Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hoá học chủ yếu của lá loài Pilea aff. martinii (H.Lév) Hand-Mazz, quả loài Boehmeria holosericea Blume thuộc họ Gai (Urticaceae) và vỏ loài Anacolosa poilanei Gagnep. thuộc họ Dương đầu (Olacaceae) nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng và định hướng nghiên cứu ứng dụng 3 loài thực vật trên một cách hiệu quả.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đoàn Thị Thúy Ái NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA LOÀI PILEA AFF MARTINII (H.LÉV.) HAND.-MAZZ., BOEHMERIA HOLOSERICEA BLUME, ANACOLOSA POILANEI GAGNEP Ngành : Hóa học Mã số : 9440112 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2018 Cơng trình hồn thành ại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Huyền Trâm PGS.TSKH Phạm Văn Cường Phản biện 1: PGS.TS Đặng Ngọc Quang Phản biện 2: GS.TS Phạm Quốc Long Phản biện 3: PGS.TS Trịnh Thị Thủy Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ……… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết đề tài Ngày nay, với cơng phát triển kinh tế việc chăm sóc sức khoẻ ban đầu bảo vệ sức khoẻ cộng đồng trở nên cấp thiết quốc gia giới Do đó, nhu cầu sử dụng thuốc để phòng ngừa chữa trị bệnh nan y đặc biệt ung thư ngày cao, trong hướng để phòng ngừa chữa trị bệnh ung thư nghiên cứu tìm kiếm hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên Chính việc nghiên cứu hố học hoạt tính sinh học lồi thuốc có ý nghĩa quan trọng cho việc sử dụng cách hợp lý có hiệu nguồn tài ngun thiên nhiên Việt Nam có điều kiện khí hậu thuận lợi hình thành hệ sinh thái thực vật đa dạng phong phú với khoảng 12.000 lồi thực vật bậc cao, có gần 5000 loài sử dụng làm thuốc Trong số họ thực vật Việt Nam, họ Urticaceae (họ Gai) họ Olacaceae (họ Dương đầu) có nhiều lồi sử dụng làm thuốc, phân bố chủ yếu miền Bắc Việt Nam Rễ loài thuộc hai họ thực vật sử dụng chủ yếu để chữa bệnh cảm cúm, sởi, sốt cao, ho, hen, lở loét, mẩn ngứa, nhiệt, giải độc, đau răng, rắn cắn vv… Các nghiên cứu hóa thực vật cơng bố cho thấy thành phần hóa học thực vật họ Gai Dương đầu gồm hợp chất thiên nhiên thứ cấp triterpenoid, alkaloid, lignan… Chúng có hoạt tính gây độc tế bào cao nhiều hoạt tính sinh học lý thú khác Trong khuôn khổ Dự án hợp tác Quốc tế Việt–Pháp “Nghiên cứu hóa thực vật thảm thực vật Việt Nam”, việc khảo sát hoạt tính sơ số loài thực vật thuộc hai họ Gai Dương đầu Việt Nam thực Kết cho thấy dịch chiết loài Pilea aff martinii (H.Lév.) Hand.Mazz., Boehmeria holosericea Blume Anacolosa poilanei Gagnep thể khả ức chế tế bào ung thư KB mạnh Trong lồi Pilea aff martinii (H.Lév.) Hand.-Mazz (Urticaceae) ức chế 100% phát triển tế bào ung thư KB nồng độ 1µg/mL; nồng độ này, loài Boehmeria holosericea Blume (Urticaceae) ức chế 25% vỏ loài Anacolosa poilanei Gagnep (Olacaceae) ức chế 55% Tuy nhiên, theo tra cứu tài liệu, có nghiên cứu hóa học loài thuộc hai chi Pilea Anacolosa Đặc biệt chưa có cơng trình nghiên cứu hóa thực vật hai lồi P martinii A poilanei cơng bố giới Việt Nam Xuất phát từ lý trên, lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào loài Pilea aff martinii (H.Lév.) Hand.-Mazz., Boehmeria holosericea Blume, Anacolosa poilanei Gagnep.” Mục tiêu nội dung nghiên cứu luận án Mục tiêu luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hoá học chủ yếu loài Pilea aff martinii (H.Lév) Hand-Mazz, loài Boehmeria holosericea Blume thuộc họ Gai (Urticaceae) vỏ loài Anacolosa poilanei Gagnep thuộc họ Dương đầu (Olacaceae) nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, làm sở khoa học cho việc sử dụng định hướng nghiên cứu ứng dụng loài thực vật cách hiệu Nội dung nghiên cứu: Phân lập hợp chất từ loài Pilea aff martinii (H.Lév) Hand-Mazz, loài Boehmeria holosericea Blume thuộc họ Gai (Urticaceae) vỏ loài Anacolosa poilanei Gagnep thuộc họ Dương đầu (Olacaceae) phương pháp sắc ký; Xác định cấu trúc hoá học hợp chất phân lập phương pháp vật lý đại; Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập số dòng tế bào ung thư người Những đóng góp luận án Lần nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Pilea aff martinii (H.Lév.) Hand.-Mazz thuộc họ Gai (Urticaceae) Bằng việc kết hợp phương pháp sắc ký phân lập hợp chất từ thân lồi này, có alkaloid khung PM1, PM2 alkaloid PM5, PM6, PM8 Ba hợp chất alkaloid PM4-PM7 có hoạt tính ức chế mạnh với dòng tế bào ung thư thử nghiệm (KB, Hep-G2, LU-1 MCF-7) với giá trị IC50 từ 0,025 - 0,796 µM Đã xác định cấu hình tuyệt đối hợp chất nhờ so sánh kết thực nghiệm với tính tốn phổ lưỡng sắc tròn (CD) theo mơ hình tính tốn lượng tử dựa phần mềm Gaussian 09 2 Lần nghiên cứu thành phần hóa học Boehmeria holosericea Blume (Gai toàn tơ) thuộc họ Gai (Urticaceae) phân lập hợp chất từ loài Lần nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Anacolosa poilanei Gagnep thuộc họ Dương đầu (Olacaceae) phân lập hợp chất từ vỏ loài này, có hợp chất triterpene khung D:A-friedo-oleanan-27-oic AP1, AP4 AP5 Hợp chất AP1 thể hoạt tính ức chế tất dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 từ 10,00-14,85 µM Bố cục luận án: Luận án gồm 132 trang với 26 bảng số liệu, 105 hình sơ đồ, 81 tài liệu tham khảo cập nhật đến năm 2017 Bố cục luận án gồm: Mở đầu (2 trang), Chương Tổng quan tài liệu (31 trang) Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu (7 trang), Chương Thực nghiệm (15 trang), Chương Kết nghiên cứu thảo luận (67 trang), Kết luận kiến nghị (2 trang), Danh mục cơng trình công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (8 trang) NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần đề cập đến ý nghĩa khoa học, mục tiêu nội dung nghiên cứu luận án CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần Tổng quan tài liệu tập hợp tất nghiên cứu nước quốc tế vấn đề: Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi thực vật chi Pilea, chi Boehmeria thuộc họ Urticaceae chi Anacolosa thuộc họ Olacaceae CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Ba loài thực vật: Lá loài Pilea aff martinii (H.Lév) Hand.-Mazz., loài Boehmeria holosericea Blume (Họ Urticaceae) vỏ loài Anacolosa poilanei Gagnep (Họ Olacaceae) 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu hái mẫu định tên khoa học: Mẫu thực vật thu hái, định tên TS Nguyễn Quốc Bình, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, mẫu tiêu lưu bảo quản Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.2.2 Phương pháp phân lập: Phần trình bày phương pháp phân lập hợp chất tinh khiết 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc Các phương pháp vật lý đại sử dụng để xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ đối tượng nghiên cứu, bao gồm phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (ESI-HRMR, ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1D NMR, 2D NMR) phổ lưỡng sắc tròn (CD) kết hợp với đo điểm chảy độ quay cực 2.2.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học Phần trình bày phương pháp MTT thử hoạt tính gây độc tế bào CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 3.1 Phân lập chất từ hai loài Pilea aff martinii Boehmeria holosericea, họ Urticaceae 3.1.1 Xử lý mẫu thực vật phân lập chất từ loài Pilea aff martinii Phần trình bày cụ thể bước ngâm chiết phân lập chất từ lồi Pilea aff martinii (Hình 3.1, Hình 3.2) Bột Pilea aff martinii (40kg) 1.MeOH, NH4OH 1% ( 60L x4lần) 2.Cất loại dung môi Cặn MeOH (5kg) 1.Thêm nước (10L), thêm HCl 2N đến pH ~2 2.Chiết EtOAc, 20Lx5 lần Dịch EtOAc Dịch nƣớc Thêm NH4OH đến pH ~8- Chiết EtOAc, (20Lx5 lần) Cất loại dung mơi Cặn PM (35,1g) Hình 3.1 Sơ đồ thu nhận cặn chiết alkaloid tổng từ Pilea aff martinii PM 35,1 gam A: acetone; D: CH2Cl2 E: EtOAc; M: MeOH H: n-hexane; grad.: gradient CC, H/E (grad) F1 F2 354 mg F3 CC, H/E (grad) F4 320 mg F10 gam F5-F9 F11 gam CC, H/E (grad) CC, H/E (grad) CC, H/E (grad) F13 10 gam F14F15 CC, H/E (grad) F11.1 20 mg F2.2 20 mg PTLC H/E (8/2) F4.2 mg PTLC H/E (8/2) F4.3 mg F10.1 70 mg F4.4 12 mg PTLC H/E (8/2) PTLC H/E (7/3) CC, H/A (grad) F10.1.2 30 mg PTLC H/A (7/3) PM1 mg PM2 mg PM3 mg PM4 mg PM5 20 mg PM7 mg F10.7 100 mg CC, H/A (grad) PTLC H/A (6/4) PM9 mg mg F10.7.3 18 mg PTLC H/A (7/3) PM6 mg Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất từ loài Pilea aff martinii F13.1 26 mg PTLC H/A (6/4) PM8 mg 3.1.2 Hằng số vật lý số liệu phổ hợp chất đƣợc phân lập từ loài Pilea aff martinii Hợp chất PM1: Pileamartine A (chất mới) Chất rắn màu trắng, đnc 184-186oC, độ quay cực -141,2o (c 0,33; CHCl3) FT-IR νmax (cm-1): 2945, 2833, 1649, 1506, 1454, 1418, 1018 ESIHRMS: m/z 380,2247 [M+H]+ (tính tốn theo lí thuyết cho cơng thức [C24H30NO3]+, 380,2226) CD (ACN): λmax (Δε) 221 (+0,99), 234 (-11,58), 244 (+5,13), 286 (-10,21) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz), 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): Xem bảng 4.1 Hợp chất PM2: Pileamartine B (chất mới) Chất rắn màu trắng, độ quay cực -124,8o (c 0,077; CHCl3) ESIHRMS: m/z 366,2089 [M+H]+ (tính tốn lí thuyết cho công thức [C23H28NO3]+, 366,2069) CD (ACN): λmax (Δε) 232 (-6,93), 250 (+0,38), 285 (-0,81) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 2,17 (1H, ddd, J = 3,0; 11,5; 11,5 Hz, H-2α); 2,75 (1H, br.d, J = 11,5 Hz, H-2β); 1,58-1,63 (2H, m, H-3); 1,17-1,21 (1H, m, H-4α); 1,75-1,79 (1H, m, H-4β); 1,22-1,29 (1H, m, H-5α); 1,78-1,81 (1H, m, H-5β); 2,36-2,41 (1H, m, H-6); 1,75-1,82 (2H, m, H-7); 3,24 (1H, br.d, J = 9,0 Hz, H-8); 2,91 (1H, d, J = 17,0 Hz, H-10α); 3,45 (1H, d, J = 17,4 Hz, H-10β); 6,60 (1H, s, H-13); 6,79 (1H, s, H-16); 7,37 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’, 6’); 6,81 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’, 5’); 3,83 (3H, s, 4’-OCH3); 3,77 (3H, s, 4”-OCH3) 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ (ppm) 46,5 (C-2); 25,9 (C-3); 24,4 (C-4); 32,4 (C-5); 59,6 (C-6); 40,2 (C-7); 59,0 (C-8); 77,0 (C-9); 37,5 (C-10); 135,6 (C-1’); 136,9 (C-2’); 106,9 (H-3’); 146,2 (C-4’); 144,9 (C-5’); 109,5 (C-6’); 141,1 (C-1”); 126,5 (C-2”; 6”); 113,4 (C-3”; 5”); 157,9 (C-4”); 56,1 (4-4”-OCH3); 55,3 (4”-OCH3) Hợp chất PM3: 1,3,6,6-Tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydroiso quinolin-8-one Chất rắn màu vàng, đnc 33-36oC FT-IR νmax (cm-1): 3393, 2957, 2870, 1680, 1587, 1555, 1431, 1369, 1248, 1028 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 6,87 (1H, s, H-4); 2,76 (2H, s, H-5); 2,49 (2H, s, H-7); 2,51 (3H, s, CH3-9); 2,82 (3H, s, CH3-10); 1,05 (6H, s, CH3-11, CH3-12) 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ (ppm) 160,9 (C-1); 160,4 (C-3); 121,7 (C-4); 152,6 (C4a); 54,3 (C-5); 32,9 (C-6); 44,0 (C-7); 198,8 (C-8); 123,5 (C-8a); 24,6 (C9); 26,0 (C-10); 28,0 (C-11, 12) Hợp chất PM4: Julandine Chất rắn màu vàng, đnc 132-134oC, độ quay cực +6o (c 1,5; CHCl3) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 1,35-1,40 (1H, m, H-1α); 1,84-1,89 (1H, m, H-1β); 1,35-1,40 (1H, m, H-2α); 1,80-1,83 (1H, m, H-2β); 1,69-1,74 (2H, m, H-3); 2,10-2,15 (1H, m, H-4); 3,09 (1H, d, J = 8,5 Hz, H4β); 3,05 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-6); 3,62 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-6β); 2,39 (1H, d, J = 17,0 Hz, H-9); 2,53 (1H, d, J = 17,0 Hz, H-9β); 2,33-2,43 (1H, m, H-9a); 6,46 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2’); 6,67 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’); 6,64 (1H, dd, J = 1,5; 8,5 Hz, H-6’); 6,97 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2”, 6”); 6,69 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3”, 5”); 3,72 (3H, s, 3’-OCH3); 3,53 (3H, s, 4’-OCH3); 3,80 (3H, s, 4”-OCH3) 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ (ppm) 33,2 (C-1); 24,3 (C- 2); 25,8 (C-3); 55,5 (C-4); 60,2 (C-6); 131,3 (C-7); 131,3 (C-8); 39,4 (C9); 57,9 (C-9a); 133,2 (C-1’); 113,4 (C- 2’); 147,9 (C-3’); 147,3 (C-4’); 110,5 (C-5’); 120,6 (C-6’); 134,5 (C-1’’); 130,2 (C-2”; 6”); 113,4 (C-3”, 5”); 158,1 (C-4’’); 55,7 (3’-OCH3); 55,5 (4’-OCH3); 55,2 (4”-OCH3) Hợp chất PM5: Pileamartine C (chất mới) Chất rắn màu vàng, đnc 117-120oC, độ quay cực -31o (c 0,34; acetone) FT-IR νmax (cm-1): 3331, 2943, 2832, 1663, 1450, 1416, 1018, 602, 419 ESI-HRMS: m/z 378,2053 [M+H]+ (tính tốn lí thuyết cho công thức [C24H28NO3]+, 378,2069) CD (ACN): λmax (Δε) 232 (+24), 270 (-12) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 7,69 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-1); 7,30 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-2); 9,29 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5); 7,22 (1H, dd, J = 2,5; 9,0 Hz, H-7); 7,73 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-8); 3,55 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-9α); 4,35 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-9β); 2,24 (1H, ddd, J = 4,0; 11,0; 11,0 Hz, H-11α); 3,23 (1H, br.d, J = 11,0 Hz, H-11β); 1,71-1,80 (2H, m, H-12); 1,37-1,43 (1H, m, H-13α); 1,82-1,90 (1H, m, H-13β); 1,48-1,50 (1H, m, H-14α); 1,95-2,0 (1H, m, H-14β); 2,30 (1H, dddd, J = 3,0; 3,0; 10,0; 10,0; H-14a); 2,86 (1H, dd, J = 10,0; 16,5 Hz, H-15α); 3,06 (1H, dd, J = 3,0;16,5 Hz, H-15β); 3,92 (3H, s, 3-OCH3); 4,01 (3H, s, 4-OCH3); 3,98 (3H, s, 6-OCH3) 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ (ppm) 119,4 (C-1); 112,8 (C- 2); 150,7 (C-3); 147,1 (C- 4); 123,6 (C-4a); 129,9 (C-4b); 109,6 (C-5); 157,3 (C- 6); 116,4 (C-7); 123,0 (C- 8); 125,1 (C-8a); 125,5 (C-8b); 56,1 (C-9); 56,1 (C-11); 25,8 (C12); 24,2 (C-13); 33,6 (C-14); 57,5 (C-14a); 34,8 (C-15); 124,9 (C-15a); 127,6 (C-15b); 59,9 (3-OCH3); 56,4 (4-OCH3); 55,2 (6-OCH3) Hợp chất PM6: Pileamartine D (chất mới) Chất rắn màu vàng, đnc 194-196oC; độ quay cực -18o (c 0,05; CH3OH); FT-IR νmax (cm-1): 2926, 2853, 1969, 1611, 1512, 1468, 1420, 1261, 1202, 1171, 1040; ESI-HRMS: m/z 364,1928 [M+H]+ (tính tốn lí thuyết cho cơng thức [C23H26NO3]+, 364,1913); CD (ACN): λmax (Δε) 231 (+11), 270 (-2); 1H NMR (CDCl3 + CD3OD, 500 MHz): δ (ppm) 7,18 (1H, s, H-1); 7,97 (1H, s, H-4); 7,86 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5); 7,16 (1H, dd, J = 2,5; 9,0 Hz, H-7); 7,72 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-8); 3,59 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-9α); 4,38 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-9β); 2,32 (1H, ddd, J = 2,5; 12,0; 12,0 Hz, H11α); 3,25 (1H, br.d, J = 12,0 Hz, H-11β); 1,70-1,73 (1H, m, H-12α); 1,801,84 (1H, m, H-12β); 1,41-1,49 (1H, m, H-13α); 1,86-1,90 (1H, m, H-13β); 1,45-1,51 (1H, m, H-14α); 1,98-2,02 (1H, m, H-14β); 2,30-2,36 (1H, m, H14a); 2,83 (1H, dd, J = 10,5; 16,5 Hz, H-15α); 3,03 (1H, dd, J = 3,5;16,5 Hz, H-15β); 4,02 (3H, s,2-OCH3); 3,98 (3H, s, 6-OCH3) 13CNMR (CDCl3+ CD3OD, 125 MHz): δ (ppm) 104,2 (CH-1); 149,1 (C-2); 146,3 (C-3); 107,5 (CH-4); 123,9 (C-4a); 130,8 (C-4b); 104,9 (CH-5); 158,2 (C-6); 116,1 (CH7); 124,4 (CH-8); 124,7 (C-8a); 124,9 (C-8b); 56,4 (CH2-9); 56,6 (CH2-11); 26,0 (CH2-12); 24,6 (CH2-13); 33,8 (CH2-14); 58,3 (CH-14a); 34,7 (CH2-15); 124,9 (C-15a); 126,3 (C-15b); 56,1 (2-OCH3); 55,7 (6-OCH3) Hợp chất PM7: Cryptopleurine Chất rắn màu vàng, đnc 196-198oC, độ quay cực +96o (c 0,38; CHCl3) FT-IR νmax (cm-1): 1649, 1554, 1539, 1519, 1508; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 7,16 (1H, s, H-1); 7,84 (1H, s, H-4); 7,81 (1H, H-5); 7,12 (1H, dd, J = 2,5; 9,0 Hz, H-7); 7,69 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-8); 3,57 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-9α); 4,33 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-9β); 1,74-1,8 (1H, m, H-12α); 1,821,88 (1H, m, H-12β); 1,47-1,51 (1H, m, H-13α); 1,90-1,94 (1H, m, H-13β); 1,51-1,59 (1H, m, H-14α ); 2,06-2,09 (1H, m, H-14β); 2,45 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-14a); 2,80 (1H, dd, J = 10,5; 16,0 Hz, H-15); 3,01 (1H, d, J = 3,5 Hz, 16,0 Hz, H-15β); 3,96 (3H, s, 2-OCH3); 4,01 (3H, s, 3-OCH3); 3,94 (3H, s, 6-OCH3) 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ (ppm) 103,6 (C-1); 148,1 (C-2); 149,1 (C-3); 103,7 (C-4); 125,9 (C-4a); 129,8 (C-4b); 104,3 (C-5); 157,2 (C- 6); 114,7 ( C-7); 123,6 (C-8); 123,1 (C-8a); 124,6 (C-8b); 55,7 (C-9); 55,4 (C-11); 25,1 (C-12); 23,7 (C-13); 32,9 (C-14); 57,4 (C-14a); 33,9 (C-15); 123,9 (C-15a); 123,2 (C-15b); 55,4 (2-OCH3); 55,6 (3-OCH3); 55,1 (6-OCH3) Hợp chất PM8: Pileamartine E (chất mới) Chất dầu màu vàng; độ quay cực +145o (c 0,3; CH3OH); FT-IR νmax (cm-1): 3375, 2937, 2860, 1732, 1663, 1514, 1452, 1387, 1269, 1165, 1126, 1032; ESI-HRMS: m/z 234,1493 [M+H]+ (tính tốn lí thuyết cho cơng thức [C14H20NO2]+, 234,1494); CD (ACN): λmax (Δε) 260 (+0,6), 285 (-0,7), 310 (+1,6); 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ (ppm) 2,75 (1H, ddd, J=1,5; 12,0; 12,0 Hz, H-2α); 3,12 (1H, br.d, J = 12,0 Hz, H-2β); 1,46-1,53 (1H, m, H-3α); 1,66-1,70 (1H, m, H-3β); 1,48-1,53 (1H, m, H-4α); 1,84-1,90 (1H, m, H-4β); 1,40-1,49 (1H, m, H-5α); 1,80-1,89 (1H, m, H-5β); 3,29 (1H, br.dd, J = 7,2; 8,0 Hz, H-6); 6,02 (1H, dd, J = 7,2; 15,5 Hz, H-7); 6,48 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-8); 6,97 (1H, br.s, H-2’); 6,75 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’); 6,83 (1H, br.d, J = 8,0 Hz, H-6’); 3,87 (3H, s, CH3O-C-3’) 13C NMR (CD3OD, 125 MHz): δ (ppm) 46,9 (C-2); 25,7 (C-3); 24,9 (C-4); 32,9 (C-5); 59,9 (C6); 129,1 (C-7); 131,9 (C-8); 130,1 (C-1’); 110,3 (C-2’); 148,9 (C-3’); 147,6 (C-4’); 116,2 (C-5’); 120,9 (C-6’); 56,3 (3’-OCH3) 6’) 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 139,0 (C-1); 129,3 (C-2; 6); 129,2 (C-3; 5); 128,7 (C-4); 71,8 (C-7); 103,3 (C-1’); 71,7-78,1 (C-2’, C-3’, C-4’, C5’); 62,8 (C-6’) Hợp chất BH3: Adenine Chất rắn màu trắng; ESI-MS: m/z 136 [M+H]+; 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 8,13 (1H, s, H-2); 8,20 (1H, s, H-8) Hợp chất BH4: Adenosine Chất rắn màu trắng, đnc 230-233oC, ESI-MS: m/z 268 [M+H]+ 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 8,20 (1H, s, H-2); 8,32 (1H, s, H-8); 5,99 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-1’); 4,76 (1H, dd, J = 5,0; 6,5 Hz, H-2’); 4,35 (1H, dd, J = 3,0; 5,0 Hz, H-3’); 4,17-4,21 (1H, m, H-4’); 3,90 (1H, dd, J = 2,5; 12,5 Hz, H-5’a); 3,77 (1H, dd, J = 2,5; 12,5 Hz, H-5’b) 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 150,0 (C-4); 153,5 (C-2); 163,6 (C-5); 157,6 (C-6); 143,0 (C-8); 91,3 (C-1’); 72,7 (C3’); 75,5 (C-2’); 88,2 (C-4’); 63,5 (C-5’) Hợp chất BH5: Uridine Chất rắn màu trắng, đnc 163-165oC ESI-MS: m/z 245 [M+H]+ 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 5,71 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5); 8,02 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6); 5,92 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-1’); 4,20 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-2’); 4,17 (1H, t, J = 5,0 Hz, H-3’); 4,00-4,03 (1H, m, H-4’); 3,86 (1H, dd, J = 3,0; 12,5 Hz, H-5’α); 3,75 (1H, dd, J = 3,0; 12,5 Hz, H-5’) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 152,5 (C-2); 166,2 (C- 4); 102,7 (C-5); 142,7 (C6); 90,8 (C-1’); 75,7 (C-2’); 75,3 (C-3’); 86,4 (C-4’); 62,5 (C-5’) 3.2 Phân lập chất từ loài Anacolosa poilanei, họ Olacaeae 3.2.1 Xử lý mẫu thực vật phân lập chất Phần trình bày cụ thể bước ngâm chiết mẫu thực vật phân lập chất từ vỏ lồi Anacolosa poilanei (Hình 3.5 Hình 3.6) Bột vỏ A poilanei (1,18 kg) Ngâm chiết với EtOAc (2,5 Lx3 lần) Dịch chiết EtOAc Bã Cất loại dung mơi Cặn AP (55,37 gam) Hình 3.5 Sơ đồ ngâm chiết vỏ Anacolosa poilanei 11 D: CH2Cl2, E: EtOAc H: n-hexane, M: MeOH Grad: gradient, KT: kết tinh Se: Sephadex AP 55,3 gam CC, H/E (grad) F6 F1-F4 F8 F7 1,3 g 1,2 g CC, H/D (grad) AP2 15 mg F9 F10 2,02g 5g Rửa CH2Cl2 KT, EtOAc 640 mg CC, D/M, grad F10.2 F10.5 150 mg 350 mg CC, Se, MeOH F8.2.1 F8.2.2 25 mg 40 mg KT, EtOAc AP3 16 mg CC, H/E (grad) AP6 F10.2.2 15 mg 28 mg CC, D/M (grad) AP1 16,1 mg AP5 14,5 mg F13 4g CC H/E/M (grad) CC,Se, M/D ( 9/1) F8.2 F12 F11 CC, D/M (grad) CC, Se, MeOH F10.5.2 60 mg CC, D/E, grad AP4 15 mg AP7 15 mg Hình 3.6 Sơ đồ phân lập chất từ loài A poilanei 3.2.2 Hằng số vật lý số liệu phổ hợp chất đƣợc phân lập từ vỏ Anacolosa poilanei Hợp chất AP1: Acid 3α-p-coumaroyl-D:A-friedo-oleanan-27-oic (chất mới) Chất bột màu trắng, đnc 189-191oC; độ quay cực +21o (c 0,21; CH3Cl); FT-IR νmax (cm-1): 3325, 1695, 1649, 1557, 1508, 1454, 1020; ESIHRMS: m/z 605,4165 [M+H]+ (tính tốn theo lí thuyết cho cơng thức [C39H57O5]+, 605,4206); 1H NMR (CDCl3, 500MHz): δ (ppm) 1,36-1,43 (1H, m, H-1α); 1,53-1,60 (H, m, H-1β); 1,24-1,32 (1H, m, H-2α); 2,08-2,12 (H, m, H-2β); 4,72 (1H, dt, J = 5,0; 11,0 Hz, H-3); 1,24-1,32 (1H, m, H-4); 1,07-1,12 (1H, m, H-6α); 1,73-1,78 (1H, m, H-6β); 1,35-1,43 (1H, m, H-7α); 1,53-1,60 (1H, m, H-7β); 1,69-1,73 (1H, m, H-8); 0,88-0,93 (1H, m, H-10); 1,02-1,07 (1H, m, H-11α); 1,55-1,61 (1H, m, H-11β); 1,45-1,52 (1H, m, H-12α); 2,032,08 (1H, m, H-12β); 1,24-1,32 (1H, m, H-15α); 1,41-1,47 (1H, m, H-15β); 1,23-1,31 (1H, m, H-16α); 1,70-1,80 (1H, m, H-16β); 1,79-1,83 (1H, m, H-18); 1,23-1,30 (1H, m, H-19α); 1,70-1,80 (1H, m, H-19β); 1,23-1,32 (1H, m, H21α); 1,41-1,44 (1H, m, H-21β); 0,85-0,90 (1H, m, H-22α); 1,42-1,48 (1H, m, H-22β); 0,75 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-23); 0,83 (3H, s, H-24); 0,87 (3H, s, H-25); 1,13 (3H, s, H-26); 1,22 (3H, s, H-28); 1,00 (3H, s, H-29); 0,95 (3H, s, H-30); 12 6,22 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-2’); 7,55 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-3’); 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-5’, H-9’); 6,80 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-6’, H-8’) 13C NMR (CDCl3, 125MHz): δ (ppm) 18,1 (C-1); 32,7 (C-2); 75,0 (C-3); 50,0 (C-4); 38,4 (C-5); 41,0 (C-6); 19,4 (C-7); 52,9 (C-8); 37,2 (C-9); 59,7 (C-10); 37,8 (C-11); 27,8 (C-12); 54,8 (C-13); 39,2 (C-14); 32,9 (C-15); 35,7 (C-16); 30,7 (C-17); 43,2 (C-18); 36,0 (C-19); 28,4 (C-20); 32,4 (C-21); 38,3 (C-22); 10,0 (C-23); 14,5 (C-24); 18,6 (C-25); 22,6 (C-26); 180,0 (C-27); 31,1 (C-28); 30,5 (C-29); 35,4 (C-30), 167,4 (C-1’); 144,0 (C-2’); 115,9 (C-3’); 127,2 (C-4’); 129,9 (C-5’; C9’); 116,1 (C-6’; C-8’); 157,7 (C-7’) Hợp chất AP2: Acid trichadenic A Chất bột màu trắng, đnc 302-304oC; độ quay cực + 30o (c 0,14; CHCl3); FT-IR νmax (cm-1): 3670, 2949, 1715, 1557, 1506, 1454, 1020; ESI-MS : m/z 457 [M-H]-; 1H NMR (CDCl3+CD3OD, 500 MHz): δ (ppm) 3,26 (1H, dt, J = 5,0 Hz; 11,0Hz, H-3); 0,83 (3H, d, J = 9,0 Hz, CH3-23 ); 0,72 (3H, s, CH324); 0,81 (3H, s, CH3-25); 0,90 (3H, s, CH3-26); 1,12 (3H, s, CH3-28); 1,10 (3H, s, CH3-29); 0,94 (3H, s, CH3-30) 13C NMR (CDCl3+CD3OD, 125 MHz): δ (ppm) 19,5 (C-1); 35,6 (C-2); 72,0 (C-3); 52,8 (C-4); 37,1 (C-5); 41,1 (C-6); 18,0 (C-7); 52,8 (C-8); 37,7 (C-9); 59,9 (C-10); 37,8 (C-11); 27,8 (C-12); 54,5 (C-13); 39,1 (C-14); 32,9 (C-15); 35,8 (C-16); 30,5 (C-17); 43,1 (C-18); 36,3 (C-19); 28,3 (C-20); 32,5 (C-21); 38,0 (C-22); 9,7 (C-23); 14,0 (C-24); 18,0 (C25); 19,5 (C-26); 179,7 (C-27); 31,0 (C-28); 30,6 (C-29); 35,1 (C-30) Hợp chất AP3: Acid trichadonic Chất bột màu trắng, đnc 249-252oC, độ quay cực +5,3o (c 1,5; CHCl3) FT-IR νmax (cm-1): 3746, 3671, 3645, 2949, 1715, 1649, 1555, 1506, 1456, 1394, 416 ESI-MS: m/z 455 [M-H]- 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 0,87 d (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-23 ); 0,72 (3H, s, CH3-24); 0,91 (3H, s, CH3-25); 1,14 (3H, s, CH3-26); 1,22 (3H, s, CH3-28); 1,00 (3H, s, CH3-29); 0,96 (3H, s, CH3-30) 13C NMR (CDCl3+CD3OD, 125 MHz): δ (ppm) 22,7 (C1); 41,3 (C-2); 213,0 (C-3); 58,1 (C-4); 42,1 (C-5); 41,3 (C-6); 18,5 (C-7); 53,0 (C-8); 37,6 (C-9); 59,4 (C-10); 37,8 (C-11); 27,8 (C-12); 54,8 (C-13); 39,2 (C14); 33,0 (C-15); 41,0 (C-16); 30,7 (C-17); 43,3 (C-18); 35,7 (C-19); 28,4 (C20); 32,4 (C-21); 36,0 (C-22); 16,8 (C-23); 14,7 (C-24); 18,4 (C-25); 22,7 (C26); 181,0 (C-27); 31,0 (C-28); 30,5 (C-29); 35,4 (C-30) Hợp chất AP4: Acid 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedooleanan-27-oic (chất mới) Chất bột màu vàng nhạt, đnc 245-247oC; độ quay cực +20,5o (c 0,3; CH3OH); FT-IR νmax (cm-1): 3360, 2974, 2943, 1683, 1649, 1555, 1508, 1454, 1024; ESI-HRMS: m/z 619,4042 [M-H]- (tính tốn theo lí thuyết cho công thức [C39H55O6]-, 619,3999); 1H NMR (CDCl3, 500MHz): δ (ppm) 1,361,43 (2H, m, H-1); 1,24-1,32 (1H, m, H- 2α); 1,96-2,11 (1H, m, H-2β); 4,70 (1H, dt, J = 5,0; 11,0 Hz, H-3); 1,30-1,35 (1H, m, H-4); 1,06-1,12 (1H, m, H13 6α); 1,72-1,80 (1H, m, H-6β); 1,35-1,43 (1H, m, H-7α); 1,55-1,61 (1H, m, H7β); 1,72-1,80 (1H, m, H-8); 0,90-0,96 (1H, m, H-10); 1,03-1,09 (1H, m, H11α); 1,53-1,59 (1H, m, H-11β); 1,43-1,50 (1H, m, H-12α); 2,03-2,08 (1H, m, H-12β); 1,50-1,54 (1H, m, H-15α); 1,95-2,01 (1H, m, H-15β); 1,22-1,30 (1H, m, H-16α); 1,72-1,81 (1H, m, H-16β); 1,77-1,82 (1H, m, H-18); 1,22-1,25 (1H, m, H-19α); 1,73-1,81 (1H, H-19β); 1,25-1,32 (1H, m, H-21α); 1,44-1,49 (1H, m, H-21β); 0,83-0,89 (1H, m, H-22α); 1,43-1,49 (1H, m, H-22β); 0,75 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-23); 0,85 (3H, s, H-24); 0,88 (3H, s, H-25); 1,13 (3H, s, H-26); 1,22 (3H, s, H-28); 1,00 (3H, s, H-29); 0,95 (3H, s, H-30); 6,20 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-2’); 7,50 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-3’); 7,05 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5’); 6,82 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8’); 6,94 (1H, dd, J = 8,0; 2,0 Hz, H-9’) 13C-NMR (CDCl3, 125MHz): δ (ppm) 18,0 (C-1); 32,4 (C-2); 75,1 (C-3); 50,0 (C-4); 38,3 (C-5); 41,0 (C-6); 19,2 (C-7); 52,7 (C-8); 37,0 (C-9); 59,7 (C-10); 37,7 (C-11); 27,7 (C-12); 54,4 (C-13); 39,0 (C-14); 32,9 (C-15); 35,5 (C-16); 30,5 (C-17); 43,0 (C-18); 35,8 (C-19); 28,2 (C-20); 32,5 (C-21); 38,0 (C-22); 9,7 (C-23); 14,3 (C24); 18,4 (C-25); 22,5 (C-26); 179,5 (C-27); 30,9 (C-28); 30,4 (C-29); 35,1 (C30); 167,8 (C-1’); 115,2 (C-2’); 144,7 (C-3’); 126,8 (C-4’); 113,8 (C-5’); 144,8 (C-6’); 147,1 (C-7’); 115,8 (C-8’); 121,7 (C-9’) Hợp chất AP5: 3α-(3,4-Dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan27,15-α-lactone (chất mới) Chất bột màu vàng, đnc 291-293oC; độ quay cực +33o (c 0,12; CH3OH); FT-IR νmax (cm-1): 3321, 2974, 2832, 1649, 1539, 1506, 1452, 1022; ESI-HRMS: m/z 619,4004 [M+H]+ (tính tốn theo lí thuyết cho cơng thức [C39H55O6]+, 619,3999); 1H NMR (CDCl3+ CD3OD, 500MHz): δ (ppm) 1,281,36 (2H, m, H-1); 1,10-1,27 (1H, m, H-2α); 2,02-2,07 (1H, m, H-2β); 4,64 (1H, dt, J = 5,0; 11,0 Hz, H-3); 1,25-1,31 (1H, m, H-4); 1,73-1,78 (2H, m, H6); 1,44-1,46 (1H, m, H-7α); 1,54-1,59 (1H, m, H-7β); 1,07-1,12 (1H, m, H-8), 0,83-0,88 (1H, m, H-10); 0,96-1,03 (1H, m, H-11α); 1,55-1,60 (1H, m, H-11β); 1,16-1,23 (1H, m, H-12α); 1,92-1,98 (1H, m, H-12β); 4,31 (1H, br s, H-15); 1,73-1,78 (2H, m, H-16); 1,84-1,89 (1H, m, H-18); 1,38-1,45 (1H, m, H-19α); 1,54-1,60 (1H, m, H-19β); 1,12-1,16 (2H, m, H-21); 1,01-1,06 (1H, m, H-22α); 1,69-1,75 (1H, m, H-22β); 0,71 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-23); 0,79 (3H, s, H-24); 0,78 (3H, s, H-25); 0,95 (3H, s, H-26); 1,09 (3H, s, H-28); 0,87 (3H, s, H-29); 0,87 (3H, s, H-30); 6,13 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-2’); 7,43 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-3’); 6,98 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5’); 6,73 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-8’); 6,85 (1H, dd, J = 1,5; 8,5 Hz, H-9’) 13C-NMR (CDCl3+CD3OD, 125MHz): δ (ppm) 19,0 (C-1); 32,3 (C-2); 74,6 (C-3); 49,6 (C-4); 38,0 (C-5); 39,9 (C-6); 19,2 (C-7); 47,9 (C-8); 35,8 (C-9); 58,6 (C-10); 35,5 (C-11); 22,1 (C-12); 50,9 (C-13); 35,8 (C-14); 80,9 (C-15); 35,4 (C-16); 30,2 (C-17); 44,0 (C-18); 33,9 (C-19); 27,8 (C-20); 33,9 (C-21); 39,8 (C-22); 9,5 (C-23); 13,9 (C-24); 16,1 (C-25); 13,1 (C-26); 180,9 (C-27); 29,2 (C-28); 30,5 (C-29); 33,9 (C-30), 167,7 (C-1’); 114,7 14 (C-2’); 144,9 (C-3’); 126,5 (C-4’); 113,8 (C-5’); 144,7 (C-6’); 147,3 (C-7’); 115,0 (C-8’); 121,6 (C-9’) Hợp chất AP6: β-Sitosterol Chất bột màu trắng, đnc 140-142oC; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 3,48-3,52 (1H, m, H-3); 5,35 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-6); 0,68 (3H, s, CH318); 1,01 (3H, s, CH3-19); 0,92 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-21); 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-26); 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-27); 0,85 (3H, t, J = 7,0 Hz, CH329) 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ (ppm) 37,3 (C-1); 31,7 (C-2); 71,8 (C-3); 42,3 (C-4); 140,8 (C-5); 121,7 (C-6); 31,9 (C-7); 31,9 (C-8); 50,2 (C-9); 36,5 (C-10); 21,1 (C-11); 39,8 (C-12), 42,4 (C-13); 56,8 (C-14); 24,3 (C-15); 28,3 (C-16); 56,1 (C-17); 12,0 (C-18); 19,8 (C-19); 36,2 (C-20); 18,8 (C-21); 34,0 (C-22); 26,1 (C-23); 45,9 (C-24); 29,2 (C-25); 19,1 (C-26); 19,4 (C-27); 23,1 (C-28); 12,0 (C-29) Hợp chất AP7: Amentoflavone Chất bột màu vàng, đnc 260-261oC; ESI-MS : m/z 539 [M+H]+; FT-IR νmax (cm-1): 3340, 2974, 2831, 1649, 1557, 1454, 1418, 1024; 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δ (ppm) 6,55 (1H, s, H-3); 6,17 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 6,39 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8); 7,97 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2’); 7,08 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’); 7,83 (1H, dd, J = 2,0; 9,0 Hz, H-6’); 6,56 (1H, s, H-3’’); 6,34 (1H, s, H-6”); 7,50 (2H, d, J = 8,7 Hz, H-2’”, 6’”); 6,71 (2H, d, J = 8,7 Hz, H-3”’; 5’”) 13C NMR (CD3OD, 125 MHz): δ (ppm) 166,2 (C-2); 103,9 (C-3); 183,8 (C-4); 163,1 (C5); 100,2 (C-6); 163,1 (C-7); 95,2 (C-8); 159,3 (C-9); 105,3 (C-10); 123,2 (C-1’); 132,8 (C-2’); 121,8 (C-3’); 161,2 (C-4’); 117,7 (C-5’); 129,3 (C-6’); 165,9 (C2’’); 103,3 (C-3’’); 184,2 (C-4’’); 162,5 (C-5’’); 100,2 (C-6’’); 164,0 (C-7’’); 100,3 (C-8’’); 156,5 (C-9’’); 105,6 (C-10’’); 123,1 (C-1”’); 129,3 (C-2’”); 115,8 (C-3’”); 162,5 (C-4’”); 115,8 (C-5’”); 129,3 (C-6’”) 3.3 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập đƣợc Hoạt tính gây độc tế bào chất PM1-PM9, AP1, AP4, AP5 đánh giá hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư thử nghiệm (KB, Hep-G2, LU-1, MCF-7) thử nghiệm Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các dòng tế bào ung thử thử nghiệm bao gồm: KB-ung thư biểu mô (CCL-17TM); Hep G2- ung thư gan (HB-8065TM); LU-1-tế bào ung thư phổi (HTB-57TM) MCF-7-tế bào ung thư vú (HTB-22TM) CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học lồi Pilea aff martinii Từ cặn chiết loài P.aff martinii, alkaloid mới, pileamartine A (PM1), pileamartine B (PM2), pileamartine C (PM5), pileamartine D (PM6), pileamartine E (PM8) alkaloid biết 1,3,6,6-tetramethyl5,6,7,8-tetrahydro-isoquinolin-8-one (PM3), julandine (PM4), cryptopleurine (PM7), quinine (PM9) phân lập xác định cấu trúc 15 hóa học Đặc biệt có hợp chất pileamartine A (PM1), pileamartine B (PM2) hợp chất có khung mới, chất PM4-PM7 alkaloid có khung phenanthroquinolizidine (Hình 4.50) Hình 4.50 Các hợp chất alkaloid từ lồi Pilea aff martinii 4.1.1 Hợp chất pileamartine A (PM1) (chất mới) Hợp chất PM1 tách dạng chất rắn màu trắng, đnc 184o 186 C, -141,2o (c 0,33; CHCl3) Hiện màu vệt chất TLC với thuốc thử Dragendorff cho màu da cam đậm Trên phổ hồng ngoại hợp chất PM1 có dải hấp thụ đặc trưng liên kết C-H 2945-2833 cm-1 nhóm C=C vòng thơm vùng νmax 1649-1418 cm-1 Phổ ESI-HRMS PM1 xuất pic ion giả phân tử [M+H]+ m/z 380,2247 (tính tốn theo lí thuyết cho cơng thức C24H30NO3, 380,2226) 16 Hình 4.1 Cấu trúc hóa học số tương tác phổ COSY, HMBC PM1 Cùng với liệu phổ 13C NMR, cho phép xác định công thức phân tử PM1 C24H29NO3 Trên phổ 1H NMR PM1, vùng trường thấp có tín hiệu proton thơm dạng singlet δH 6,63 (1H, s); 6,76 (1H, s) proton dạng doublet δH 7,38 (2H, d, J = 8,5 Hz); 6,82 (2H, d, J = 8,5 Hz) Ngoài ra, quan sát thấy tín hiệu cộng hưởng proton vùng aliphatic nằm khoảng δH 1,19-3,50 nhóm methoxy δH 3,78 (3H, s, OCH3); 3,84 (3H, s, OCH3); 3,89 (3H, s, OCH3) C 10 1’ 2’ 3’ Bảng 4.2 Số liệu phổ NMR PM1 C C a,b Ha,c mult (J, Hz) C a,b Ha,c mult (J, Hz) 46,5 2,19ddd(3,3; 11,0; 11,0) 4’ 148,8 2,77 br.d (11,0) 25,9 1,60-1,67 m 5’ 148,5 24,4 1,19-1,21 m 6’ 106,8 6,76 s 1,77-1,80 m 32,4 1,23-1,29 m 1” 141,1 1,80-1,83 m 59,6 2,37-2,42 m 2” 126,5 7,38 d (8,5) 40,0 1,78-1,82 m 3” 113,4 6,82 d (8,5) 59,1 3,27 dd (2,5; 8,0) 4” 157,9 76,8 5” 113,4 6,82 d (8,5) 37,8 2,94 d (17,0) 6” 126,5 7,38 d (8,5) 3,50 d (17,4) 134,7 4’-OCH3 55,9 3,84 s 137,3 5’-OCH3 55,9 3,89 s 107,5 6,63 s 4”-OCH3 55,2 3,78; s a b c đo CDCl3, 125 MHz, 500 MHz 17 Hình 4.3 Phổ 1H NMR giãn rộng PM1 Phân tích phổ 13C NMR DEPT, kết hợp với phổ HSQC cho phép xác nhận có mặt 24 nguyên tử carbon, có nhóm methoxy δC 55,9 (2C) 55,2; nhóm methine sp2 δC 126,5 (2C); 113,4 (2C); 107,5 106,8; nhóm methylene sp3 δC 46,5; 40,0; 37,8; 32,4; 25,9 24,4; nhóm methine sp3 δC 59,6; 59,1 carbon không liên kết với hydro δC 157,9; 148,8; 148,5; 141,1; 137,3; 134,7 76,8 Các liệu phổ gợi ý có mặt hai vòng benzene vị trí 1,4 vị trí 1,2,4,5 cấu trúc PM1 Độ chuyển dịch hoá học nguyên tử carbon C-4′ (δC 148,8); C5′ (δC 148,5) C-4″ (δC 157,9) cho phép giả thiết chúng liên kết với oxy, nguyên tử carbon C-2 (δC 46,5); C-6 (δC 59,6) C-9 (δC 76,8) dự đoán liên kết liên kết chúng với nguyên tử nitơ, liệu phổ khối lượng gợi ý PM1 có số lẻ nguyên tử nitơ phân tử Hình 4.4 Phổ 13C NMR PM1 Các mảnh cấu trúc phân tử (liên kết đậm Hình 4.1) thiết lập nhờ phân tích phổ COSY Phổ COSY cho phép xác định chuỗi tương tác spin-spin 18 H-2’’, H-6’’/H-3’’, H-5’’và H-8/CH2-7/H-6/CH2-5/CH2-4/CH2-3/CH2-2 Các mảnh cấu trúc sau kết nối phân tích liệu phổ HMBC Sự có mặt vòng A xác định nhờ tương tác H-3’ với C1’, C-5’ C-8 H-6’ với C-2’, C-4’ C-10 phổ HMBC Ngồi ra, nhóm methoxy δH 3,84 3,89 cho tương tác tương ứng với C-4’ C-5’, cho thấy C-4’ C-5’ liên kết với nhóm methoxy Tương tự, vòng benzene 1,4 (vòng E) với nhóm methoxy C-4’’ nhận diện nhờ tương tác HMBC Các tương tác HMBC H-3’và H-6’ tương ứng với C-8 C-10; CH2-10 với C-8 C-9 có mặt hệ vòng tiếp giáp A/B Mặt khác, tương tác C-9 với proton H-2’’ H6’’ cho thấy vòng E liên kết với C-9 vị trí C-1’’ vòng E Cuối cùng, hệ dị vòng indolizidine C/D thiết lập nhờ tương tác HMBC C-9 với CH27; C-6 với CH2-2 Từ phân tích trên, khung cấu trúc hợp chất PM1 xác định H-5β H-7H-4β H-10 H-10β H-8 H-2β H-6 H-2 H-5 H-3 H-4 Hình 4.6 Phổ COSY PM1 19 Cấu hình tương đối hợp chất PM1 xác định nhờ phân tích phổ ROESY Trên phổ ROESY PM1 cho thấy tương tác H-2ax (δH 2,19) với H-6 (δH 2,37-2,42) H-10 (δH 3,50), cho phép xác định H-6 chiếm giữ vị trí axial vòng D Tương tác proton thơm H-2″, H-6″ (δH 7,38) với H-8 (δH 3,27) Heq-2 (δH 2,77) cho phép xác định H-8 vòng E phía Từ đó, cho thấy vòng B/C tiếp giáp theo dạng cis Cấu hình tuyệt đối PM1 khẳng định nhờ so sánh kết thực nghiệm với tính tốn phổ lưỡng sắc tròn Phổ CD PM1 cho hiệu ứng Cotton dương 221 nm (Δε: +0,89), 244 nm (Δε: +5,13) hiệu ứng Cotton âm 234 (Δε: 11,58), 286 nm (Δε: -10,21) Phổ CD tính tốn theo lý thuyết cho cấu hình 6S,8R,9S-PM1 cho hiệu ứng cotton tương đồng với phổ CD thu từ thực nghiệm hợp chất PM1 Kết hợp so sánh với phổ CD theo mô hình tính tốn lượng tử dựa phần mềm Gaussian 09 với phổ CD thực nghiệm khẳng định PM1 có cấu hình tuyệt đối 6S, 8R, 9S (Hình 4.11) Từ liệu phổ ESI-HRMS, 1D NMR, 2D NMR, CD cho phép xác định hợp chất PM1 alkaloid đặt tên pileamartine A Đây hợp chất có khung cấu trúc Hình 4.10 Một số tương tác ROESY PM1 Hình 4.11 Phổ CD tính tốn phổ CD thực nghiệm PM1 4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học lồi Boehmeria holosericea Từ cặn chiết B holosericea, phương pháp sắc ký cột silica gel, cột Sephadex, sắc ký lớp mỏng điều chế, phân lập chất ký hiệu tử BH1-BH5 Cấu trúc chất xác định ruspolinone (BH1), benzyl -D-glucoside (BH2), adenine (BH3), adenosine (BH4) uridine (BH5) (Hình 4.56) 20 Hình 4.56 Các hợp chất từ B holosericea 4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học lồi Anacolosa poilanei Hình 4.85 Cấu trúc chất phân lập từ lồi Anacolosa poilanei Từ cặn chiết ethyl acetate vỏ Anacolosa poilanei, phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất AP1-AP7 (Hình 4.85), có 21 hợp chất triterpenoid khung epifriedelane: acid 3α-p-coumaroyl-D:A-friedooleanan-27-oic (AP1), acid trichadenic A (AP2), acid trichadonic (AP3), acid 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan-27-oic (AP4), 3α-(3,4dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan-27,15-α-lactone (AP5); hợp chất steroid β-sitosterol (AP6) hợp chất biflavonoid amentoflavone (AP7) Trong có hợp chất acid 3α-p-coumaroyl-D:A-friedooleanan-27-oic (AP1), acid 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan27-oic (AP4) 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan-27,15-αlactone (AP5) 4.4 Kết thử hoạt tính sinh học Kết thử hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập từ lồi Pilea aff martinii Anacolosa poilanei trình bày Bảng 4.16 4.17.loài Pilea aff martinii Anacolosa poilanei trình bày Bảng 4.16 4.17 4.4.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập từ loài Pilea aff martinii Bảng 4.16 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập từ loài P aff martinii TT Tên mẫu Giá trị IC50 (µM) KB Hep G2 Lu-1 MCF-7 > 50 > 50 > 50 > 50 PM > 50 > 50 > 50 > 50 PM2 > 50 > 50 > 50 > 50 PM 0,554 0,501 0,607 0,686 PM 0,663 0,796 0,663 0,637 PM 0,025 0,027 0,110 0,744 PM 0,398 0,186 0,504 0,398 PM > 50 > 50 > 50 > 50 PM 1,179 1,301 1,463 2,073 Ellipticine Kết Bảng 4.16 cho thấy, hợp chất PM4-PM7 thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư thử nghiệm, hợp chất PM6 thể hoạt tính tốt với dòng tế bào ung thư biểu mô KB ung thư gan Hep G2 với giá trị IC50 0,025 0,027 M Hợp chất PM6 thể hoạt tính tốt hai dòng tế bào ung thư phổi LU-1 ung thư vú MCF-7 với giá trị IC50 0,110 0,744 M Hợp chất PM7 thể hoạt tính tốt dòng tế bào ung thư gan Hep G2 với giá trị IC50 0,186 M, đồng thời hợp chất thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với dòng tế bào ung thư KB, LU-1, MCF-7 với giá trị IC50 0,398; 0,504 0,398 M Các hợp chất PM4 22 PM5 thể hoạt tính gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 0,501-0,796 M 4.4.2 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất từ loài A poilanei Bảng 4.17 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập từ loài A poilanei TT Tên mẫu Giá trị IC50 (µM) KB Hep G2 LU-1 MCF-7 AP1 12,25 14,85 11,34 10,00 AP4 26,84 27,16 >50,0 >50,0 AP5 19,34 20,63 >50,0 >50,0 Ellipticine 1,26 1,42 1,83 2,15 Kết cho thấy, số hợp chất triterpene phân lập từ Anacolosa poilanei, AP1 có hoạt tính gây độc tế bào tốt dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 từ 10,00-14,85 µM Hợp chất AP4, AP5 có hoạt tính trung bình dòng tế bào ung thư KB HepG2 với giá trị IC50 từ 19,34-27,16 µM KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Về nghiên cứu thành phần hóa học 1.1 Đã phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ Pilea aff martinii (H.Lév.) Hand.-Mazz pileamartine A (PM1), pileamartine B (PM2), 1,3,6,6-tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydro-isoquinolin-8one (PM3), julandine (PM4), pileamartine C (PM5), pileamartine D (PM6), cryptopleurine (PM7), pileamartine D (PM8), quinine (PM9) Trong số hợp chất phân lập có có alkaloid có khung pileamartine A (PM1), pileamartine B (PM2) alkaloid pileamartine C (PM5), pileamartine D (PM6) pileamartine E (PM8) Đã xác định cấu hình tuyệt đối hợp chất nhờ so sánh kết thực nghiệm với tính tốn phổ lưỡng sắc tròn (CD) theo mơ hình tính tốn lượng tử dựa phần mềm Gaussian 09 1.2 Đã phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ Boehmeria holosericea Blume (Gai toàn tơ) ruspolinone (BH1), benzyl -Dglucoside (BH2), adenine (BH3), adenosine (BH4) uridine (BH5) 1.3 Đã phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ vỏ Anacolosa poilanei Gagnep (Xinh) acid 3α-p-coumaroyl-D:A-friedo-oleanan-27-oic (AP1), acid trichadenic A (AP2), acid acid trichadonic (AP3), acid 3α-(3,4dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan-27-oic (AP4) 3α-(3,4dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan-27,15-α-lactone (AP5), β-sitosterol 23 (AP6), amentoflavone (AP7) Trong số hợp chất phân lập có hợp chất triterpene khung D:A-friedo-oleanan-27-oic acid 3α-p-coumaroyl-D:Afriedo-oleanan-27-oic (AP1), acid 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedooleanan-27-oic (AP4) 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan27,15-α-lactone (AP5) Về nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào Đã đánh giá hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư người bao gồm ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (LU-1), ung thư vú (MCF-7) hợp chất PM1-PM8 phân lập từ thân cây Pilea aff martinii (H.Lév) Hand-Mazz hợp chất AP1, AP4, AP5 phân lập từ vỏ Anacolosa poilanei Gagnep Kết cho thấy: 2.1 Các hợp chất PM4-PM7 có hoạt tính ức chế mạnh với dòng tế bào ung thư thử nghiệm, với giá trị IC50 khoảng 0,025 - 0,796 µM Các hợp chất PM1, PM2, PM3, PM8 khơng có hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư thử nghiệm 2.2 Hợp chất AP1 thể hoạt tính ức chế tất dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 từ 10,00-14,85 µM Hợp chất AP4 AP5 có hoạt tính yếu với hai dòng tế bào ung thư biểu mơ (KB) ung thư gan (Hep-G2) với giá trị IC50 AP4 26,84 27,16 µM; giá trị IC50 AP5 19,34 20,63 µM Hợp chất AP4 AP5 khơng có hoạt tính ức chế hai dòng tế bào ung thư phổi (LU-1) ung thư vú (MCF-7) KIẾN NGHỊ - Hiện nay, hai loài Pilea martinii (H.Lév.) Hand.-Mazz thuộc họ Gai (Urticaceae) Anacolosa poilanei Gagnep thuộc họ Dương đầu (Olacaceae) chưa ứng dụng khai thác nhiều Do đó, cần sâu nghiên cứu hoạt tính sinh học dược học loài nhằm khẳng định thêm giá trị khoa học, đồng thời góp phần việc tạo sản phẩm phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng - Cần khảo sát thêm hoạt tính sinh học khác hợp chất phân lập từ hai loài thực vật trên, đặc biệt alkaloid khung phenanthroquinolizidine hợp chất triterpen khung D:A-friedooleanan-27-oic nhằm tìm kiếm khả ứng dung hợp chất 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Doan Thi Thuy Ai, Trinh Thi Thanh Van, Doan Thi Mai Huong, Marc Litaudon, Le Huyen Tram, Chau Van Minh, Pham Van Cuong (2015) Constituents from stem barks of Anacolosa Poilanei Gagnep (Olacaceae) Vietnam Journal of Chemistry, 53 (2e), 124-126 Doan Thi Thuy Ai, Trinh Thi Thanh Van, Doan Thi Mai Huong, Marc Litaudon, Le Huyen Tram, Chau Van Minh, Pham Van Cuong (2016) Alkaloids from Pilea martinii (H.Lév.) Hand-Mazz (Urticaceae) and their cytotoxic activities Journal of Science and Techology, 111, 011-014 Doan Thi Thuy Ai, Trinh Thi Thanh Van, Doan Thi Mai Huong, Marc Litaudon, Le Huyen Tram, Pham Van Cuong (2018) Chemical constituents of Boehmeria holosericea Blume (Urticaceae) Vietnam Journal of Chemistry, 56 (2) 172-175 Doan Thi Thuy Ai, Trinh Thi Thanh Van, Doan Thi Mai Huong, Marc Litaudon, Le Huyen Tram, Chau Van Minh, Pham Van Cuong (2018) Pileamartines A and B: Alkaloids from Pilea aff martinii with a new carbon skeleton Tetrahedron Letters, 59, 1909-1912 Doan Thi Thuy Ai, Trinh Thi Thanh Van, Doan Thi Mai Huong, Marc Litaudon, Le Huyen Tram, Nguyen Van Hung, Chau Van Minh, Pham Van Cuong (2018) Cytotoxic Alkaloids from Leaves of Pilea aff martinii Planta Medica (Chờ in) 25 ... tài Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào loài Pilea aff martinii (H.Lév.) Hand.-Mazz., Boehmeria holosericea Blume, Anacolosa poilanei Gagnep.” Mục tiêu nội dung nghiên cứu luận. .. đại; Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập số dòng tế bào ung thư người Những đóng góp luận án Lần nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Pilea aff martinii (H.Lév.). .. (C-5’”); 129,3 (C-6’”) 3.3 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập đƣợc Hoạt tính gây độc tế bào chất PM1-PM9, AP1, AP4, AP5 đánh giá hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư thử nghiệm (KB,