Muc tiêu của đề tài là phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất từ thân và rễ loài Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) và Nhó đông (Morinda longissima Y. Z. Ruan), nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan và kháng virus viêm gan B của cao chiết và các hợp chất sạch.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-TRẦN THU HƯỜNG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA CÂY XÁO TAM PHÂN (PARAMIGNYA
TRIMERA (OILV.) GUILL.) VÀ CÂY NHÓ ĐÔNG (MORINDA
LONGISSIMA Y Z RUAN)
Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
Mã số chuyên ngành: 9.44.01.17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC
Hà Nội, 2020
Trang 2Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
-Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Nguyễn Mạnh CườngNgười hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Đỗ Thị Thảo
… năm 2020
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của luận án
Ở Việt Nam, hiện bẩy loài Paramignya phân bố chủ yếu ở miền nam Loài Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) có tên địa
phương là thần dược và Xáo tam phân Cây là cây đặc hữu ở ViệtNam Thân và rễ của cây được được dùng để điều trị các bệnh vềgan, đặc biệt là xơ gan
Morinda longissima Y Z Ruan (Rubiaceae) là loài cây nhỏ
phân bố chủ yếu ở khu vực phía bắc Việt Nam Đồng bào Thái tỉnhSơn La và Lai Châu sử dụng thân rễ và rễ cây để chữa các bệnh vềgan, viêm và phù nề
Do đó, nhiệm vụ nghiên cứu và thành phần hóa học của thân
và rễ loài Xáo tam phân và Nhó đông ở nước ta là quan trọng và cầnthiết Từ đó, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học
và tác dụng sinh học của cây Xáo tam phân (Paramignya trimea (Oliv.) Guill.) và cây Nhó đông (Morinda longissima Y Z Ruan)”
2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án
- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất từ
thân và rễ loài Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) và Nhó đông (Morinda longissima Y Z Ruan).
- Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan và kháng virus viêm gan Bcủa cao chiết và các hợp chất sạch
3 Những nội dung nghiên cứu chính của luận án
- Đánh giá tác dụng bảo vệ gan và tác dụng kháng virus viêm gan Bcủa các cao chiết tổng
- Phân lập các hợp chất từ thân và rễ loài Xáo tam phân và Nhó đông
- Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập
- Đánh giá tác dụng bảo vệ gan và kháng virus viêm gan B của một
số hợp chất sạch
Bố cục của Luận án:
Luận án bao gồm 139 trang với 45 bảng, 21 hình, 4 sơ đồ phân lập
và 137 tài liệu tham khảo Luận án bao gồm 4 chương: Giới thiệu (2trang), Chương 1: Tổng quan (28 trang); Chương 2: Đối tượng vàphương pháp nghiên cứu (02 trang); Chương 3: Kết quả (10 trang),Chương 4: Thảo luận (83 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1trang); Các bài báo liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu thamkhảo (15 trang); Phụ lục (31 trang)
Trang 4CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN
Phần tổng quan này đã đề cập đến những vấn đề sau:
- Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Paramignya.
- Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Morinda.
- Tổng quan về kỹ thuật đánh giá tác dụng bảo vệ gan và kháng virusviêm gan B
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Thân và rễ cây Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.)
Guillaum) (C-499) được thu hái vào tháng 2/2013 tại xã Ninh Vân,huyện Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa Thân và rễ cây Nhó đông
(Morinda longissima Y Z Ruan) (C-547) được thu hái vào tháng
4/2013 tại xã Chiềng An, tỉnh Sơn La Tên khoa học của hai loài câytrên được xác định bởi TS Nguyễn Quốc Bình, Bảo tàng thiên nhiênViệt Nam, Viện KH&CN Việt Nam Mẫu tiêu bản của hai cây đượclưu trữ tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chấtthiên nhiên, kí hiệu mẫu là C-499 và C-547
2.2 Phương pháp
Phương pháp hóa học
Phương pháp sắc ký bản mỏng TLC, phương pháp phân lậpbằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường, pha đảo,Diaion HP-20, Sephadex LH-20
Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập ra được xácđịnh bằng cách kết hợp các phương pháp vật lý và hóa học, sửdụng các phương pháp phổ bao gồm phổ ESI-MS, HR-ESI-MS,1D và 2D-NMR
Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Các cặn chiết và các hợp chất sạch được đánh giá bằng cácphương pháp sau:
- Tác dụng kháng virus viêm gan B (HBV) trên in vitro trêndòng HepG2.2.15 nhiễm HBV dựa trên giá trị ức chế mức độbiểu hiện HBsAg (IC50)
- Đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo trên chuột BALB/c trên
mô hình gây độc gan bằng paracetamol
Trang 5CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1 Đánh giá tác dụng sinh học của các cao chiết và phân đoạn 3.2 Phân lập các hợp chất từ loài Xáo tam phân
Từ thân rễ cây Xáo tam phân đã phân lập và xác định cấu
trúc của 10 hợp chất, gồm 5 coumarin, ostruthin (PT-1), ninhvanin (PT-2, mới), 6-(6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7-dienyl)-7-
hydroxycoumarin (PT-6), ninhvanin B (PT-7, mới), hai hợp chất biscoumarin monoterpen glycosides, paratrimerin A (PT-8, mới) và paratrimerin B (PT-9, mới), 01 cromen, 6-(2-hydroxyethyl)-2,2- dimethyl-2H-1-benzopyran (PT-3),01 alcaloid, citrusinine-I (PT-
4),01 ancol, paramitrimerol (PT-5, mới) và 01 hợp chất limonoid
glucoside mới, parabacunoic acid (PT-10, mới)
Các đặc điểm, tính chất và các thông số phổ của 10 hợp chấtphân lập được được trình bày ở phần này
3.3 Phân lập các hợp chất từ loài Nhó đông
Từ thân rễ loài Nhó đông đã phân lập và xác định cấu trúc của
22 hợp chất gồm: 12 hợp chất anthranoid, damnacanthal (ML-1),
lucidin-ω-methyl ether (ML-2), soranjidiol (ML-3), morindone
-5-methyl ether (ML-4), rubiadin (ML-5), rubiadin-3 5-methyl ether (ML-6), damnacanthol (ML-7), morindone (ML-8), 1-hydroxy-2- methyl-6-methoxy anthraquinone (ML-9), morindone-6-methyl ether
(ML-10), morindone-6-O-β-gentiobioside (ML-11),
lucidin-3-O-β-primeveroside (ML-12), 02 naphtalen glycosid mới, morinlongoside
A (ML-13, mới), morinlongoside B (ML-14, mới), 02 iridoid glycosid, morinlongoside C (ML-15, mới), geniposidic acid (ML-
16), 05 hợp chất glycosid,
3-O-[β-D-xylopyranosyl-(1-6)-β-D-lucopyranosyl]-(3R)-l-octen-3-ol (ML-17), acteoside (ML-18), cistanoside E (ML-19), ethyl-β-D-galatopyranoside (ML-20),
isoacteoside (ML-21) và một flavonoid quercetin (ML-22).
Đặc điểm, tính chất và các thông số phổ của 22 hợp chất phânlập được trình bày tại phần này
3.4 Đánh giá tác dụng sinh học của các hợp chất sạch
Trang 6CHƯƠNG 4 THẢO LUẬN KẾT QUẢ
Chương này trình bày về thảo luận về các kết quả về đánhgiá tác dụng sinh học các cao chiết và phân đoạn, về phân lập và xácđịnh cấu trúc của các hợp chất và hoạt tính sinh học của các hợp chấtsạch
4.1 Đánh giá tác dụng sinh học của các cao chiết và phân đoạn
4.1.1 Đánh giá tác dụng kháng viêm gan virus B
Bảng 4 1 Ảnh hưởng của các cao chiết đến khả năng sống của tế
Bảng 4 2 Khả năng ức chế biểu hiện HBsAg trên tế bào
HepG2.2.15 của các cao chiết STT Ký hiệu Phân đoạn Nồng độ Giá trị OD
(450nm) SE
Mức độ biểu hiện HBsAg ( %)
Trang 75 PR cao nước 60 µg/ml 1,647 0,066 140,37 6
PR1
phân đoạn dianion của cao nước
60 µg/ml 1,393 0,011 115,89 7
PR2 phân đoạn dianion của cao
nước
60 µg/ml 1,406 0,016 117,19 8
PR3
phân đoạn dianion của cao nước 60 µg/ml 1,310 0,035 107,939
PR4
phân đoạn dianion của cao nước
60 µg/ml 1,269 0,014 103,98
10 ML EtOH extract 60 µg/ml 0,91 0,028 69,37
11 W cao chiết nước 60 µg/ml 1,051 0,06 85,04
Kết quả cao etanol và cao nước của loài Nhó đông có tácdụng làm giảm mức độ biểu hiện của HBsAg của tế bào HepG2.2.15
Bảng 4 3 Nồng độ ức chế biểu hiện HBsAg trên tế bào
HepG2.2.15 của các cao chiết Nồng độ Abs 450 SE Ức chế (%) IC 50 (μg/ml)
Cao tổng etanol (ML) và cao nước (W) của thân và rễ loài Morinda
longissima có tác dụng kháng HBV trên in vitro.
4.1.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên in vivo
- Cao metanol và cao nước rễ Xáo tam phân có tác dụng bảo vệ gantrên mô hình chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol
Bảng 4 4 Ảnh hưởng của cao metanol và cao nước lên nồng độ
aminotransferase huyết thanh
Lô Thuốc và liều lượng AST (UI/L) ALT (UI/L)
1 Đối chứng sinh lý 87,80 ± 1,48 28,70 ± 2,59
2 Đối chứng bệnh lý 715,75 ± 253,94p<0,05 so với (1) 558,25 ± 296,54p<0,05 so với (1)
Trang 83 cao metanol 10g/kg
116,50 ± 34,65
p<0,05 so với (2) p>0,05 so với (5)
81,25 ± 8,59
p<0,05 so với (2) p>0,05 so với (5)
4 cao nước liều 10g/kg
266,00 ± 170,92
p<0,05 so với (2) p<0,05 so với (5)
113,25 ± 27,41
p<0,05 so với (2) p<0,05 so với (5)
5 Đối chứng tham khảo
101,33 ± 23,03
p<0,05 so với (1) p<0,05 so với (2)
46,67 ± 11,47
p<0,05 so với (1) p<0,05 so với (2)
Hình 4.1 Tiêu bản vi thể tế bào gan (A): Đối chứng sinh lý, (B): Đốichứng bệnh lý, (C): cao metanol liều 10g/kg, (D) cao nước liều
10g/kg, (E): Đối chứng tham khảo
4.2 Xác định cấu trúc các hợp chất từ thân rễ cây Xáo tam phân
Bằng cách kết hợp các dữ liệu phổ NMR một chiều và 2chiều, IR, MS, UV, 10 hợp chất được phân lập từ thân rễ loài Xáotam phân đã được xác định cấu trúc như sau:
6 7 8 9
12 13
14
PT-3
(6-(2-Hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran), C 13 H 16 O 2 , 203
PT-4 (citrusinine-I), C16 H 15 NO 5 , 301
PT-5 (paramitrimerol) mới, C14 H 16 O 3 , 232
Trang 9PT-6
6-(6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7-dienyl)-7-hydroxycoumarin, C 19 H 22 O 4 , 314 PT-7 (ninhvanin B) mới, C19H22O4, 314
PT-9 (paratrimerin B) mới, C40 H 44 O 16 , 780
PT-8 (paratrimerin A) mới, C45 H 52 O 20 , 912 PT-10 (axit parabacunoic) mới, C32H44O13, 636
Hợp chất PT-8 được phân lập dưới dạng bột vô định hình
màu trắng, tan trong các dung môi hữu cơ như axeton, clorofom,[α]D25 - 25,0o(c 0,02, MeOH) Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-
MS với hai peak ion giả phân tử ở m/z 781,2691 [M+H]+ và803,2548 [M+Na]+ cho biết công thức phân tử của PT-8 là C40H44O16
Ion mảnh ở m/z 457,1637 [M-C12H20O10 +H]+ cho thấy hợp chất PT-8
là một mono-coumarin glucoside
Phổ IR với các tần số dao động hóa trị νmax 3379 và 1646 cm
-1 chứng minh sự có mặt của các nhóm chức OH và Cacbonyl COlacton Phổ UV-Vis cho thấy sự có mặt của hệ liên hợp chromophore(coumarin) ở νmax 204, 256, 292, 330 nm Trên phổ 13C-NMR/DEPT
của PT-8 xuất hiện tín hiệu 40 cacbon, gồm 12 nguyên tử cacbon bậc
bốn, 22 nhóm metin (có 8 cacbon trong khoảng 74-79 ppm), 4 nhómmetilen (có hai cacbon trong khoảng 62,4-62,8 ppm), và 2 nhómmetyl Phổ 1H-NMR của PT-8 có xuất hiện các tín hiệu proton của
hai vòng coumarin thế ở vị trí C-6,7 với hai cặp proton thơm dạng
Trang 10Cấu trúc gồm hai coumarin thế ở vị trí C-6,7 của PT-8 được
khẳng định một lần nữa qua các tương tác trên phổ COSY, HMBC,NOESY (Hình 4,12) Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR của PT-8 có xuất
hiện các tín hiệu của hai đơn vị đường β-D-glucose, cụ thể là hai proton anomer δH 4,99 (H-1''), 4,93 (H-1'''), hai cacbon anomer
102,49 (C-1'''), 101,62 (C-1''), 8 nhóm metin gắn với oxi ở δC
62,48-78,42 ppm và các tín hiệu proton ở δH 3,21-3,90 ppm Ngoài
ra, vị trí liên kết giữa hai đường glucose và hai nhân coumarin được
xác định bằng dữ kiện phổ HMBC của PT-8 thông qua tương tác
giữa proton anomer H-1'' (δH 4,99, d, 8 Hz) và cacbon C-7 (δC
158,35), giữa H-1''' (δH 4,93, d, 7,5 Hz) và C-7' (δC 160,03) cho phépxác định Hơn nữa, trên phổ NOESY xuất hiện tương tác giữa giữaproton anome H-1 và H-1 với hai proton thơm H-8 và H-8 khẳngđịnh vị trí liên kết của hai đường glucose với hai nhân coumarin
Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR hợp chất PT-8 còn xuất hiện
thêm một cầu nối monoterpen (C10) được xác định là vinylcyclohexene tương tự như hợp chất bisparasin [111] Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu đặc trưng của cầu nối này bởi tín hiệu của
1,4-dimethyl-4-một liên kết đôi có cấu hình trans [δH 6,41 (1H, d, 16,5 Hz, H-9) và
δH 6,35 (1H, d, 16,5 Hz, H-10)], một olefin proton singlet H-10' (δH
5,35, s); 4 proton không tương đương dạng peak multilet thuộc về
hai nhóm metilen-vicinal H-12 (δH1,65 &1,88, m) và H-12' (δH 2,16
& 2,29, m), hai nhóm metyl thế CH3-11' (δH 1,85, br s) và CH3-11 (δH
1,31, s) Cấu trúc cầu nối 1,4-dimethyl-4-vinylcyclohexene với haivòng coumarin được khẳng định bằng phổ HMBC, thông qua tương
Trang 11tác giữa nhóm metyl CH3-11' (δH 1,85) và C-10' (δC124,55), C-11'
(δC135,60) và C-12' (δ C28,56), tương tác nhóm metyl CH3-11 (δH
1,31) với C-10 (δC 140,92), C-11 (δC 40,22) và C-12 (δC 31,95) Liên
kết giữa vòng monotecpen và hai vòng courmarin của hợp chất PT-8
được chứng minh qua tương tác HMBC qua ba liên kết (3J) giữa
proton trans-olefin H-9 (δH 6,41) và C-5 (δC 126,6), trans-olefin
H-10 (δH 6,37) và C-6 (δC 127,66), giữa H5' (δH 7,39) và C-9'(δC 44,34).Liên kết giữa vòng monotecpen và hai vòng courmarin được khẳngđịnh thêm một lần nữa trên phổ NOESY, xuất hiện tương tác giữa haiproton thơm H-5 và H-5' của vòng coumarin với proton vinyl H-9 vàH-9' Như vây, qua các tương tác HMBC và NOESY trên cho phépxác định vị trí liên kết giữa vòng monotecpen và hai vòng courmarin
là tại C-6/C-9 và C-6'/C-9', Hơn nữa, từ phổ NOESY cho thấy cótương tác giữa nhóm 11-CH3 (δH 1,31, s) và proton H-9' (δH 4,13, s)
chứng minh tính chất cấu hình dạng cis giữa hai nhóm này, cũng như cấu hình dạng cis giữa hai nhân coumarin Cấu hình dạng ghế của
cầu nối 1,4-dimethyl-4-vinylcyclohexene được khẳng định bằngtương tác NOESY của proton metylen H-12 (δH 1,87, m) với H-12(δH 2,16, m) và đồng thời cho phép xác định vị trí nhóm 11-CH3 vàproton H-9 là axial- và pseudo-axial trên cầu nối này
Trên phổ NOESY xuất hiện tương tác giữa hai proton thơm
H-5 (δH 7,47) với proton H-4 (δH 7,88) của hai nhân coumarin và đặcđiểm cản quay do hai vòng coumarin glucozit cồng kềnh và cấu hình
dạng cis của hai nhóm thế coumarin trên, cho phép xác định cấu hình tại hai cacbon bất đối C-9' và C-11 có thể xuất hiện ở dạng 9'S,11S hoặc 9'R,11R
Hình 4.11 Phổ 1H-NMR của hợp chất PT-8
Trang 12Hình 4.12 Tương tác COSY, NOESY và HMBC của hợp chất 8
Trang 139' 44,34 (d) 4,13, s 12, 5',
11'-CH 3
12,
11-CH 3 , 5' 10' 124,60 (d) 5,35, s 11'-CH 3
74,77 (d)
3,58, dd, 8,0, 8,0 Hz 1''' 3''' 78,34 (d) 3,42 -3,53, m
5''' 78,38 (d) 3,42 -3,53, m
6''' 62,48 (t) 3,88, dd, 12, 2 Hz
3,70, dd, 12, 6,5 Hz
Dựa vào dữ kiện phổ trên, hợp chất PT- 8 được xác định là
một biscoumarin glucoside mới lần đầu tiên được phân lập từ tựnhiên và đặt tên là paratrimerin A
4.3 Xác định các hợp chất từ thân rễ cây Nhó đông
Trang 14Bằng cách kết hợp các dữ liệu phổ NMR một chiều và 2chiều, IR, MS, UV, 22 hợp chất được phân lập từ thân và rễ loài Nhóđông đã được xác định cấu trúc như sau:
Trang 154.4 Đánh giá tác dụng sinh học của các hợp chất sạch
4.4.1 Đánh giá tác dụng kháng viêm gan virus B
Đánh giá ảnh hưởng tới khả năng sống tế bào HepG2.2.15 của
09 hợp chất sạch đã được đánh giá bằng MTS sau 48 giờ ủ
Bảng 4 3 Ảnh hưởng tới khả năng sống tế bào HepG2.2.15 của
các hợp chất sạch
stt Nồng
độ Ký hiệu Hợp chất Giá trị OD % Sống sót 1
Trang 1610 µM VHKC 1114
2,2-dimethyl-2H-1-
Bảng 4 4 Khả năng ức chế biểu hiện HBsAg trong tế bào Hep2.2.15
VHKC 1138 damnacanthal (ML- 1) 20 µM 1,077 0,094 85,42
VHKC 1139 rubiadin (ML-5) 20 µM 1,058 0,077 83,64
Morindone (ML-8), rubiadin (ML-5) và damnacanthal (ML-1)
có khả năng ức chế tốt biểu hiện HBsAg
Bảng 4 5 Giá trị IC50 của 03 mẫu chất sạchNồng độ Abs 450 SE Ức chế % IC 50(µM)