Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính gây độc tế bào của loài hải miên petrosia nigricans

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA LOÀI HẢI MIÊN PETROSIA NIGRICAN NGÀNH: CƠNG NGHỆ HĨA HỌC MÃ SỐ: ĐINH THỊ PHƯƠNG ANH Người hướng dẫn: PGS TS TRẦN THU HƯƠNG HÀ NỘI 2008 LỜI CẢM ƠN Luận văn thực Bộ mơn Hóa Hữu cơ, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Trong suốt trình thực luận văn này, nhận giúp đỡ tận tình thầy cơ, anh chị bạn bè Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS TS Trần Thu Hương, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người giao đề tài, tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể Cán viên chức Bộ mơn Hố Hữu cơ, Bộ mơn Hố dược & Hố chất BVTV - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội gia đình, bạn bè người thân ln ln giúp đỡ, cổ vũ kịp thời động viên suốt thời gian học tập, cơng tác để hồn thành luận văn Hà nội, tháng 11 năm 2008 Đinh Thị Phương Anh MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng hình vẽ MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN CHUNG VỀ HẢI MIÊN 1.1.1 Vài nét Hải miên (Petrosia) 1.1.2 Giới thiệu loài Hải miên Petrosia nigricans 1.1.3 Mơ tả lồi Hải miên Petrosia nigricans 1.1.4 Vài nét phân bố Hải miên tự nhiên 1.1.5 Sơ lược thành phần hóa học Hải miên 1.1.6 Tác dụng dược lý loài Hải miên Petrosia nigricans 14 1.1.7 Tổng quan lớp chất Sterol 14 1.1.7.1 Giới thiệu lớp chất Sterol 17 1.1.7.2 Một số Sterol quan trọng 21 1.2 HOẠT TÍNH CỦA MỘT SỐ LỒI HẢI MIÊN 24 CHƯƠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Tổng quan chung phương pháp chiết 26 2.1.1 Đặc điểm chung chiết 26 2.1.2 Cơ sở trình chiết 26 2.1.3 Quá trình chiết thực vật 27 2.1.3.1 Chọn dung mơi chiết 27 2.1.3.2 Q trình chiết 28 2.2 Tổng quan chung phương pháp sắc ký 29 2.2.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc ký 29 2.2.2 Cơ sở phương pháp sắc ký 29 2.2.3 Phân loại phương pháp sắc ký 30 2.2.3.1 Sắc ký cột 30 2.2.3.2 Sắc ký lớp mỏng 32 2.2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc phân tử hợp chất 32 2.2.4.1 Phổ hồng ngoại IR 32 2.2.4.2 Phổ khối lượng MS 33 2.2.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 33 2.2.4.3 Phổ DEPT 34 2.2.4.4 Phổ 2D NMR 34 2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 35 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 36 3.1 Mẫu Hải miên 36 3.2 Phương pháp phân lập hợp chất 36 3.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 36 3.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 36 3.2.3 Sắc ký cột (CC) 37 3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 37 3.3.1 Phổ khối lượng (ESI-MS) 37 3.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 37 3.4 Phương pháp thực nghiệm 39 3.5 Hằng số vật lý liệu phổ hợp chất 42 3.5.1 Hợp chất PN1: Batilol 42 3.5.2 Hợp chất PN2: Petrosiol (chất mới) 42 3.5.3 Hợp chất PN3: 5,8-Epidioxycholest-6-en-3-ol 43 3.5.4 Hợ p chất PN4: Cholesterol 43 3.6 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào 44 CHƯƠNG THẢO LUẬN 45 4.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất PN1: Batilol 45 4.2 Xác định cấu trúc hoá học hợp chất PN2: Petrosiol 49 4.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất PN3 57 4.4 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất PN4 63 4.5 Thử hoạt tính chất phân lập từ loài Hải miên Petrosia nigricans 66 KẾT LUẬN 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT CC Sắc ký cột (Column chromatography) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) [α ]D Độ quay cực MS Phổ khối lượng (Mass spectroscopy) 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C C-NMR 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều ESI-MS Phổ khối lượng phun mù điện tử Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton HMQC Heteronuclear multiple quantum corehence HMBC Heteronuclear multiple bond connectivity DEPT Distortionless enhancement by polarisation transfer Me Nhóm metyl EtOAc Etylacetat BuOH Butanol δ Độ chuyển dịch hoá học (ppm) J Hằng số tương tác (Hz) H-NMR TÓM TẮT LUẬN VĂN Vài nét chung loài Hải miên (Petrosia nigricans) Petrosia chi bọt biển sinh sống phổ biến vùng biển Việt Nam Hiện chưa có cơng trình khoa học cơng bố thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài thuộc chi Mặc dù Bọt biển biết đến nguồn tài nguyên dồi hợp chất hóa học có cấu trúc phong phú thể hoạt tính đáng quan tâm Loài Hải miên Petrosia nigricans sưu tầm độ sâu 30 - 45m vùng biển Trường Sa, tỉnh Khánh Hoà, Việt Nam giám định tên khoa học TS Đỗ Công Thung, Viện Tài nguyên Môi trường Biển, Viện KH & CN Việt Nam Bằng phương pháp sắc ký kết hợp, hợp chất: Batilol (PN1); Petrosiol (PN2); 5,8-Epidioxycholest-6-en-3-ol (PN3); Cholesterol (PN4) phân lập từ dịch chiết metanol loài Hải miên Petrosia nigricans Trong hợp chất PN2 lần phân lập từ chi Petrosia Cấu trúc hợp chất xác định nhờ vào phương pháp phổ đại phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, C-NMR, DEPT 1350 DEPT 900), hai chiều (HSQC, 13 HMBC NOESY), phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI) Đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập Kết thử nghiệm cho thấy, hợp chất PN2 (Petrosiol) thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với hai dòng tế bào thử với giá trị IC50 3,82 μg/mL (KB - tế bào ung thư biểu mô người) 3,57 μg/mL (HepG-2 - tế bào ung thư gan người); PN3 (5,8-Epidioxycholest- 6-en-3-ol) thể hoạt tính mạnh với dòng tế bào thử với giá trị IC50 2.0 µg/mL (KB), 3.93 µg/mL (FL) 2.4 µg/mL (HepG-2); cịn hợp chất PN1, PN4 khơng biểu hoạt tính dịng tế bào thử Từ khóa: Bọt biển, Petrosia nigricans, Sterol, Petrosiol, Hoạt tính gây độc tế bào MỞ ĐẦU Đại dương nguồn tài nguyên vô to lớn, nơi chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất Đại dương nơi sinh sống 34 số 36 ngành sinh vật trái đất với 300.000 loài động thực vật biết đến Đây nguồn cung cấp vô số sản phẩm tự nhiên quý thiên nhiên ban tặng cho người Tuy nhiên từ ngàn đời người khai thác phần nhỏ loài sinh vật biển với tư cách nguồn lợi hải sản Trên thực tế ngồi vai trị to lớn ngành cơng nghiệp thực phẩm sản phẩm đại dương bước đầu nghiên cứu sử dụng ngành công nghiệp dược Các nghiên cứu giới năm gần cho thấy hoạt chất tách chiết từ nguồn sinh vật biển thể hoạt tính sinh học phong phú, nguồn nguyên liệu lý tưởng để tạo cung cấp mẫu hình cho hệ thuốc điều trị bệnh, đặc biệt bệnh hiểm nghèo Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật, mô hình nghiên cứu liên ngành nhà khoa học thuộc lĩnh vực Hố-Sinh-YDược nhằm tìm kiếm thuốc từ nguồn hợp chất thiên nhiên biển áp dụng nhiều nước giới Mỹ, Úc, Hàn Quốc, Nhật Bản Rất nhiều thuốc có nguồn gốc sinh vật biển có mặt thị trường hãng dược lớn giới cung cấp thuốc điều trị ung thư Ara-C (Cytarabin) chiết tách từ loài Hải miên Cytotethy cryta, thuốc kháng sinh Phycocrythin có nguồn gốc từ tảo đỏ (Red algae) Bên cạnh đó, hướng nghiên cứu cơng nghệ chiết xuất, phân lập hoạt chất từ nguồn dược liệu biển có trữ lượng lớn rong biển, hải sâm phế thải ngành công nghiệp chế biến hải sản quan tâm đặc biệt Những 61 tử cacbon nhóm metin, 10 nhóm metylen nhóm metyl Trong đó, nối đơi lần khẳng định nhờ vào tín hiệu δ 135,40 (CH, C6)/130,77 (CH, C-7); nguyên tử cacbon bậc bốn có chứa nguyên tử oxy δ 82,16 (C, C-5) 79,46 (C, C-8); nguyên tử cabon nhóm oxymetin δ 66,44 (CH, C-3) Độ chuyển dịch hoá học lớn C-5 C-8 gợi ý xuất cầu peroxit vị trí Hình 4.3.5 Phổ C NMR giãn rộng PN3 13 62 Hình 4.3.6 Phổ Hình 4.3.7 Phổ 13 13 C NMR DEPT PN3 C NMR DEPT giãn rộng PN3 63 Từ phân tích phù hợp kiện phổ NMR hợp chất PN3 với tài liệu có giá trị cơng bố [9,21], cấu trúc hoá học hợp chất khẳng định 5,8-epidioxycholest-6-en-3-ol Hình 4.3.8 Phổ khối ESI (positive) PN3 4.4 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất PN4: Cholesterol Hợp chất PN4 phân lập dạng tinh thể màu trắng Phổ 1HNMR tín hiệu đặc trưng sterol với tín hiệu proton nhóm metyl δ 0,68 (3H, s, H-18); 1,01 (3H, s, H-19); 0,92 (3H; d; J = 7,0 Hz; H-21), 0,86 (3H; d; J = 7,0 Hz; H-26); 0,87 (3H; d; J = 7,0 Hz; H-27) Thêm vào đó, tín hiệu δ 3,52 (1H, m, H-3) 5,35 (1H; br d; J = 5,0 Hz, H-6) cho nhóm oxymetin liên kết đơi lần 64 Hình 4.4.1 Phổ 1H NMR PN4 Hình 4.4.2 Phổ 1H NMR giãn rộng PN4 65 21 25 18 17 11 26 20 27 13 19 10 14 HO Hình 4.4.3 Cấu trúc hóa học hợp chất PN4 Các phân tích PN4 sterol với liên kết đơi lần nhóm hydroxyl, gợi ý xuất cholesterol - sterol có nhiều thể động vật Những kiện với kết phổ ESI-MS (ở m/z 369,1 [M-H2O+H]+, khẳng định công thức phân tử C27H46O) điểm nóng chảy 148,50C cấu trúc hố học PN4 cholesterol Hình 4.4.4 Phổ khối ESI (positive) PN4 66 4.5 Thử hoạt tính chất phân lập từ lồi Hải miên Petrosia nigricans Tất các hợp chất phân lập thử hoạt tính gây độc với tế bào theo phương pháp trình bày phần 2.3 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào bảng 3.6 cho thấy: Hợp chất PN2 thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với hai dòng tế bào thử với giá trị IC50 3,82 μg/mL (KB - tế bào ung thư biểu mô người) 3,57 μg/mL (HepG-2 - tế bào ung thư gan người) hợp chất PN3 (5,8-Epidioxycholest6-en-3-ol) thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với dòng tế bào thử với giá trị IC50 2,0 µg/mL (KB); 3,93 µg/mL (FL) 2,4 µg/mL (HepG-2), cịn hợp chất PN1, PN4 khơng biểu hoạt tính dòng tế bào thử 67 Các hợp chất phân lập từ loài Hải miên Petrosia nigricans: HO OH OH O O 1' CH2(CH2)16CH3 O O 18' 1' 4' 1" 2" Batilol (PN1) PN2 - Petrosiol (new) 21 25 18 25 20 17 11 21 26 18 27 17 13 11 19 HO 10 O 13 19 14 10 20 14 O 5,8-Epidioxycholest-6-en-3-ol (PN3) HO Cholesterol (PN4) 27 26 68 KẾT LUẬN Đã thu thập lượng lớn loài Hải miên Petrosia nigricans tên khoa học giám định Bằng phương pháp sắc ký kết hợp, hợp chất phân lập từ dịch chiết metanol lồi Hải miên Petrosia nigricans, là:  Batilol (PN1)  Petrosiol (PN2)  5,8-Epidioxycholest-6-en-3-ol (PN3)  Cholesterol (PN4) Cấu trúc hợp chất xác định nhờ vào phương pháp phổ đại phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, 13CNMR, DEPT 1350 DEPT 900), hai chiều (HSQC, HMBC NOESY), phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI) Đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập Kết thử nghiệm cho thấy, hợp chất PN2 (Petrosiol) thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với hai dòng tế bào thử với giá trị IC50 3,82 μg/mL (KB - tế bào ung thư biểu mô người) 3,57 μg/mL (HepG-2 tế bào ung thư gan người); PN3 (5,8-Epidioxycholest-6-en-3-ol) thể hoạt tính mạnh với dòng tế bào thử với giá trị IC50 2.0 µg/mL (KB), 3.93 µg/mL (FL) 2.4 µg/mL (HepG-2); cịn hợp chất PN1, PN4 khơng biểu hoạt tính dịng tế bào thử 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mặc, Từ Vọng Nghi (2002), Cơ sở hố học phân tích, NXB Khoa học kỹ thuật GS.TSKH Từ Văn Mặc (2003), Phân tích hố lý phương pháp phổ nghiệm nghiên cứu cấu trúc phân tử; NXB Khoa học kỹ thuật Tài liệu tiếng Anh Ayako Hoshino, Hidemichi Mitome, Hiroaki Miyakoa, Akinori Shintani, Yasuji Yamada, Rob W.M van Soest (2003), “New strongylophorines from the Okinawan marine sponge Petrosia corticata”, Journal of natural products, 66, 1600-1605 Cannell R J P (1998), Natural Products Isolation; 343-353 Chambers AF, Hill RP (1998), “Tumor Progression and Metastasis in: The Basic Scinece of Oncology 3rd editon”, The MacGrawHill, chapter 10, 219-239 Harborne J B (1984), “Phytochemical methods - A guide to modern techiques of plant analysis”, 2nd edition, Chapman and Hall Kaoru Warabi, Lianne M McHardy, Lohi Matainabo, Rob van Soest, Calvin D Roskelley, Michel Roberge, Raymond J Andersen (2004), “Strongylophorine-26, a new meroditerpenoid isolated from the marine sponge Petrosia corticata that exhibits anti-ivasion activity”, Journal of natural products, 67, 1387-1389 70 Kinzo Watanabe, Yuichiro Tsuda, Maki Hamada, Go Mori, Kazuo Iguchi, Hideo Naoki, Tsuyoshi Fujita, Rob W M Van Soest (2005), “Acetylenic strongyodiols from a Petrosia Okinawan marine sponge”, Journal of natural products, 68, 1001-1005 L J Goad and T Akihisa (1997), “Analysis of sterols”; Academic Press, First edition, 363 - 366 10 Maria I., Luigi M., Raffele R., Lee J S., and Yasumoto T (1998), “Polar Steroits from the marine scallop Patinopecten yessoensis.”, Journal of Natural Products, 51(6), 1098-1103 11 Maria Shatz, Tesfamariam Yosief, Yoel Kashman (2000), “Bacteriohopanehexol, a new triterpen from the marine sponge Petrosia species”, Journal of natural products, 63, 1554-1556 12 Martha Windholz (1983), The Merck index, Merck & Co., Inc.Rahway, N.J., U.S.A 13 Mohamed A.A.Ashour (2006), Structure elucidation of bioactive marine natural products using modern methods of spectroscopy, Dusseldorf, Agypten 14 N.J.de Voogd1,2 & R.M.W van Soest1 (2002), “Indonesian sponges of genus Petrosia Vosmaer”, 1Institute for biodiversity and ecosystem dynamics University of Amsterdam, 2National museum of natural history, The Netherland 15 P Ramesh, N Srinivasa Reddy, Y Venkateswarlu (1999); “A new 1,2dihydroisoquinoline from the sponge Petrosia similis”, Journal of natural products, 62, 780-781 71 16 Rawiwan Wattanadilok, Pichan Sawangwong, Cátia Rodrigues,4,6 Honorina Cidade,4,6 Madalena Pinto,4,6 Eugenia Pinto,5,6 Artur Silva,7 and Anake Kijjoa3,8* (2007), “Antifungal Activity Evaluation of the Constituents of Haliclona baeri and Haliclona cymaeformis”, Mar Drugs, 5(2), 40–51 17 Robert M S., Francis X W., and David K (2004), Spectroscopic identification of organic compounds, 7th edition, John Wiley & Sons, Inc 18 Sam Sperry, Phillip Crew (1998); “Phenethylguanidin analogues from the Indo-Pacific marine sponge Petrosia cf Contignata”, Journal of natural products, 61, 859-861 19 Shinichi Nishimura, Shigeki Matsunaga, Mitsuyoshi Shibazaki, Kenichi Suzuki, Nobuyuki Harada, Hideo Naoki, Nobuhiro Fusentani (2002), “Corticatic acids D and E, Pokyacetylenic geranylgeranyltransferase type I inhibitor, from the marine sponge Petrosia corticata”, Journal of natural products, 65, 1353-1356 20 Suffness M and Pezzuto J.M (1991), Methods in plant biochemistry , 6, 47-69 21 Yamaguchi Y., Nakanishi Y., Shimokawa T., Hashiguchi S., and Hayashi A (1992), “Structure Elucidation of Oxygenated Sterols from Eggs of Sea Hare, Aplysia Juliana.”, Chemistry Letters, 21(9), 17111713 22 Yong C N (2005), Structural identification of organic compounds with spectroscopic techniques, Wiley-VCH Verlaf GmbH&KgaA Publisher 23 Young Ja Lim, Hyun Sook Park, Kwang Sik Im, Chong-O Lee, Jongki Hong, Min-Young Lee, Dong-Kyoo Kim, Jee H Jung (2001), “Additional 72 cytotoxic polyacetylenes from the marine sponge Petrosia Species”, Journal of natural products, 64, 46-53 24.Youngwan Seo, Ki Woong Cho, Hyi-Seung Lee, Jung-Rae Rho, Jongheon Shin (1999), “New acetylenic enol ethers of glycerol from the sponge Petrosia sp.”, Journal of natural products, 62, 122-126 25 Yuewei Guo, Margherita Gavagnin, Ciro Salierno, Guido Cimino (1998), “Further petroformynes from both Atlantic and Mediterrranean population of the sponge Petrosia ficciformis”, Journal of natural products, 61, 333-337 SUMARY OF THESIS Introduction of Petrosia nigricans The sponge Petrosia nigricans Lindgren, 1897 (Phylum: Porifera, class: Demospongia, order: Haplosclerida, suborder: Petrosina, family: Pterosiidae) is a massive sponge, irrigularly globular, with a large base that produces several fused lobes Aquiferous system with a terminal deep aquiferous cavity connected with a unique volcano-shaped osculumat the end of the lobes Surface smooth, fine, compact, covered by a fine ectosomal layer, hispid to the touch Texture hard, firm The collected specimens are brown, hard, rag-like, the outer surface is rough sometimes with long fistulae, the inner side is white to faint yellow The specimen shows small krabs introduced their heads into the osculum of the sponges It was collected in Truong Sa Island (Viet Nam) at depth of 30-40 meter Combined chromatographic methods led to the isolation of compounds PN1 - Batilol, PN2 - Petrosiol (new), PN3 - 5,8-Epidioxycholest-6-en-3-ol, PN4 Cholesterol from the methanol extract of the sponge Petrosia nigricans Their structures were deduced by modern chromatographic methods including ESIMS, NMR, DEPT, H-H COSY, HMBC All isolated compounds were tested for their cytotoxic activity The results showed that: Compound PN2 exhibited moderately cytotoxic against two tested cell line with IC50 values of 3.82 μg/mL (KB) and 3.57 μg/mL (HepG-2) and PN3 exhibited strongly cytotoxic against all three tested cell lines with the IC50 values of 2.0 μg/mL (KB), 3.93 μg/mL (FL) and 2.4 μg/mL (HepG-2) The other compounds were negative for all tested cell lines Key words: Petrosia nigricans, sponge, sterol, cytotoxic activity, petrosiol ... ta mà toàn giới Theo hướng nghiên cứu trên, đề tài nghiên cứu ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào lồi Hải miên Petrosia nigricans? ?? lựa chọn nghiên cứu Trong khuôn khổ luận văn... QUAN CHUNG VỀ HẢI MIÊN 1.1.1 Vài nét Hải miên (Petrosia) 1.1.2 Giới thiệu lồi Hải miên Petrosia nigricans 1.1.3 Mơ tả loài Hải miên Petrosia nigricans 1.1.4 Vài nét phân bố Hải miên tự nhiên... nghiệm hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập Kết thử nghiệm cho thấy, hợp chất PN2 (Petrosiol) thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với hai dòng tế bào thử với giá trị IC50 3,82 μg/mL (KB - tế bào