Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen ở bèo tấm lemna aequinoctialis

Vũ văn tiến giáo dục đào tạo trường đại học bách khoa hà nội - luận văn thạc sĩ khoa học công nghệ sinh học ngành : công nghệ sinh học Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh Và chuyển gen bèo lemna aequinoctialis Vũ văn tiến 2005 - 2007 Hà Nội 2007 Hà Nội 2007 Lời cảm ơn Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới PGS.TS Lê Huy Hàm, PGS.TS Đỗ Năng Vịnh đà tận tình giúp ®ì, h­íng dÉn, ®ãng gãp nhiỊu ý kiÕn q b¸u trình thực hoàn thành luận văn Tôi xin gửi tới lÃnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp tập thể cán Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, đặc biệt TS Phạm Lý Thu, CN Phùng Thị Thu Hà, KS Nguyễn Hải Anh, lời cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình suốt trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Khánh Vân, đà tận tình giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến quý báu trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Thày, Cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, cán Trung tâm Đào tạo Sau Đại học Ban Giám hiệu Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đà nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiƯn thn lỵi thêi gian häc tËp cịng nh­ hoàn thành báo cáo luận văn Tôi xin cảm ơn GS Landolt Elias thuộc Viện Địa thực vật học, Học viện Liên bang Thuỵ Sỹ đà giúp đỡ phân loại xác định tên loài bèo Nhân dịp này, xin bày tỏ lòng biết ơn GS Peter Stamp chương trình nhiệm vụ hợp nghiên cứu theo Nghị định thư với Cộng hoà Liên bang Đức đà tài trợ kinh phí cho việc thực đề tài luận văn Tôi xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp gia đình đà động viên tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2007 Vũ Văn Tiến Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực Kết nghiên cứu thực bảo thầy hướng dẫn giúp đỡ bạn bè, đồng nghiệp Mọi giúp đỡ cho thực luận văn đà cảm ơn, thông tin trích dẫn luận văn đuợc ghi rõ địa nguồn gốc Tác giả luận văn Vũ Văn Tiến Mục lục Trang Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình biểu đồ Mở đầu 10 Chương Tổng quan tµi liƯu 12 1.1 Tỉng quan vỊ bÌo tÊm 1.1.1 Cây phân loại bèo 1.1.2 Đặc điểm hình thái bèo LA 1.1.3 Hình thức sinh sản bèo 1.1.4 Phân bố bèo 1.1.5 Thành phần dinh dưỡng bèo 12 12 12 13 15 15 16 1.2 Nuôi cấy mô tế bào 1.2.1 Tính toàn tế bào 1.2.2 Các hướng tái sinh từ mô thực vật 1.2.3 Môi trường nu«i cÊy 1.3 chun gen thùc vËt 3.1 Chun gen gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens 3.2.Các phương pháp chuyển gen trùc tiÕp 1.4 chun gen th«ng qua Agrobacterium tumefaciens 1.4.1 Cấu trúc chức Ti-plasmid 1.4.2 Cấu trúc chức đoạn T-DNA 1.4.3 Cơ chế phân tử trình chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 17 17 18 21 21 23 26 26 27 27 1.4.5 Hệ thống vectơ chuyển nạp 1.5 Tình hình nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh 29 32 vµ hƯ thèng chun gen ë bÌo tÊm 1.5.1 Các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh 1.5.2 Các nghiên cứu chuyển gen vào bèo Chương Vật liệu phương pháp nghiên 32 33 35 cứu 2.1 Néi dung nghiªn cøu 2.2 VËt liƯu nghiªn cøu 2.3 Phương pháp nghiên cứu Chương Kết thảo luận 3.1 Xây dựng hệ thống tái sinh 3.1.1 Tạo vật liệu vô trùng 3.1.2 Tối ưu hoá môi trường nhân bèo 3.1.3 Tối ưu hoá môi trường tạo callus 3.1.4 Nhân sinh khối callus dạng I 3.1.5 Tái sinh từ callus 3.2 Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên 3.2.1 Kết sàng lọc chủng vi khuẩn 3.2.2 So sánh hai kỹ thuật tăng cường tiếp xúc: ly tâm hút chân không 35 35 37 46 46 46 47 53 62 64 70 70 71 3.2.3 ảnh hưởng thời gian hút chân không 73 3.2.4 ảnh hưởng mật độ vi khuẩn 74 3.2.5 ¶nh h­ëng cđa AS 75 3.2.6 ¶nh h­ëng cđa kanamycine hygromycine tới hệ số nhân sức sống bèo LA 76 Kết luận đề nghị 81 Tài liệu tham khảo 83 Danh mục chữ viết t¾t 2,4-D: 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid 2iP: 6-(γ,γ-Dimethylallylamino) Purin AS: Acetosyringone BAP: 6-Benzyl Amino Purin CH: Casein Hydrolysate cs: céng sù DNA: Deoxy ribo-Nucleic Acid §C: §èi chøng GUS: β-glucuronidase IAA: Indol-3-Acetic Acid IBA: Indol -3-Butyric Acid KTST: KÝch thÝch sinh tr­ëng LA: Lemna aequinoctialis MCS: Multi-Cloning Site MS: Murashige and Skoog, 1962 NAA: α-Naphthalenacetic Acid NOS: Nopaline Synthetase OD 600 : MËt ®é vi khn ®o ë b­íc sãng 600nm b»ng quang phỉ kÕ DUR800 Spectrophotometer cđa h·ng Beckman Coulter PCA: p-Chlorophenoxyacetic acid T-complex: transferring- complex (phøc hỵp chun) T-DNA: transferred-DNA TDZ: Thidiazuron vir: virulence X-Gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid Danh mục bảng Thứ tự bảng Bảng 1.1 Thành phần hàm lượng hợp chất hữu có cánh Trang 16 bèo Bảng 3.1 Hiệu khử trùng loại hoá chất khác 46 Bảng 3.2 ảnh hưởng hàm lượng khoáng Hutner tới số cánh bèo 48 nhân sau ngày nuôi cấy Bảng 3.3 ảnh hưởng pH môi trường nuôi tới số cánh bèo nhân 50 sau ngày nuôi cấy Bảng 3.4 ảnh hưởng sucrose tới số cánh bèo nhân sau ngày 52 nuôi cấy Bảng 3.5 ảnh hưởng khoáng chất điều hoà sinh trưởng 54 khác sử dụng cho tạo callus Bảng 3.6 ảnh hưởng tỷ lệ khoáng môi trường N6 đến hiệu 56 tạo callus Bảng 3.7 ảnh hưởng 2,4D BAP đến hiệu tạo callus (%) 57 Bảng 3.8 ảnh hưởng hàm lượng đường đến tỷ lệ tạo callus 58 Bảng 3.9 ảnh hưởng hàm lượng CH đến hình thành callus 50 Bảng 3.10 Kết tạo callus môi trường có pH khác 60 Bảng 3.11 Kết tạo callus dạng I từ dạng II khoáng 61 KTST khác Bảng 3.12 ảnh hưởng kết hợp chất điều hoà sinh trưởng đến 63 chất lượng callus Bảng 3.13 Kết tái sinh callus dạng II 64 Bảng 3.14 Hiệu tái sinh công thức có hàm lượng BAP khác 66 Bảng 3.15 ảnh hưởng IAA kinetin tới khả tái sinh cánh 68 bèo Bảng 3.16 ảnh hưởng CH tới khả tái sinh bèo từ callus 69 Bảng 3.17 Biểu tạm thời gen GUS cánh bèo với 70 chủng vi khuẩn khác Bảng 3.18 Tỷ lệ biểu tạm thời biện pháp tăng cường tiếp 72 xúc (%) Bảng 3.19 ảnh hưởng thời gian hút chân không tới biểu tạm 73 thời Bảng 3.20 ảnh hưởng mật độ vi khuẩn tới biểu tạm thời 74 B¶ng 3.21 ¶nh h­ëng cđa AS tíi tû lƯ biĨu tạm thời gen GUS 75 cánh bèo Bảng 3.22 ảnh hưởng kanamycine tới hệ số nhân sức sống bèo 76 LA Bảng 3.23 ảnh hưởng hygromycine tới hệ số nhân sức sống bèo LA 78 Danh mục hình biểu đồ Danh mục hình Thứ tự hình Trang Hình 1.1 Vòng sinh sản vô tính L aequinoctialis 13 H×nh 1.2 Hoa cđa L.aequinoctialis 14 H×nh 1.3 CÊu trúc Ti plasmid dạng octopine 27 Hình 1.4 Cơ chế lây nhiễm A tumefaciens vào tế bào thực vật 29 Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc hệ vector nhị thể 30 Hình 1.6 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 31 Hình 2.1 Bèo Lemna aequinoctialis 36 Hình 2.2 Cấu trúc đoạn T-DNA vector nhị phân chủng AA5 36 Hình 2.3 Vector nhị phân pCAMBIA1301 37 Hình 3.1 Một số hình ảnh bèo LA tái sinh sau khử trùng 47 Hình 3.2 Bèo nhân môi trường H/5+1,5% sucrose, pH=6,0 53 Hình 3.3 Callus tạo N6/2 với kết hợp 2,4D +BAP 54 Hình 3.4 Mô callus dạng II 55 Hình 3.5 Callus dạng I tạo từ callus dạng II 62 Hình 3.6 Nhân callus dạng I môi trường chứa 2,0mg/l 2,4D + 63 6,0mg/l BAP Hình 3.7 Tái sinh từ callus dạng II 65 Hình 3.8 Bèo tái sinh từ callus dạng I môi trường KTST 66 Hình 3.9 Tái sinh bèo từ callus dạng I 70 Hình 3.10 Biểu tạm tới gen GUS bèo với chủng 71 khác Hình 3.11 ảnh hưởng kanamycine tới bèo LA 78 Hình 3.12 ảnh hưởng hygromycine tới bèo LA 79 Danh mục biểu đồ Thứ tự biểu đồ Biểu đồ 3.1: ảnh hưởng hàm lượng khoáng Hutner đến hệ số nhân Trang 47 bèo LA Biểu đồ 3.2: ảnh hưởng pH lên hệ số nhân bèo 50 Biểu đồ 3.3 ảnh hưởng sucrose lên hệ số nhân bèo LA 52 Biểu đồ 3.4 ảnh hưởng kanamycine tới hệ số nhân sức sống bèo 77 LA Biểu đồ 3.5 ảnh hưởng hygromycine tới hệ số nhân sức sống bèo LA 79 77 45 129 2,87 67 45 125 2,78 65 KÕt qu¶ thÝ nghiƯm cho thÊy cã sù khác biệt hệ số nhân rõ rệt công thức có bổ sung kanamycine so với công thức đối chứng Hàm lượng kanamycine bổ sung vào môi trường cao hệ số nhân tỷ lệ sống giảm Có thể kết luận kanamycine đà kìm hÃm sinh trưởng phát triển cánh bèo Tỷ lệ cánh bèo sống thấp công thức bổ sung 200mg/l kanamycine (65%) cao công thức đối chứng (73%) chứng tỏ khoảng hàm lượng từ 0200mg/l kanamycine gây chết cánh bèo LA (xem hình 3.12) Vì kết luận sử dụng kanamycine với hàm lượng từ - 200mg/l cho chän 3.5 2.5 1.5 0.5 0.74 0.72 0.7 0.68 0.66 0.64 0.62 0.6 Kana 50 Kana 100 Kana 200 mg/l mg/l mg/l BiĨu ®å 3.4 ảnh hưởng kanamycine tới hệ số nhân søc sèng bÌo LA Tỷ lệ sống Hệ số nhân läc bÌo tÊm LA sau chun gen 78 Trªn cùng: công thức đối chứng Từ trái qua phải: công thức bổ sung 50, 100, Hình 3.11 ảnh h­ëng cđa kanamycine tíi bÌo LA 3.2.6.2 ¶nh h­ëng cđa hygromycine Trong thí nghiệm này, hàm lượng hygromycine: 0, 2, 5, 7, 10, 25, 50mg/l bổ sung vào môi trường nhân bèo H/5 + 1,5% sucrose Đánh giá kết cách đếm cánh bèo sau 10 ngày nuôi cấy, kết trình bày bảng 3.23 biểu thị biểu đồ 3.5 Bảng 3.23 ảnh hưởng hygromycine tới hệ số nhân sức sống bèo LA Công thức Số cánh ban đầu 45 Số cánh lúc ghi kết 316 45 7,03 Tû lÖ sèng (%) 74 47 1,05 11 45 47 1,05 45 46 1,03 45 45 1,00 45 45 1,00 45 45 1,00 HƯ sè nh©n 1.05 0.12 1.04 0.1 HƯ sè nh©n 1.03 0.08 1.02 0.06 1.01 Tû lÖ sèng 79 0.04 0.99 0.02 0.98 g/l m g/l m g/l m g/l m g/l m g/l m 5 ro gro gro ro ro ro g Hy Hy Hy Hy g Hy g Hy g Biểu đồ 3.5 ảnh hưởng hygromycine tới hệ số nhân sức sống bèo LA Hình 3.12 ảnh hưởng hygromycine tới bèo LA Trên cùng: đối chứng Từ trái qua phải: công thức bổ sung 10, 25, 50 mg/l hygromycine Ngoài bên trái: đối chứng Từ trái qua phải, từ xuống dưới: công thức bổ sung 2, 5, 7, 10 mg/l kanamycine 80 KÕt qu¶ thÝ nghiệm cho thấy tác động mạnh hygromycine tới sinh trưởng phát triển bèo LA công thức có bổ sung hygromycine bèo LA không nhân cánh tỷ lệ cánh chết cao hẳn so với công thức đối chứng Các công thức bổ sung từ 5mg/l hygromycine trở lên nhân cánh tỷ lệ cánh chết rÊt cao (92%) (xem h×nh 3.13) Cã thĨ kÕt ln hàm lượng mg/l hygromycine hàm lượng ngưỡng ức chế sinh trưởng phát triển bÌo tÊm Nh­ vËy, cã thĨ sư dơng hygromycine hµm lượng từ mg/l cho mục đích chọn läc bÌo LA sau chun gen nh­ng cịng cÇn l­u ý khả ức chế sinh trưởng gây chết cao kháng sinh để điều chỉnh thời gian số lần chọn lọc cho phù hợp 81 Kết luận đề nghị Kết luận 1.1 HƯ thèng t¸i sinh bÌo tõ callus +Khư trïng mÉu: sư dơng CaOCl 3% thêi gian phút +Môi trường nhân sinh khối bèo tấm: H/5 + 15g/l sucrose, pH 5,8-6,5 +Môi trường tạo callus: N6/2 + 2mg/l 2,4 D + 0,5mg/l BAP + 20g/l sucrose + 1g/l CH, pH=5,5-5,8 + Môi trường nhân callus dạng I: N6/2 + 2mg/l 2,4 D + 6,0mg/l BAP + 20g/l sucrose + 1g/l CH, pH=5,8 + Môi trường tái sinh cánh bèo từ callus dạng I: N6/2 + 20g/l sucrose + 100mg/l CH, pH=6,0 1.2 C¸c u tè cđa quy trình chuyển gen nguyên + Chủng vi khuẩn: AGL-1 +Phương thức tăng cường tiếp xúc vi khuẩn cánh bèo: Hút chân không 15 phút +Mật độ vi khn hun phï biÕn n¹p: OD 600 =1,0 +Nồng độ AS môi trường biến nạp: 200uM +Không dùng kanamycine hàm lượng từ 0-200mg/l môi trường cho chọn lọc bèo LA +Có thể dùng hygromycine hàm lượng từ 2-5mg/l cho chän läc bÌo tÊm LA sau chun gen Đề nghị 2.1 Hệ thống tái sinh + Tiếp tục tối ưu hoá yếu tố môi trường tạo callus dạng I từ callus dạng II + Nâng cao hiệu tạo callus dạng I môi trường tạo callus 82 +Tiếp tục tối ưu hoá môi trường nhân callus dạng I + Tiếp tục nghiên cứu tìm môi trường tái sinh cánh từ callus dạng I hiệu 2.2 Quy trình chuyển gen + Tiếp tục tối ưu hoá yếu tố khác môi trường biến nạp như: ảnh hưởng loại đường, ảnh hưởng pH, ảnh hưởng chất hỗ trợ lây nhiễm khác +Xác định điều kiện diệt khuẩn chọn lọc cánh bèo + Đánh giá biểu tạm thời phản ứng PCR kết hợp với điện di phát gen GUS tế bào, mô cánh bèo + Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng hygromycine kháng sinh nhóm tới sức sống bèo LA nhằm tìm loại kháng sinh nồng độ chọn lọc thích hợp 83 Tài liệu tham khảo A Tài liệu tiếng việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học cải tiến giống trồng, Nhà xuất Nông nghiệp Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, Nhà Xuất Khoa học & Kỹ thuật Lê Thị Thu Hiền (2003), Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào trồng, Luận án Tiến sÜ Sinh häc, ViƯn C«ng nghƯ Sinh häc, ViƯn Khoa học Công nghệ Việt Nam Hoàng Thị Sáu, Trần Văn Ba (1998), Giải phẫu hình thái học thực vật Nhà xuất giáo dục Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng Nhà xuất Nông nghiệp B Tài liệu tiếng Anh Appenroth K-J, Augsten H.(1996), WasserLincencend ihre Nutzung, Biologie in unserver zeit 26(3), pp 187-194 Bako L., Umeda M., Tiburcio A.F., Schell J., Koncz C (2003), “The Vir D2 pilot protein of Agrobacterium-transferred DNA interacts with the TATA Box-binding protein and a nuclear protein kinase in plant”, Proc Natl Acad Sci USA 100, pp 10109-10113 Becerra M., Preston T.R and Ogle B (1995), Effect of replacing whole boiled soya beans with duckweed (Lemna spp) in diets of growing ducks, Livestock Research for Rural Development, 7(3), FAO 84 Bergman B.A., Cheng J., Classen J., Stomp A-M (2000), “In vitro selection of duckweed geographical isolates for potential use in swine lagoon effluent renovation”, Bio resoverce technology 73, pp 13-20 10 Birch R.G (1997) “Plant transformation: problems and strategies for practical application”, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48, pp 297–326 11 Braun A.C (1947), “Thermal studies on the factors responsible for tumor initiation in crown gall”, Am J Bot 34, pp 234-240 12 Braun A.C (1958), “A physiological basis for autonomons growth of the crown-gall tumor cell”, Proc Natl Acad Sci USA 44, pp 344-349 13 Chang W and Hsing Y (1978), “Callus formation and regeneration of frond-like structures in Lemna perpusilla 6746 on a defined medium”, Plant Science letters 13, pp 133-136 14 Chang W.C., Chiu P.L (1978), “Regeneration of Lemna gibba G3 through callus culture” Z Pflanzenphisiol 89, pp 91-94 15 Cytovsky V., Wong M.L., Zambyski P (1989), “Cooperative interaction of Agrobacterium Vir D2 protein with single stranded DNA: implication for the T-DNA transfer process”, Proc Natl Acad Sci USA 86, pp 1193-1197 16 D’Halluin K., Bonne E., Bossut M., De Beukeleer M and Leemans J (1992), “Trangenic maize plants by tissue electroporation”, The Plant Cell 4, pp 1495-1505 17 Desfeux C., Clough S.J., Bent A.F (2000), “Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method”, Plant Physiol 123, pp 859-904 85 18 Dessaux Y., Petit A., Farrand S.K and Murphy P.J (1998), Opines and opine-like molecules involved in plant-Rhizobiaceae interactions The Rhizobiaceae: molecular biology of model plant-associated bacteria Knewer Academic Publishers, The Netherlands 19 Durenberger F., Crameri A., Hohn B., Koukolikova Nicola Z (1989), “Covalently bound Vir D2 protein of the Agrobacterium tumefactiens protects the T-DNA from endonucleolytic degradation” Proc.Natl Acad sci USA 86, pp 9154-9158 20 Edwin E., George Ph.D (1993/1996), Plant propagation by tissue culture Exegetics Limited 2nd edition 21 Eldeman M., Perl A., Flaishman M., Blumethal A (1999), Transgenic Lemnaceae, Patent No WO 99/19498 22 Frick H (1991), “Callogenesis and carbohydrate utilization in Lemna minor”, J Plant Phisiol 137, pp 397-401 23 Frick H., Marley K (1995), “Metabolism of lactose by Lemna minor L ( duckweed) callus” Process Biochemical 30, pp 57-62 24 Fujita M., Mori K., Kodera T (1999), “Nutrient removal and starch production through cultivation of Wolffia arrhiza” J Biosci Bioeng 87(2), pp 194-198 25 Gasdaska J.R., Spencer D and Dickey L (2003), “Advantages of Therapeutic Protein Production in the aquatic Plant Lemna” www.bioprocessingJournal.com 26 Gelvin S.B (2003), “Agrobacterium-mediated plant transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool”, Microbiology and Molecular Biology Review 67, pp 16-37 86 27 Griesbach R.J and Hammomd J (1994), “An improved method for transforming plant through electrophoresis” Plant Science 102, pp 81-89 28 Hajdukiewicz P., Svab Z., Maliga P (1994), “The small, versatile pPZP familly of Agrobacterium binary vectors for plant transformation”, Plant Mol Biol 25, pp 989-994 29 Hooykaas P.J.J and schiperoort R.A (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Molecular Biology 19, pp 15-38 30 Hooykaas P.J.J., Klapwijk P.M., Nuti M.P., Schilperoot R.A and Rorsch A (1997), “Transfer of the Agrobacterium tumefactiens T:plasmid to avioulent Agrobacteria and to Rhizobium ex Planta”, Journal Gen Microbiol.18, pp 477-484 31 Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Mol Biol 19, pp 15–38 32 Hooykaas P.J.J., Schilperoot R.A and Rorch A (1979), “Agrobacterium tumor inducing plasmids, potential vectors for the genetic engineering of plants”, Genetic engineering 1, pp 151-179 33 Hutner S.H (1953), Comparative physiology of heterotrophic growth in plants In: Growth and Differentiation in Plants Iowa State College Press, USA 34 Jefferson R.A (1987), “Assaying chimeric genes in plant: the GUS gen fusion system” Plant Mol Biol Report 5, pp 387-405 35 Jefferson R.A (1989), “The GUS reporter gene system” Nature 342, pp 837-838 87 36 Jefferson R.A., Kavanagh T.A and Bevan M.W (1987), “GUS fusion: βglucusidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant”, EMBO journal 6(13), pp 3901-3907 37 Katavic V., Haughn G.W., Reed D., Martin M., Kunst L (1994), “In planta transformation of Arabidopsis thaliana”, Mol Gen Genet 245, pp 363–370 38 Khang N.T.K and Brian O (2003), Effect of dietary protein level and a duckweed supplement on the growth rate of local breed chicks MSc thesis 39 Khanna H., Becker D., Kleidon J and Dale J (2004), ”Centrifugation Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (CAAT) of embryogenic cell suspensions of banana (Musa spp Cavendish AAA and Lady finger AAB)”, Mol Breed 14, pp 239-252 40 Khanum J (2004), Study on digestibility and feeding system of duckweed in ducks and their rural production in Bangladesh, Msc Thesis, Denmark 41 Landolt E (1986), The family of Lemnaceae-a monographic study Vol 1, Veroff Geobot Inst ETH, Stiftung Rubel, Zurich, Heft 71 42 Landolt E., Kankeler R (1987), The family of Lemnaceae-a monographic study Vol 2, Veroff Gebot Inst ETH, Stiftung Rubel , Zurich, Heft 95 43 Leng R.A., Stambolie J.H., and Bell R.E (1994), Duckweed a potential high protein feed resource for domestic animals and fish In: Improving animal production systems based on local feed resources 7th AAAP Animal Science Congress, pp 100-117 44 Les D.H., Crawford D.J., Landolt E., Gabel J.D., and Kimball R.T (2002), “Phylogeny and systematics of Lemnaceae, the Duckweed Family”, Systematic Botany 27(2), pp 221-240 88 45 Les H.L , Crawford D.J (1999), “Landoltia (Lemnaceae), a new genus of duckweeds”, Novon 9, pp 530-533 46 Les H.L , Landolt E , Crawford D.J (1997), “Systematics of Lemnaceae: inferences from micromolecular and morphological data”, Plant System Evolution 204, pp 161-177 47 Li J., Jain M., Vunsh R., Vishnevetsky J., Hanania U., Flaishman M., Perl A., Edelman M (2004), “Callus induction and generation in Spirodela and Lemna”, Plant cell Report 22, pp 457-464 48 Link G.K and Egger S.V (1941), “Hyperauxiny in crown gall of tomato” Bot.Gaz.103, pp 87-106 49 Mclean B.G., Greene E.A., Zambryski P.C (1994), “Mutants of Agrobacterium VirA that active vir gene expression in the absence of the inducer acetosyringone”, The Journal of Biol Chemis 269(4), pp 2645-2651 50 Men B.X., Ogle R.B and Preston T.R (1995), “Use of duckweed (Lemna spp) as replacement for soya bean meal in a basal diet of broken rice for fattening ducks” Livestock Research for Rural Developmen 7(3), pp 5-8 51 Moon H.K., Stomp A.M (1997), “Effects of medium components and light on callus induction, growth, and frond regeneration in Lemna gibba (duckweed)”, In Vitro Cell Dev Biol Plant 33, pp 20-25 52 Morikawa H and Yamada Y (1985), “Capillary microinjection into protoplasts and intra nuclear localization of injected materials” Plant cell physiology 26, pp 229-236 53 Murashige T., Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”, Phisiology of Plant 15, pp 473-497 89 54 Muztar A.J., Slinger S.J and Burton J.H (1976), “Nutritive value of aquatic plants for chicks”, Poultry Science 55, pp 1917-1921 55 Negrotto D., Jolley M., Beer S., Wenck A.R.G (2000), “The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation”, Plant Cell Rep 19, pp 798-803 56 Roa-Rodriquez C and Nottenburg C (2003), Agrobacterium-mediated transformation of plants, CAMBIA IPR, Canberra, ACT 2601 57 Rohini V.K., Rao S.K (2000), “Transformation of peanut (Arachis hypogaea L.): a non-tissue culture based approach for generating transgenic plants” Plant Sci 150, pp 41–49 58 Rothwell G.W., Van Atta M.R , Ballard Jr.H.E and R.A Stockey (2004), “Molecular phylogenetic Relationships among Lemnaceae and Araceae using the Cloroplast trnL-trnF intergenic spacer” Molecular phylogenetics and Evolution 30, pp 378-385 59 Rusoff L.L., Blakeney W.W and Culley D.D (1980), “Duckweeds (Lemnaceae family): A potential source of protein and amino acids”, Journal of Agricultural and Food Chemistry 28, pp 848-850 60 Schilperoot R.A., Veldstra H., Warnaar S.O., Mulder Gand Cohen J A (1967), “Formation of complexes between DNA isolated from tobacco crown gall tumors and complementary to Agrobacterium tumefactiens DNA”, Biochin Biophys Acta.145, pp 523-525 61 Sharma K.K., Bhatnagar-Mathur P., and Thorpe T.A (2005), “Genetic transformation technology: status and problems”, In Vitro Cell Dev Biol Plant 41, pp.102–112 90 62 Smith E.F., Towsend C.O, (1907), “A plant tumor of bacterial origin”, Natural science XXV(643), pp 671-673 63 Stefaniak B., Wozng A and Budna T (2002), “Callus induction and plant regeneration in Lemna minor L.” Biologia Plantarium 45(3), pp 469-472 64 Stomp A-M, Rajbhardari N (2000), Genetically engineered duckweek US patent No 6040498 65 Sungstad D.D., Somers D.A and Griesbach R.J (1995), “Advance in alternative DNA delivery techniques”, Plant cell Tissue Organ Culture, 40, pp 1-15 66 Taylor N.J and Fauquet C.M (2002), “Micro-particle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology” DNA and Cell Biology 21(12), pp 963-977 67 Trick H.N., Finer J.J (1997), “SAAT: sonication-assisted Agrobacteriummediated transformation”, Transgenic Res 6, pp 329–337 68 Trieu A.T., Burleigh S.H., Kardailsky I.V., Maldonado-Mendoza I.E., Versaw W.W.K., Blaylock L.A., Shin H., Chiou T.J., Katagi H., Dewbre G.R., Weigel D., Harrison M.J (2000), “Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium”, Plant J 22, pp 531–541 69 Trojanowska M.R (2002), “Alternative methods of plant transformation-A short review” Cellular and Molecular Biology Letters 7, pp 849-858 70 Tzfira T and Citovsky V (2003), “The Agrobacterium-plant cell Interaction Taking Biology Lessons from a Bug”, Plant Physiology 133, pp 943-947 71 Valentine L (2003), “Agrobacterium tumefactiens and the plant: The David and Goliath of Modern Genetic”, Plant Physiology 133, pp 948-955 91 72 Van Larebeke N., Enbler G., Holster M., Van Den Elsacker S., Zaenen I., Schilperoot R.A and Schell J (1974), “Large plasmid in Agrobacterium tumefactiens essential for crown gall-inducing ability”, Nature 252, pp 169170 73 Walkerpeach C.R., Velten J (1994), “Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells: cointergrate and binary vector systems”, Plant Mol Biol Manual 1: 1-19 74 White P.R and Braun A.C (1941), “Crown gall production by bacteriafree tumor tissues”, Science 94, pp 239-241 75 Yamamoto Y.T., Rajbhandari N., Lin X.H., Bergmann B.A., Nishimura Y and Stomp A-M (2001), “Genetic transformation of duckweed Lemna gibba and Lemna minor”, In Vitro Cell.Dev Biol-Plant 37, pp 349-353 76 Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer B., Hooykaas P.J.J., Farrand S.K and Winans S.C (2000), “The Bases of Crown Gall Tumorigenesis”, Journal of Bacteriology 182(14), pp 3885-3895 77 Zhu Z., Sun B., Liu C., Xiao G and Li X (1993) Transformation of wheat protoplasts mediated by cationic liposome and regeneration of transgenic plantlet China Journal Biotechnology, 9: 257-261 78 Zimmerman J.L (1993), “Somatic Embryogenesis: A model for Early Development in Higher Plant” The Plant Cell 5, pp 1411-1423 79 Zupan J., Muth Th.R., Draper O and Zambryski P (2000), “The transfer of DNA from Agrobacterium tumefactiens into plants: a feast of fundamental insights”, The plant Journal 23, pp 11-28 ... chuyển vào A tumefaciens (Walkerpeach Velten, 1994) 1.5 Tình hình nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh hệ thống chuyển gen bèo 1.5.1 Các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh Có nghiên cứu xây. .. gen vào bèo Đặc biệt công bố mang tính hệ thống chi tiết hệ thống tái sinh chuyển gen bèo L aequinoctialis Trên sở phân tích thực đề tài: Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh chuyển gen vào bèo. .. nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh 1.5.2 Các nghiên cứu chuyển gen vào bèo Chương Vật liệu phương pháp nghiên 32 33 35 cứu 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên