Nghiên cứu một số giải pháp sinh học trong công nghệ sản xuất nem chua

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Phan Thanh Tâm NGHIÊN CỨU MỘT SỐ GIẢI PHÁP SINH HỌC TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT NEM CHUA Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thực phẩm đồ uống Mã số: 62.54.02.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÀ NỘI - 2008 Cơng trình hồn thành tại: Bộ mơn Cơng nghệ Thực phẩm - Công nghệ Sau thu hoạch Viện Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Hoàng Đình Hịa PGS.TS Phạm Cơng Thành Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Thành Đạt - Trường ĐH Sư phạm HN Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Hoài Trâm - Viện Công nghiệp Thực phẩm Phản biện 3: PGS.TS Hà Thị Anh Đào - Viện Dinh dưỡng Quốc gia Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước họp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Vào hồi ….giờ … ngày … tháng … năm 2008 Có thể tìm hiểu lu ận án tại: - Thư viện Quốc gia Thư viện Trường Đại học Bách khoa Hà Nội DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Phan Thanh Tam, (2003) “Study on effects of carbonhydrate‘s content and source on lactic fermentation and sausages qualities” Proceedings of the 8th Asean Food Conference (AFC 03), Vol 2, p679 - 684 Phan Thanh Tam, Ha Hai Yen, Do Thi Hanh, Tran Lien Ha, (2005) ”Study on the Antimicrobial Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated from nem chua (Vietnamese Fermented Meat)” Proceedings of Regional Symposium on Chemical Engineering 2005, Science and Technics Publishing House, Vol 1: Biotechnology and Food Engineering, p115-120 Phan Thanh Tam, Do Thi Hanh, Tran Lien Ha, Hoang Dinh Hoa, (2005) “Isolation and characterization of Lactobacillus plantarum H1.40, from Vietnamese tradition fermented meat (nem chua)” Proceedings of Regional Symposium on Chemical Engineering 2005, Science and Technics Publishing House, Vol 1: Biotechnology and Food Engineering, p121-126 Hồng Đình Hịa, Phan Thanh Tâm, Phạm Thị Thu Hiền, (2006) “Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm từ tỏi (Allium sativum) nhằm ứng dụng để bảo quản thực phẩm” Tuyển tập Hội nghị khoa học lần thứ 20 Trường ĐHBK Hà Nội, Phân ban Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, trang 120 -125 Phan Thanh Tâm, Phạm Công Thành, Phạm Thị Thu Hiền, (2006) “Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm tỏi công nghệ sản xuất nem chua nhằm nâng cao chất lượng kéo dài thời gian bảo quản” Tuyển tập Hội nghị khoa học lần thứ 20 Trường ĐHBK Hà Nội, Phân ban Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, trang 224 -229 Phan Thanh Tâm, Chử Thị Mai Phương, (2007) “Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp bacterioxin chủng Lactobacillus plantarum H1.40 đặc tính chúng” Tạp chí Khoa học Công nghệ Trường đại học kỹ thuật, số 61, trang 107-112 Phan Thanh Tâm, Phạm Công Thành, (2007) ”Khảo sát yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến chất lượng nem chua” Tạp chí Khoa học Công nghệ Trường đại học kỹ thuật, số 62, trang 76 - 81 Hồng Đình Hịa, Phan Thanh Tâm, (2008) “Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính thuỷ phân protein thịt cao nhằm ứng dụng cơng nghệ sản xuất nem chua” Tạp chí Khoa học Công nghệ Trường đại học kỹ thuật, số 64, trang 95 -100 Phan Thanh Tâm, Vũ Thị Nga, (2008) “Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic nhằm ứng dụng cơng nghệ sản xuất nem chua” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Trường đại học kỹ thuật, số 65, trang 105 - 109 A ĐẶC ĐIỂM CỦA LUẬN ÁN Tính cấp thiết đề tài Các ăn truyền thống dân tộc bị mai qui trình cơng nghệ sản xuất thủ cơng, khơng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Trong số sản phẩm thịt lên men truyền thống “ nem chua “ mức báo động chất lượng ô nhiễm vi sinh vật lạm dụng hóa chất bảo quản gây nguy hại đến sức khỏe người tiêu dùng Thêm vào chưa có tiêu chuẩn cụ thể để kiểm sốt chất lượng cho nhóm sản phẩm Hiện giới ngày quan tâm đến việc ứng dụng thành phần kháng khuẩn có chất tự nhiên (Natural food antimicrobial systems) để nâng cao tính an toàn cho sản phẩm thực phẩm, nhiên Việt Nam vấn đề gần mẻ Chính việc tìm giải pháp tuyển chọn chủng giống vi sinh vật có khả ức chế nhóm vi sinh vật gây hại, có khả lên men tốt, kết hợp với nguồn kháng khuẩn từ thực vật thay cho hóa chất bảo quản độc hại để nâng cao chất lượng, kéo dài thời gian bảo quản cho nhóm sản phẩm cần thiết Mục tiêu đề tài - Tuyển chọn giống vi sinh vật có khả lên men lactic nem chua tốt, sinh tổng hợp bacterioxin cao, thủy phân protein thịt tốt đồng thời đóng vai trị nguồn cung cấp probiotic cho thể Kết hợp với nguồn kháng khuẩn từ tỏi nhằm nâng cao chất lượng VSATTP cho sản phẩm - Xây dựng qui trình cơng nghệ sản xuất nem chua an tồn, có tính khả thi cao, dễ dàng áp dụng qui mô sản xuất vừa nhỏ Đối tượng phạm vi nghiên cứu Các sản phẩm nem chua tiếng số vùng miền nước tiến hành khảo sát chất lượng phân lập tuyển chọn nguồn vi khuẩn lactic có đặc tính tốt Nghiên cứu khả kháng khuẩn chế phẩm tỏi thu nhận từ giống tỏi trắng (Allium sativum) trồng phổ biến nước Phạm vi áp dụng đề tài: nâng cao chất lượng cho sản phẩm nem chua (thịt lên men) vùng miền nước, dễ dàng áp dụng qui mô sản xuất nhỏ, vừa, công nghiệp Ý nghĩa khoa học thực tiễn  Đã đưa cảnh báo ban đầu vệ sinh an toàn thực phẩm sản phẩm nem chua thị trường Đó nhiễm vi sinh vật hàm lượng hóa chất bảo quản cao, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng  Đã nghiên cứu tìm giải pháp, đặc biệt ứng dụng cơng nghệ sinh học tìm hỗn hợp chủng giống vi khuẩn lactic với đặc tính sinh học tốt giúp định hướng trình lên men kiểm soát chất lượng Nguồn hợp chất kháng khuẩn có chất từ thực vật (tỏi) khai thác sử dụng có hiệu Kết nghiên cứu lần chứng minh chế biến thực phẩm khơng cần gia nhiệt thực qui trình sản xuất an tồn  Là cơng trình nghiên cứu tổng thể q trình cơng nghệ sản xuất nem chua, giải trọn vẹn vấn đề từ khâu chủng giống đến khâu bảo quản sản phẩm cuối đề xuất qui trình khả thi sản xuất nem chua “an toàn “ Làm phong phú thêm khả ứng dụng chủng vi khuẩn lactic  Kết đề tài đóng góp tích cực việc xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng cụ thể cho nhóm sản phẩm thịt lên men nói riêng nhóm sản phẩm thực phẩm giàu protein lên men nói chung Những điểm luận án  Sản xuất chế phẩm từ tập hợp chủng vi khuẩn lactic địa có hoạt tính sinh học tốt: sinh tổng hợp bacterioxin có tính kháng khuẩn tốt; có hoạt tính proteaza cao hoạt tính probiotic để ứng dụng vào sản xuất nem chua  Đã tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimum Inhibit Concentrate) ba chế phẩm tỏi vi sinh vật gây bệnh ứng dụng có hiệu vào sản xuất nem chua  Là cơng trình nghiên cứu có hệ thống sở khoa học cho sản xuất nem chua truyền thống Việt Nam nhằm nâng cao chất lượng, đảm bảo VSATTP kéo dài thời gian sử dụng cho sản phẩm Kết góp phần đề xuất qui trình sản xuất “nem chua an toàn” dễ dàng áp dụng sở sản xuất vừa nhỏ Nội dung nghiên cứu: Khảo sát đánh giá thực trạng chất lượng nem chua thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng vệ sinh an toàn thực phẩm 2 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua có hoạt tính sinh học tốt: sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn bacterioxin, có hoạt tính proteaza cao tiềm probiotic nhằm ứng dụng làm chủng giống công nghệ sản xuất nem chua Nghiên cứu khả kháng khuẩn chế phẩm từ tỏi ứng dụng công nghệ sản xuất nem chua Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ sản xuất nem chua ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học tốt, chế phẩm tỏi tối ưu yếu tố công nghệ nhằm nâng cao chất lượng đảm bảo VSATTP Cấu trúc luận án Luận án trình bày 167 trang đánh máy gồm chương với 52 bảng, 82 hình, đồ thị Phần kết luận, 149 tài liệu tham khảo, phụ lục B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương TỔNG QUAN 1.1 Thịt lên men nem chua: Phân loại; Những biến đổi chuyển hóa xảy q trình lên men thịt; Nem chua sản phẩm thịt lên men tiếng Việt Nam thực trạng vấn đề VSATTP sản phẩm 1.2 Các giải pháp nâng cao chất lượng sản phẩm thịt lên men nem chua 1.2.1 Ảnh hưởng yếu tố công nghệ đến chất lượng sản phẩm thịt lên men, nem chua giải pháp tối ưu yếu tố 1.2.2 Giải pháp sử dụng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học tốt cơng nghệ sản xuất thịt lên men nem chua Sử dụng chủng giống vi sinh vật có lợi; vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp bacterioxin; vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza cao thuỷ phân protein thịt tốt; vai trò probiotic vi khuẩn lactic ứng dụng thịt lên men; Sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic ứng dụng sản xuất thịt lên men 1.2.3 Sử dụng tỏi - chất kháng khuẩn thực vật 1.2.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất nâng cao chất lượng nhóm sản phẩm thịt lên men, nem chua nước quốc tế 1.3 Từ dẫn liệu lý thuyết kết nghiên cứu trên, rút nhận xét sau: - Thịt lên men hỗn hợp cấu tử rắn trùng trước lên men, thịt nguồn ngun liệu có khả nhiễm cao đặc biệt bối cảnh giết mổ vận chuyển bảo quản thủ công Việt Nam Nem chua sản phẩm thịt lên men nhanh không qua trình xứ lý nhiệt nên nguy VSATTP sản phẩm cao - Lựa chọn chủng giống vi khuẩn có khả kháng khuẩn cao, thuỷ phân protein thịt tốt, có hoạt tính probiotic với nguồn hợp chất kháng khuẩn từ tỏi để định hướng trình lên men, nâng cao chất lượng sản phẩm nem chua việc làm cần thiết Thêm vào việc nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời yếu tố công nghệ đến tiêu chất lượng sản phẩm thơng qua tốn qui hoạch thực nghiệm để từ tìm yếu tố cho chất lượng sản phẩm tốt lời giải có ý nghĩa có tính khả thi điều kiện Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 2.1.1 Nguyên vật liệu Các mẫu nem chua dùng để phân lập vi khuẩn lactic để xác định thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng vi sinh vật thu thập từ số sở sản xuất có uy tín Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh, Thanh Hố, Vinh Ngun liệu tỏi nghiên cứu giống tỏi trắng trồng phổ biến Việt Nam Bao bì PE sản xuất nước, sẵn có thị trường Các chủng vi khuẩn thị: Lactobacillus plantarum JCM 1149 (Bộ sưu tập giống Nhật Bản), Chủng Lactococcus lactis subsp lactis ATCC 11454 (Bộ sưu tập giống Mỹ) có khả sinh tổng hợp nisin [84]; Staphylococcus aureus ATCC 25923; Bacillus cereus ATCC10876; Listeria monocytogens 0704 (ĐH Toulouse, Pháp); Ercherichia coli K12TG1 (Đại Học ENSBANA - Pháp); Salmonella typhimurium VSDTTW (Viện Vệ sinh dịch tễ TW) 2.1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: MRS (Man Rogosa Sharpe), MPA (Meat Pepton Agar), OGYA (Oxytetracycline Glucose Yeast Agar); Staphylococcus aureus 110 (Difco); VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar); Glucoza Agar; … 2.1.2 Thiết bị Nồi khử trùng, tủ cấy, tủ ni yếm khí (Nhật); tủ lạnh sâu (Nhật); Kính hiển vi điện tử quét SEM: JCM- 4510LV (Nhật); Ly tâm lạnh ống to Sorvall Super T21 (Mỹ); Máy so màu quang phổ (Anh); Sấy chân không Vacutherm Heraeus (Đức); Sắc ký lỏng cao áp HPLC Watters (Mỹ); Sắc ký khối phổ GC-MS2010 Shimadzu (Nhật); Thiết bị đo cấu trúc Texture Analysis RTC 1250 (Nhật), 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phương pháp vi sinh học - Các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật thông dụng Xác định số lượng Enterobacteriaceae theo phương pháp chuẩn F18 Anh [77]; Số lượng S aureus theo phương pháp PCR theo [88], [94] Xác định vi sinh vật gây bệnh khác Coliform:TCVN 4883:1993; E coli: TCVN 6846:2001; B cereus: TQBYT 3350:2001; C perfringens: TCVN 4991:1989; S aureus: TCVN 4830:1989 - Các phương pháp xác định khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic: cấy chấm điểm; khuếch tán thạch [51] - Tuyển chọn chủng có khả thuỷ phân protein sợi protein chất thịt [68], [106] - Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic chịu axit muối mật, sống sót cao mơi trường axit cao nghèo dinh dưỡng [122] - Xác định hoạt lực bacterioxin khả kháng khuẩn chế phẩm từ tỏi phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) [51] 2.2.2 Phương pháp hóa lý, hóa sinh - Phân tích thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng theo TCVN; … - Xác định hàm lượng nitrit nem chua theo AOAC 937.31; xác định nitrat theo TCVN 5247-1990 - Xác định hàm lượng axit amin tự theo phương pháp đo mầu trực tiếp với ninhydrin [5] - Đo cấu trúc (độ chắc) mẫu nem chua thiết bị đo cấu trúc Texture Analysis RTC 1250 (Nhật) với đầu đo Spherical Probes loại P/5S [63] - Xác định hàm lượng histamin dịch nuôi cấy vi khuẩn nem chua HPLC theo phương pháp [3], [59], [63] - Xác định thành phần hợp chất kháng khuẩn tỏi GC-MS HPLC theo phương pháp Lawson [20], [93], [110] 2.2.3 Phương pháp toán học thực nghiệm: theo ma trận trực giao cấp 2, kết xử lý phần mềm Nemrod 2000 Design Experd 7.1.3 2.2.4 Phương pháp đánh giá cảm quan: theo phương pháp cho điểm chất lượng tổng hợp sản phẩm theo TCVN 3215-79 [26] Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát đánh giá thực trạng chất lượng nem chua thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng vệ sinh an tồn thực phẩm 3.1.1 Thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng mẫu nem chua Tiến hành khảo sát 10 mẫu nem chua thành phố lớn Hà Nội, Thanh Hóa, Vinh TP Hồ Chí Minh Kết cho thấy hàm ẩm đa số mẫu nem chua cao từ 62,83 - 71,01% cho thấy nem chua sản phẩm thịt lên men nhanh có hàm ẩm cao nên việc kiểm sốt chất lượng sản phẩm khơng dễ dàng Hàm lượng protein tổng số: 18,61 - 22,42%; Lipit: 2,61- 4,48 %; Gluxit:1,87 - 5,91 %; axit amin tự do: 259,33 - 368,63 mg/ 100g cho thấy trình lên men tạo thành peptit axit amin dễ tiêu hóa tạo nên mùi vị đặc trưng cho sản phẩm; đạm amoniac NH3: 31,63 - 40,60 mg/ 100g sản phẩm, tiêu gián tiếp đánh giá q trình lên men khơng mong muốn vi sinh vật có hại Kết cho thấy nem chua có thành phần dinh dưỡng hài hịa, đặc biệt cung cấp lượng axit amin tự cao nhờ trình thủy phân protein thịt 3.1.2 Khảo sát số tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm mẫu nem chua 3.1.2.1 Khảo sát hàm lượng muối bảo quản nitrat nitrit mẫu nem chua Hình 3.1 Tổng hàm lượng muối nitrat, nitrit (tính theo nitrit) muối nitrit mẫu nem chua (ppm) HN1, HN2,HN3: Nem chua Hà Nội; Vinh: Nem chua Vinh-Nghệ An TH1, TH2,TH3:Nem chua Thanh Hoá; HCM1, HCM2:Nem chua TPHồ Chí Minh NC: Nem chua nghiên cứu có sử dụng 365ppm NaN03 theo QĐ Bộ Y tế Kết phân tích (hình 3.1) cho thấy tất mẫu nem chua số địa phương lớn nước có hàm lượng muối nitrat, nitrit vượt nhiều lần qui định cho phép áp dụng Việt Nam đa số quốc gia khác Mẫu cao có tổng lượng nitrat nitrit tính theo nitrit 1564 ppm gấp gần 10 lần quy định EU [63], [134] 12 lần theo TCVN, riêng hàm lượng nitrit 683 ppm gấp lần qui định EU gấp gần lần TCVN 7050-2002 [19] 3.1.2.2 Khảo sát thành phần số loại vi sinh vật mẫu nem chua Kết 10/10 mẫu nem chua khảo sát địa phương không đạt tiêu vi sinh vật, đặc biệt Enterobacteriaceae (104-106 CFU/ g sản phẩm) S aureus (103 - 105 CFU/ g sản phẩm) gấp vài chục đến hàng trăm lần cho phép theo tiêu chuẩn áp dụng số nước Ailen [71] hay Úc Niuzilân [72] 3.2 Sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic từ nem chua có đặc tính sinh học tốt: sinh tổng hợp bacterioxin, có hoạt tính thủy phân protein thịt tốt, có tiềm probiotic cao nhằm ứng dụng công nghệ sản xuất nem chua 3.2.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin đặc tính chúng 3.2.1.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin Từ 108 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua có khả lên men lactic tốt, sinh axit cao lựa chọn 20 chủng có khả kháng cao với L plantarum JCM 1149 Trong số có 12 chủng có khả kháng cao với loại vi sinh vật gây bệnh: S aureus ATCC 25923, S typhimurium VSDTTW, L monocytogen 0704, E coli K12TG1 B cereus ATCC 10876 theo phương pháp cấy chấm điểm Bằng phương pháp khuyếch tán thạch loại trừ tác dụng a xit, có số có khả kháng với số vi sinh vật gây bệnh chủng H1.40 có khả kháng cao với loại vi sinh vật gây bệnh nói (thể hình 3.2 đến 3.5) Thí nghiệm khẳng định khả sinh bacterioxin (hình 3.8) hai chủng H1.40 chủng L lactis subsp lactis ATCC 11454 (chủng ngân hàng giống Mỹ khẳng định có sinh nisin) cho thấy dịch ni cấy có chứa thành phần kháng khuẩn hai chủng hoạt tính bị thuỷ phân enzym proteaza K, khẳng thành phần kháng khuẩn có chất protein Ảnh tế bào khuẩn lạc chủng H1.40 thể hình 3.9 3.10 cho thấy tế bào có hình dạng que, xếp đơi chuỗi Các đặc tính khác là: Gram (+), Catalaza (-), Sinh khí lên men glucoza (-); Định tên kit API 50CHL (BioMérieux, France) cho thấy chủng H1.40 thuộc loài L plantarum với độ tương đồng đạt 99,99% LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết thí nghiệm trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí, tập san khoa học với đồng ý đồng tác giả, phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Tác giả luận án Phan Thanh Tâm Những chữ viết tắt ADN ARN AGE AOAC ATCC ATP AU/ml BIO-NC CFU CF cs DFD ĐC EDTA Eh EU FDA Gram (+) Gram (-) GC GC/MS GO GP HN HCM HPLC Deoxyribonucleic Acid (Axit Deoxyribonucleic) Ribonucleic Acid (Axit Ribonucleic) Aqueous Garlic Extraction (Dịch chiết nước tỏi tươi) Association of Official Analytical Chemist (Tập hợp phép phân tích hóa học) American Type Culture Collection (Bộ sưu tập giống chuẩn Mỹ) Adenosin - 5’- Triphotphat Activity Unit/ ml (Đơn vị hoạt tính bacterioxin) Hỗn hợp chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học tốt ứng dụng sản xuất nem chua (kết nghiên cứu luận án) Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) Chế phẩm Cộng Dark - Firm - Dry (Chất lượng thịt: Sẫm màu - Cứng - Khô) Đối chứng Etylen Diamin Tetraaxetic Axit Redox Potential (Thế oxy hóa khử) European Union (Liên minh châu Âu) U.S Food and Drug Administration (Cục quản lý thuốc thực phẩm Mỹ) Vi khuẩn gram dương Vi khuẩn gram âm Gas Chromatography ( Sắc ký khí ) Gas Chromatography/ Mass Spectrometry (sắc ký khối phổ) Garlic Oil ( Dầu tỏi ) Garlic Powder ( Bột tỏi ) Hà Nội Thành phố Hồ Chí Minh High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) JCM Japanese Collection of Microorganism ( Bộ sưu tập giống Nhật Bản) KC Kiểm chứng KĐ Kiểm định LAB Lactic Acid Bacteria MIC Minimum Inhibition Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MM Muối mật MPA Meat Pepton Agar (Môi trường nuôi cấy vi khuẩn) MRS Man Rogosa Sharpe (Môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn lactic) MT Môi trường NC Nghiên cứu NSD Ngày sử dụng OD Optical Density (Mật độ quang) OGYA Oxytetracycline Glucosa Yeast Agar (Môi trường phân lập nuôi cấy nấm men, nấm mốc) PBS Phosphate buffered saline (Muối đệm photphat) PCR Polymerase Chain Reation - Phản ứng tổng hợp dây chuyền polymeraza PE Polyethylene PMF Proton Motive Force (Lực đẩy proton) PP Polypropylene Pp Phương pháp PSE Pale - Soft - Excutive (Chất lượng thịt: Tái - Mềm - Rỉ dịch) QĐ Quyết định Rpm Revolution per minute ( Vòng quay/phút ) SDS - PAGE Sodium Dodesulphate - Polyacrylamide gel electrophoresis SP Sản phẩm TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TH Thanh Hóa TLTBSS Tỷ lệ tế bào sống sót TƯ - LC Mẫu nem chua tối ưu yếu tố cơng nghệ bao gói chuối TƯ- PE TQBYT Vinh VRBGA VSATTP VSDT TW VSV Mẫu nem chua tối ưu yếu tố công nghệ bao gói PE hút chân khơng Thường qui Bộ Y tế Thành phố Vinh (Nghệ An) Violet Red Bile Glucose Agar (Môi trường phân lập đếm Enterobacteriaceae) Vệ sinh an toàn thực phẩm Vệ sinh dịch tễ trung ương Vi sinh vật Danh mục bảng Trang Bảng 1.1 Vai trị, chức nhóm vi sinh vật có lợi sử dụng 27 làm chủng giống khởi động sản xuất thịt lên men Bảng 1.2 Đặc điểm bacterioxin vi khuẩn lactic Bảng 1.3 Các nhóm hợp chất sulfur tỏi khả kháng 41 khuẩn Bảng 2.1 Ma trận thí nghiệm Hadamard Bảng 2.2 Các biến số ma trận thí nghiệm Hadamard khảo sát 63 yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp bacterioxin chủng vi khuẩn lactic Bảng 2.3 Các biến số ma trận thí nghiệm Hadamard khảo sát 64 yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng nem chua Bảng 2.4 Hàm mục tiêu tiêu chất lượng nem chua Bảng 2.5 Ma trận thí nghiệm trực giao cấp thiết kế với K 65 biến Bảng 3.1 Thành phần hoá học, thành phần dinh dưỡng mẫu nem chua thị trường 69 10 Bảng 3.2 Thành phần số loại vi sinh vật mẫu nem chua thị trường 69 11 Bảng 3.3 Đặc điểm tế bào, khuẩn lạc chủng vi khuẩn lactic phân 72 lập từ nem chua 12 Bảng 3.4 Khả kháng Lb plantarum JCM 1149 chủng 73 vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua (theo phương pháp cấy chấm điểm) 13 Bảng 3.5 Khả kháng vi khuẩn gây bệnh chủng vi 75 khuẩn lactic phương pháp cấy chấm điểm 14 Bảng 3.6 Khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic theo 76 phương pháp khuyếch tán thạch 15 Bảng 3.7 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố chủng 79 H1.40 chủng Lc lactis subsp lactis ATCC11454 16 Bảng 3.8 Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình sinh 83 tổng hợp bacterioxin hai chủng H1.40 ATCC 11454 theo ma trận Hadamard 30 62 64 17 Bảng 3.9 Kết thí nghiệm theo ma trận thực nghiệm trực giao 84 cấp chủng H1.40 ATCC 11454 18 Bảng 3.10 Giá trị tối ưu hàm mục tiêu hai chủng H1.40 86 11454 19 Bảng 3.11 Giá trị tối ưu biến giá trị tối ưu hàm 86 trình sinh tổng hợp bacterioxin chủng H1.40 11454 20 Bảng 3.12 Ảnh hưởng nồng độ sunfat amơn bão hồ đến khả 87 thu hồi bacterioxin chủng H1.40 ATCC 11454 21 Bảng 3.13 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính bacterioxin hai 88 chủng H1.40 ATCC 11454 22 Bảng 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian xử lý độ bền 89 bacterioxin chủng H1.40 ATCC 11454 23 Bảng 3.15 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian bảo quản đến độ bền 90 bacterioxin chủng H1.40 ATCC 11454 24 Bảng 3.16 Khả thuỷ phân protein chất sợi thịt 20 93 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua 25 Bảng 3.17 Hoạt độ enzim proteaza theo phương pháp Ason cải tiến 95 chủng H1.4, H1.3 H1.25 thời điểm nuôi cấy 26 Bảng 3.18 Đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng H1.4 27 Bảng 3.19 Ảnh hưởng pH nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt độ 97 proteaza (U/ml) chủng H1.4 28 Bảng 3.20 Số lượng chủng vi khuẩn lactic sống sót mơi trường 98 pH 2,5 muối mật 1% 29 Bảng 3.21 Khả sống sót mơi trường có muối mật 99 chủng vi khuẩn lactic 30 Bảng 3.22 Đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng II7.4 31 Bảng 3.23 Kết xác định hàm lượng histamin chủng vi 104 khuẩn lactic mẫu nem chua 32 Bảng 3.24 Ảnh hưởng tỷ lệ chất mang tới trình sấy chế 105 phẩm 33 Bảng 3.25 Đặc điểm chế phẩm chủng vi khuẩn lactic II7.4, 106 H1.4, H1.40 ATCC11454 trước sấy 34 Bảng 3.26 Kết sấy chân khơng chủng vi khuẩn lactic có 106 96 100 TLTBSS cao độ ẩm thấp 35 Bảng 3.27 Hoạt tính bacterioxin chế phẩm chủng H1.40 109 ATCC 11454 trước sau sấy chân không 36 Bảng 3.28 Ảnh hưởng chế độ sấy đến hoạt độ enzym proteaza 110 chủng H1.4 37 Bảng 3.29 Ảnh hưởng chế độ sấy đến tỉ lệ sống sót qua đệm PBS 110 khả sống môi trường MRS có bổ sung muối mật chủng II7.4 38 Bảng 3.30 Đánh giá chất lượng chế phẩm vi khuẩn lactic sau thời 111 gian bảo quản 39 Bảng 3.31 Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (mg/ ml) dịch chiết 115 nước tỏi tươi (AGE) chủng vi sinh vật thị (mật độ tế bào 104 CFU/ ml) 40 Bảng 3.32 Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (mg/ ml) bột tỏi 116 vi sinh vật thị (mật độ tế bào 104 CFU/ ml) 41 Bảng 3.33 Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (mg/ ml) dầu tỏi đối 116 với chủng vi sinh vật thị (mật độ 104 CFU/ ml) 42 Bảng 3.34 Thành phần số hợp chất kháng khuẩn có dầu tỏi 121 43 Bảng 3.35 Thành phần số hợp chất kháng khuẩn tỏi tươi, tỏi 122 bột (dự đoán ) 44 Bảng 3.36 Thành phần số loại vi sinh vật gây bệnh 124 mẫu nem chua có khơng bổ sung chế phẩm tỏi 45 Bảng 3.37 Thành phần số loại vi sinh vật mẫu nem 131 chua có khơng bổ sung vi sinh vật gây bệnh, chế phẩm vi khuẩn lactic chế phẩm tỏi 46 Bảng 3.38 Kết thực nghiệm đánh giá hàm mục tiêu chất 133 lượng nem chua theo ma trận Hadamard 47 Bảng 3.39 Kết thực nghiệm đánh giá hàm mục tiêu chất 136 lượng nem chua theo ma trận trực giao cấp 48 Bảng 3.40 Các phương án tối ưu giá trị biến 49 Bảng 3.41 Giá trị hàm mục tiêu chất lượng nem chua 140 phương án tối ưu 50 Bảng 3.42 Đánh giá chất lượng tiêu hóa lý cảm quan 142 mẫu nem chua sau thời gian lên men 30 thời gian bảo quản 140 51 Bảng 3.43 Đánh giá thành phần số vi sinh vật mẫu nem chua 143 sau thời gian lên men 30 thời gian bảo quản 52 Bảng 3.44 Đánh giá số loại vi sinh vật gây bệnh sinh độc tố 148 mẫu nem chua sau thời gian 30 lên men sau thời gian bảo quản 2oC Danh mục hình vẽ đồ thị Trang Hình 1.1 Một số hình ảnh sản phẩm thịt lên men giới Việt Nam Hình 1.2 Sự biến đổi sinh hóa chất q trình lên men thịt Hình 1.3 Qui trình cơng nghệ sản xuất nem chua truyền thống 17 Hình 1.4 Hình ảnh tế bào số vi sinh vật làm chủng giống 28 sản xuất thịt lên men Hình 1.5 Vai trò vi khuẩn lactic cầu khuẩn catalaza(+) 29 tương tác trình lên men xúc xích Hình 1.6 Cơ chế hình thành lỗ (pore) nisin màng 32 nguyên sinh chất tế bào có tham gia lipit II Hình 2.1 Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn phương 52 pháp khuếch tán thạch Hình 2.2 Sơ đồ nhận biết bacterioxin Hình 3.1 Tổng hàm lượng muối nitrat, nitrit (tính theo nitrit) 71 muối nitrit có mẫu nem chua (ppm) 10 Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn chủng H1.40(1) 77 chủng 11454(2) B cereus ATCC 10876 11 Hình 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn chủng H1.40(1) 77 chủng 11454(2) Stph aureus ATCC 25923 12 Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn chủng H1.40(1) 77 chủng 11454(2) L monocytogens TLU 13 Hình 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn chủng H1.40(1) 77 chủng 11454(2) E coli K12TG1 14 Hình 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn chủng H1.40(1) 77 chủng 11454(2) Sal typhimurium VSDT chủng H1.40 11454 15 Hình 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn chủng H1.40(1) 77 chủng 11454(2) Lb plantarum 1149 16 Hình 3.8 Sự thuỷ phân enzim proteaza K làm hoạt 78 tính bacterioxin chủng H1.40 ATCC 11454 53 17 Hình 3.9 Hình thái khuẩn lạc chủng H1.40 18 Hình 3.10 Hình thái tế bào chủng H1.40, ảnh kính hiển vi điện 80 tử với độ phóng đại 15.000 19 Hình 3.11 Hình thái khuẩn lạc chủng ATCC 11454 20 Hình 3.12 Hình thái tế bào chủng ATCC11454, ảnh kính hiển 80 vi điện tử với độ phóng đại 15.000 21 Hình 3.13 Động học sinh trưởng, khả lên men khả 81 sinh tổng hợp bacterioxin chủng H1.40 22 Hình 3.14 Động học sinh trưởng, khả lên men khả 81 sinh tổng hợp bacterioxin chủng ATCC11454 23 Hình 3.15 Ảnh hưởng NaCl NaNO2 đến khả sinh 91 trưởng, lên men hoạt tính bacterioxin chủng H1.40 24 Hình 3.16 Ảnh hưởng NaCl NaNO2 đến khả sinh 92 trưởng, lên men hoạt tính bacterioxin chủng ATCC11454 25 Hình 3.17 Khả thuỷ phân protein chất chủng 94 vi khuẩn lactic 26 Hình 3.18 Khả thuỷ phân protein sợi chủng vi 94 khuẩn lactic 27 Hình 3.19 Kết điện di SDS-PGE sản phẩm thuỷ phân 94 protein sợi dịch chiết tế bào vi khuẩn lactic 28 Hình 3.20 Hình thái khuẩn lạc chủng H1.4 96 29 Hình 3.21 Hình thái tế bào chủng H1.4, ảnh kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 15.000 96 30 Hình 3.22 Ảnh hưởng môi trường chứa NaCl 2% 97 NaNO2 200ppm đến sinh trưởng thay đổi pH dịch ni chủng H1.4 31 Hình 3.23 Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn lactic sống sót 100 mơi trường MRS có 4% muối mật 32 Hình 3.24 Mật độ tế bào sống sót đệm PBS pH 2,5 100 chủng LAB trước sau 3h nuôi cấy 33 Hình 3.25 Hình thái khuẩn lạc chủng II7.4 101 34 Hình 3.26 Hình thái tế bào chủng II7.4, ảnh kính hiển vi điện 101 80 80 tử với độ phóng đại 15.000 35 Hình 3.27 Ảnh hưởng môi trường chứa NaCl 2% 101 NaNO2 200ppm đến sinh trưởng thay đổi pH dịch nuôi chủng II7.4 36 Hình 3.28 Khả kháng chủng 11454, H1.4, II7.4 103 với chủng thị H1.40 37 Hình 3.29 Khả kháng chủng H1.40, H1.4, II7.4 103 với chủng thị 11454 38 Hình 3.30 Khả kháng chủng H1.40, 11454, II7.4 103 với chủng thị H1.4 39 Hình 3.31 Khả kháng chủng H1.40, 11454, H1.4 103 với chủng thị II7.4 40 Hình 3.32 TLTBSS độ ẩm chế độ sấy chân không 107 chủng H1.40 41 Hình 3.33 TLTBSS độ ẩm chế độ sấy chân khơng 107 chủng ATCC 11454 42 Hình 3.34 TLTBSS độ ẩm chế độ sấy chân không 108 chủng H1.4 43 Hình 3.35 TLTBSS độ ẩm chế độ sấy chân không 108 chủng II7.4 Qui trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt 113 tính sinh học ứng dụng cơng nghệ sản xuất nem chua 44 Hình 3.36 45 Hình 3.37 Hoạt tính kháng L monocytogenes bột 118 tỏi 46 Hình 3.38 Hoạt tính kháng E coli bột tỏi 47 Hình 3.39 Hoạt tính kháng Sal typhimurium bột 118 tỏi 48 Hình 3.40 Hoạt tính kháng nấm men LĐ4.2 bột tỏi 49 Hình 3.41 Động học sinh trưởng Sal typhimurium 119 MT có chế phẩm tỏi 50 Hình 3.42 Động học sinh trưởng B cereus MT có 119 chế phẩm tỏi 51 Hình 3.43 Động học sinh trưởng E coli MT có chế 119 phẩm tỏi 118 118 52 Hình 3.44 Động học sinh trưởng Stph aureus MT có 119 chế phẩm tỏi 53 Hình 3.45 Động học sinh trưởng L monocytogenes 119 MT có CP tỏi 54 Hình 3.46 Động học sinh trưởng nấm men LD42 119 MT có CP tỏi 55 Hình 3.47 Động học sinh trưởng Lb plantarum H1.40 119 MT có chế phẩm tỏi 56 Hình 3.48 Động học sinh trưởng nấm men TX42 MT có 119 chế phẩm tỏi 57 Hình 3.49 pH mẫu nem chua bổ sung tỏi tươi 58 Hình 3.50 Hàm lượng đạm amoniac NH3 mẫu nem chua 123 bổ sung tỏi tươi 59 Hình 3.51 pH mẫu nem chua có bổ sung bột tỏi 60 Hình 3.52 Hàm lượng đạm amoniac NH3 mẫu nem chua 123 bổ sung bột tỏi 61 Hình 3.53 pH mẫu nem chua có bổ sung dầu tỏi 62 Hình 3.54 Hàm lượng đạm amoniac NH3 mẫu nem chua 123 bổ sung dầu tỏi 63 Hình 3.55 pH mẫu nem chua thay đổi phương pháp 127 bao gói 64 Hình 3.56 Hàm lượng axit amin tự mẫu nem chua 127 thay đổi phương pháp bao gói 65 Hình 3.57 Hàm lượng đạm amoniac NH3 mẫu nem 127 chua thay đổi phương pháp bao gói 66 Hình 3.58 Cấu trúc (độ chắc) mẫu nem chua thay đổi 127 phương pháp bao gói 67 Hình 3.59 Số lượng Enterobacteriaceae mẫu nem 128 chua thay đổi phương pháp bao gói 68 Hình 3.60 Số Stph aureus mẫu nem chua thay đổi 128 phương pháp bao gói 69 Hình 3.61 Số lượng vi khuẩn lactic mẫu nem chua 128 thay đổi phương pháp bao gói 70 Hình 3.62 Số lượng nấm mốc mẫu nem chua thay đổi 128 phương pháp bao gói 123 123 123 71 Hình 3.63 Hàm lượng E coli mẫu nem chua có 132 khơng bổ sung VSV gây bệnh chế phẩm 72 Hình 3.64 Hàm lượng Stph aureus mẫu nem chua có 132 không bổ sung VSV gây bệnh chế phẩm 73 Hình 3.65 Kết hàm chập mục tiêu D phương án tối 141 ưu công nghệ sản xuất nem chua 74 Hình 3.66 pH mẫu nem chua nhiệt độ bảo quản 75 Hình 3.67 Hàm lượng axit amin tự mẫu nem chua 144 nhiệt độ bảo quản 76 Hình 3.68 Hàm lượng đạm amoniac NH3 mẫu nem 144 chua nhiệt độ bảo quản 77 Hình 3.69 Điểm đánh giá cảm quan mẫu nem nhiệt 144 độ bảo quản 78 Hình 3.70 Số lượng Enterobacteriaceae mẫu nem 145 chua sau 30 lên men nhiệt độ bảo quản 79 Hình 3.71 Số lượng Stph aureus mẫu nem chua sau 145 30 lên men nhiệt độ bảo quản 80 Hình 3.72 Số lượng nấm mốc mẫu nem chua sau 30 145 lên men nhiệt độ bảo quản 81 Hình 3.73 Số lượng vi khuẩn lactic mẫu nem chua 145 sau 30 lên men nhiệt độ bảo quản 82 Hình 3.74 Qui trình cơng nghệ sản xuất nem chua sử dụng vi 150 khuẩn lactic có hoạt tính sinh học, chế phẩm tỏi tối ưu yếu tố công nghệ 144 ... làm chủng giống công nghệ sản xuất nem chua Nghiên cứu khả kháng khuẩn chế phẩm từ tỏi ứng dụng công nghệ sản xuất nem chua Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ sản xuất nem chua ứng dụng chế... tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu số giải pháp sinh học công nghệ sản xuất nem chua " 3 Mục tiêu đề tài - Tuyển chọn giống vi sinh vật có khả lên men lactic nem chua tốt, sinh tổng hợp... ứng dụng công nghệ sản xuất nem chua Nghiên cứu xây dựng qui trình cơng nghệ sản xuất nem chua ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học tốt, chế phẩm tỏi tối ưu yếu tố công nghệ nhằm