phẩm 18 1.2.5 Laccase sản xuất bioethanol 19 1.2.6 Các ứng dụng khác laccase 19 1.3 LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE TỪ NẤM MỐC 20 1.3.1 Ảnh hƣởng trạng thái nấm mốc 20 1.3.2 Ảnh hƣởng yếu tố môi trƣờng 20 1.3.2.1 Ảnh hƣởng nguồn cacbon nồng độ cacbon 20 1.3.2.2 Ảnh hƣởng nguồn nitơ 21 1.3.2.3 Ảnh hƣởng nguồn khoáng 22 1.3.2.4 Ảnh hƣởng chất cảm ứng 23 1.3.2.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ pH 24 1.3.2.6 Ảnh hƣởng thơng khí 25 1.4 KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE 25 1.4.1 Lên men gián đoạn 26 1.4.2 Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dƣỡng (Fed-batch) 27 1.4.3 Lên men liên tục 28 1.4.4 Động học trình sinh tổng hợp laccase 29 1.4.4.1 Động học phát triển nấm mốc 29 1.4.4.2 Động học trình tạo sản phẩm hệ thống lên men 30 1.4.5 Sinh tổng hợp laccase nhờ hệ thống biểu A niger D15#26- pAN52-4 32 1.5 TINH CHẾ LACCASE .34 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .36 iv 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 36 2.1.1 Các mẫu vật nghiên cứu 36 2.1.2 Vi sinh vật 36 2.1.3 Các loại thiết bị 37 2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy 38 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .38 2.2.1 Xác định sinh khối nấm mốc 38 2.2.2 Xác định hoạt độ laccase 38 2.2.3 Xác định hoạt độ protease theo phƣơng pháp Anson cải tiến 39 2.2.4 Xác định đƣờng khử theo phƣơng pháp DNS 40 2.2.5 Xác định protein phƣơng pháp Lowry 40 2.2.6 Điện di biến tính protein gel polyacrylamide (SDS – PAGE) 41 2.2.7 Điện di không biến tính phát laccase 41 2.2.8 Xác định hàm lƣợng ethanol 41 2.2.9 Xác định hàm lƣợng phenol tổng số phƣơng pháp Folin Ciocalteau 42 2.2.10 Thu bào tử nấm mốc đĩa thạch 42 2.2.11 Phân lập sàng lọc chủng sinh laccase 43 2.2.12 Phƣơng pháp sàng lọc dòng biểu laccase 43 2.2.13 Phƣơng pháp ni cấy tối ƣu hóa điều kiện ni A niger D15#26lcc1 1.8B 43 2.2.14 Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp laccase từ A niger D15#26lcc1 1.8B 44 2.2.15 Tinh chế laccase tái tổ hợp 45 2.2.16 Khảo sát đặc tính enzyme 45 2.2.17 Thu nhận chế phẩm enzyme kỹ thuật 46 2.2.18 Nghiên cứu sử dụng laccase chuyển hóa lignocellulose 47 2.2.18.1 Xác định hàm lƣợng lignin theo phƣơng pháp biến tính Komarov 47 2.2.18.2 Khảo sát vai trò khử độc dịch thủy phân bã mía laccase 48 v CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 SÀNG LỌC NGUỒN GEN SINH TỔNG HỢP LACCASE 50 3.2 SÀNG LỌC CÁC DÕNG A NIGER D15#26 lcc1 SINH TỔNG HỢP LACCASE 53 3.3 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN TĂNG TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP LACCASE TRONG A niger D15#26lcc1 1.8B .57 3.3.1 Ảnh hƣởng nồng độ glucose 57 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ CuSO4 60 3.3.3 Ảnh hƣởng tỷ lệ giống cấp 61 3.3.4 Ảnh hƣởng pH 62 3.3.5 Ảnh hƣởng nguồn nitơ 64 3.4 TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP LACCASE TỪ A niger D15#26lcc1 1.8B TRONG LÊN MEN GIÁN ĐOẠN 66 3.4.1 Chọn miền khảo sát 66 3.4.2 Thiết lập mơ hình 67 3.4.3 Tối ƣu hóa q trình tổng hợp laccase 71 3.5 KHẢO SÁT ĐỘNG THÁI TỔNG HỢP LACCASE 72 3.5.1 Ảnh hƣởng chế độ sục khí đến sinh tổng hợp laccase 72 3.5.2 Động thái trình sinh tổng hợp laccase từ A niger D15#26lcc1 1.8B hệ thống lên men gián đoạn 74 3.6 THỬ NGHIỆM SINH TỔNG HỢP LACCASE TRONG LÊN MEN HAI GIAI ĐOẠN 75 3.7 THỬ NGHIỆM LÊN MEN FED-BATCH .78 3.8 TINH CHẾ LACCASE .81 3.9 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA LACCASE TÁI TỔ HỢP 83 3.9.1 Ảnh hƣởng pH tới laccase 83 3.9.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới enzyme 84 3.9.3 Các số động học phản ứng enzyme 85 vi 3.10 KHẢO SÁT ỨNG DỤNG LACCASE TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL TỪ LIGNOCELLULOSE 87 3.10.1 Tiền xử lí hóa nhiệt kết hợp với laccase 87 10.2 Vai trò laccase khử độc dịch thủy phân cho mục tiêu lên men ethanol 88 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 KẾT LUẬN 92 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC 104 vii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT TT Các từ Giải thích từ thuật ngữ viết tắt thuật ngữ viết tắt ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) BSA Bovine serum albumin DMP 2,6-dimethoxyphenol DNS 2,3 – dinitro salycilic EPR Cộng hƣởng thuận từ E0 Thế oxi hóa khử FC Folin Ciocalteau FPLC Fast protein liquid chromatography HBT 1-hydroxybenzotriazole 10 kb 11 kDa Kilo dalton 12 mV Milivol 13 PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon– Hydrocacbon mạch vòng 14 RBBR 15 SDS – PAGE 16 TCA Kilo base Remazol Brilliant Blue R Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Trichloroacetic acid viii ... trên, tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp từ A niger D15#26lcc1 khảo sát khả ứng dụng” * Mục tiêu nghiên cứu: - Nghiên cứu kỹ thuật lên men laccase Trametes... cơng trình nghiên cứu kỹ thuật lên men thu nhận laccase tái tổ hợp T versicolor 06 biểu A niger D15#26lcc11.8B bao gồm lên men gián đoạn, lên men hai pha lên men bán liên tục, hoạt độ laccase tích... 25 1.4 KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE 25 1.4.1 Lên men gián đoạn 26 1.4.2 Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dƣỡng (Fed-batch) 27 1.4.3 Lên men liên tục