Mục đích nghiên cứu của đề tài là chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ quả gội nước (Anphanamixis polystachya), quả xà cừ (Khaya senegalensis) và quả xoan (Melia azedarach).
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
VŨ THỊ HIỀN
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA QUẢ CÁC
CÂY GỘI NƯỚC (Anphanamixis polystachya),
XÀ CỪ (Khaya senegalensis) VÀ XOAN (Melia azedarach) THUỘC HỌ XOAN (MELIACEAE)
Trang 3MỞ ẦU
Lý ọ ề
Những năm gần đây có nhiều cây thuốc y học cổ truyền của y học là đối tượng nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng điều trị ung thư, qua đó đã và đang phát hiện ra hàng loạt chất mới, nhiều chất rất có triển vọng trở thành những chất dẫn đường
Họ Xoan được quan tâm nghiên cứu trên thế giới với thành phần hóa học của họ Xoan rất đa dạng và phong phú gồm các lớp chất limonoid, mono-, di-, sesqui-, và triterpenoid, coumarin, chromone, lignan, flavonoid đặc biệt lớp chất limonoid gần 2000 hợp chất có cấu trúc thú vị, với các hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, ngán ăn côn trùng Nhiều hợp chất limonoid thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, gây độc hại tế bào, chống khối u và chống HIV
Cây gội nước (Anphanamixis polystachya), xà cừ (Khaya senegalensis)
và xoan (Melia azedarach) thuộc loại cây thuốc dân gian Việt Nam Cây được
trồng và mọc hoang dại nhiều nơi ở Việt Nam, nhưng cũng được trồng nhiều ở trạm xá đông y, y tế xã và trong nhà dân Tuy nhiên cho đến nay hầu như chưa
có công trình nghiên cứu nào về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các cây này của Việt Nam được công bố Với mong muốn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng trong dân gian, nâng cao tính hiệu quả, an toàn của dược liệu, đưa dược liệu vào sử dụng một cách khoa học hơn và có thể đẩy mạnh khai thác sử dụng cây thuốc này vào việc phòng và chữa bệnh cho nhân dân trong cộng đồng các dân tộc Việt Nam Do vậy, việc nghiên cứu về họ xoan ở Việt Nam là một yêu cầu bức thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn quan trọng, góp phần quan trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, về giá trị kinh tế và tầm quan trọng của nguồn dược liệu thiên nhiên của nước ta Vì lý
Đối tượng nghiên cứu của luận án là dịch chiết từ quả các cây quả các
cây gội nước (Anphanamixis polystachya), xà cừ (Khaya senegalensis) và xoan
(Melia azedarach) ở Việt Nam
N ụ ứ
- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp
chất từ quả gội nước (Anphanamixis polystachya), quả xà cừ (Khaya senegalensis) và quả xoan (Melia azedarach)
- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất
- Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được
Trang 42
4 P ơ ứ
- Phương pháp lấy mẫu: mẫu quả cây thu hái, định danh, sấy khô bằng
thiết bị sấy bơm nhiệ Chiết với thiết bị siêu âm, cất quay chân không thu cao chiết cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm
- Phương pháp tách và phân lập: đã sử dụng các phương pháp sắc ký
(CC), sắc ký lớp mỏng (TLC) với pha tĩnh khác nhau như silica gel, sephadex LH-20, RP-18, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với cột ODS
- Phương pháp xác định cấu trúc: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau như 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC đã được sử dụng
- Thăm dò các hoạt tính sinh học kháng viêm và hoạt tính kháng khuẩn,
kháng nấm bảo vệ thực vật
5 N ớ ủ
Lần đầu tiên nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của quả
các cây gội nước (Anphanamixis polystachya), xà cừ (Khaya senegalensis) và xoan (Melia azedarach) ở Việt Nam, chúng tôi đã thu được một số kết quả như
- 02 hợp chất sterol: β-sitosterol, -sitosterol-3-O--D-glucopyranoside
Các hợp chất (AP1, AP2, AP3, AP4) lần đầu tiên phân lập từ cây này
2 Từ dịch chiết quả xà cừ (Khaya senegalensis) phân lập được 6 hợp
chất:
- 04 hợp chất limonoid: seneganolide, khayanone, khayanolide B, acetoxy-methyl angolensate;
6 02 hợp chất flavonoid: (6 )6 epicatechin và quercitrin
3 Từ dịch chiết quả xoan (Melia azedarach) phân lập được 8 hợp chất:
- 01 limonoid ớ :
3α,12α-diacetoxy-7α-benzoyloxy-1α-hydroxytrichilinin được gọi tên là trichilinin F
- 02 hợp chất flavonoid: apigenin và quercetin 3-O-[rhamnopyranosyl-(1→6)]--D-glucopyranoside)
-L 01 hợp chất triterpenoid: taraxerol;
- 02 hợp chất phenolic: scopoletin và acid vanillic;
- 02 hợp chất sterol: β-sitosterol, -sitosterol-3-O--D-glucopyranoside
Trang 54 Lần đầu tiên đánh giá hoạt tính kháng nấm của các hợp chất phân lập:
AP2, AP3, KS2, KS3, KS4 với Fusarium oxysporum Kết quả cho thấy KS3
có hoạt tính kháng nấm mạnh với hiệu quả ức chế trên 80% ở nồng độ 500ppm
và không suy giảm sau 7 ngày nuôi cấy
6 C ủ
Luận án bao gồm 112 trang với 21 bảng số liệu, 19 hình và 3 sơ đồ với
109 tài liệu tham khảo Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (25 trang), phương pháp và thực nghiệm (20 trang), kết quả và thảo luận (69 trang), kết luận (1 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (8 trang) Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 130 phổ của một số hợp chất chọn lọc
2 Cây gội nước (Aphanamixis polystachya)
- Giới thiệu về đặc điểm thực vật của cây gội nước (Aphanamixis
polystachya)
- Thành phần hóa học của cây gội nước (Aphanamixis polystachya)
- Hoạt tính sinh học của cây gội nước (Aphanamixis polystachya)
3 Cây xà cừ (Khaya senegalensis)
- Giới thiệu về đặc điểm thực vật của cây xà cừ (Khaya senegalensis)
- Thành phần hóa học của cây xà cừ (Khaya senegalensis)
- Hoạt tính sinh học của cây xà cừ (Khaya senegalensis)
4 Cây xoan (Melia azedarach)
- Giới thiệu về đặc điểm thực vật của cây xoan (Melia azedarach)
- Thành phần hóa học của cây xoan (Melia azedarach)
- Hoạt tính sinh học của cây xoan (Melia azedarach)
CHƯ NG PHƯ NG PH P VÀ TH C NGHIỆM
P ơ ứ
P ơ :
Trang 64 Mẫu quả cây thu hái, định danh, sấy khô bằng thiết bị sấy bơm nhiệt Chiết với thiết bị siêu âm, cất quay chân không thu cao chiết cho nghiên cứu
được nêu ở phần thực nghiệm
P ơ ế x , , x ị :
Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sử dụng các phương pháp sắc ký như: phương pháp sắc ký (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC) với pha tĩnh khác nhau như silica gel, sephadex LH-20, RP-18, sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) với cột ODS
P ơ s :
Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lượng (ESI-MS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC, COSY, NOESY; cấu trúc lập thể tương của các hợp chất này được xác định các phương pháp phổ NMR
4 P ơ ử s ọ
Thử hoạt tính sinh học kháng viêm và thử nghiệm sinh học trực tiếp cho hoạt tính chống nấm gây bệnh thực vật Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các
hợp chất phân lập với C acutatum, C fragariae, C gloeosporioides, F
oxysporum, B cinerea và P obscurans
H ế ị
2.2.1 H : Các dung môi ngâm chiết mẫu thực vật thuộc thuộc loại
tinh khiết (pure) Các dung môi sử dụng cho các loại sắc ký lớp mỏng và sắc
ký cột thuộc loại tinh khiết phân tích (PA) Các dung môi được sử dụng là:
hexan, metanol, butanol, etyl axetat, axeton, nước cất
T ế ị: Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3; Độ quay cực
được đo trên máy phân cực kế Jasco DIP -370; Phổ tử ngoại UV được ghi trên máy quang phổ Hitachi UV-3210, phổ hồng ngoại IR đo trên máy quang phổ Shimadzu FTIR-8501 và Bruker, viên nén KBr; Phổ khối lượng (ESI-MS, HR-ESI-MS) được đo trên máy Bruker Dailtonics APEX II 30eV spectrometer Trường Đại học Y Trung Quốc (Đài Loan) và máy micrOTOF-QII 10187 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh; Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker 500MHz, phổ 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY và NOESY được đo trên máy Bruker
125 MHz (Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) với chất chuẩn là TMS; Sắc ký cột sử dụng silicagen cỡ hạt 60,70-230 Kieselgel và 230-240 (Merck) Bản mỏng được tráng kieselgel 60 và các chất hiển thị bằng dung dịch H2SO4 10% ở 1100 C trong thời gian 10 phút, bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm; dùng hơi Iot (I2) hiện màu
2.3 N ứ ừ q ộ ớ (Aphanamixis polystachya)
2.3.1 Ph ơ
Trang 7Quả cây gội nước (Anphanamixis polystachya) được thu hái ở khu bảo
tồn Vũ Quang-Hà Tĩnh vào tháng 08/2013 và được PGS TS Trần Huy Thái (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học và tiêu bản (DHV-2013) được lưu giữ tại
khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh
2.3.2 P
Lấy 4,0 kg mẫu khô của quả cây gội nước, sấy ở 40oC, sau đó xay nhỏ rồi được chiết với metanol ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 tuần Dịch chiết được cất thu hồi dung môi, thu được 290g cao Sau đó chiết lần lượt với cloroform và butanol, cất thu hồi dung môi thu được 106g và 35g cao, tương ứng Cao cloroform được tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexan-axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) và hệ dung môi CHCl3:CH3OH (100:0, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1) thu được 7 phân đoạn chính (kí hiệu từ F1 đến F7) (sơ
đồ 2.1)
Phân đoạn F1 (8,6 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x
5 cm) rửa giải bằng hệ dung môi hexan:axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1), mỗi hệ dung môi sử dụng 250 ml, thu được 7 phân đoạn (kí hiệu từ F1.1 đến F1.7) Phân đoạn F1.4 (1,0 g) đã được sắc ký trên cột silica gel (200 gam, 60 x
5 cm) với hệ dung môi rửa giải hexan:axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1, mỗi
hệ dung môi sử dụng 250 ml) thu được hợp chất AP-5 (153 mg)
Phân đoạn F2 (2,3 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel (200 gam, 60x3 cm) với hệ dung môi rủa giải hexan:axeton (9:1 , 6:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu được sáu phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F2.1 đến F2.6) Phân đoạn F2.6 (0,5 g) được tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 (50 gam, 60x3cm) được giải hấp với hệ dung môi CH3OH:H2O thu được hợp chất AP-1 (41 mg)
Phân đoạn F3 (2,7 g) được sắc ký cột silica gel (200 gam, 60×3,2 cm) được rửa giải bằng hệ dung môi hexan:axeton (9:1, 6:1, 4:1, 1:1, mỗi hệ dung
sử dụng 250ml) để thu được bốn phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F3.1 đến F3.4) Phân đoạn F3.2 (0,5 g) tiếp tục được sắc ký cột pha đảo RP -18 (100 gam, 60 x
3 cm) giải hấp bằng hệ dung môi CH3OH:H2O thu được hợp chất AP-2 (31
mg)
Phân đoạn F4 (4,7 g) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam,
60 x 5cm) được rửa giải với hệ dung môi CHCl3:CH3OH (20:1, 10:1, 6:1, 4:1, 2:1, mỗi hệ sử dụng 200 ml) thu được 5 phân đoạn (ký hiệu từ F4.1 đến F4.5) Phân đoạn F4.1 tiếp tục được sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 3 cm) rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (19:1, 16:1, mỗi hệ dung môi sử dụng
200 ml) thu được hợp chất AP-4 (43 mg) và AP-3 (21 mg)
Phân đoạn F5 (1,5 g) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam,
60 x 3cm) được rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1, 6:1, mỗi hệ
dung môi sử dụng 200 ml) thu được hợp chất AP-6 (13 mg).
Trang 86
Trang 92.4 N ứ ừ q x ừ (Khaya senegalensis)
4 M
Quả của cây xà cừ (Khaya senegalensis A Juss) được thu thập ở Nghệ An
vào tháng 1/2014 Mẫu nghiên cứu được định danh bởi PGS TS Trần Huy Thái (Viện Tài nguyên và Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam) Tiêu bản (DHV 2014) được lưu giữ tại khoa Sinh học-Trường Đại học Vinh
2.4.2 P
Quả sau khi sấy khô (4,0 kg) được xay nhỏ, được chiết ba lần với MeOH ở nhiệt độ phòng Dịch chiết MeOH được thu hồi dung môi ở áp suất thấp thu được cặn màu nâu đen (285,0 g) Cặn methanol được phân bố trong nước, sau
đó chiết lần lượt với hexane và ethyl acetate, thu được 55,0 gam cặn hexane và 95,0 gam cặn ethyl acetate
Cặn ethyl acetate được tiến hành sắc ký cột trên với hệ dung môi gradient hexane:acetone (100:0; 50:1; 39:1; 30:1; 20:1; 15:1; 9:1; 4:1; 2:1; 1:1) thu được 7 phân đoạn chính
n-Phân đoạn 3 được tiến hành sắc ký cột trên silica gel với hệ dung môi gradient hexane:acetone (20:1; 15:1; 9:1; 2:1) thu được 5 phân đoạn nhỏ Phân đoạn 3.2 được tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel rửa giải bằng hệ dung môi n-
hexane:acetone (20:1) thu được hợp chất KS2 (23 mg) Phân đoạn 3.3 được
tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane:acetone (9:1; 4:1) thu được hợp chất KS1 (15 mg) và hợp chất KS3 (29 mg)
Phân đoạn 4 được tiến hành sắc ký cột trên silica gel với hệ dung môi rửa
giải chloroform:methanol (9:1) thu được hợp chất KS4 (12.5 mg)
Phân đoạn 5 được tiến hành sắc ký cột trên silica gel với hệ dung môi gradient hexane:acetone (15:1; 9:1; 4:1; 2:1) thu được 7 phân đoạn nhỏ Phân đoạn 5.2 được rửa giải bằng hệ dung môi chloroform:methanol (20:1) trên sắc
kí cột, sau đó được tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel thu được hợp chất KS5 (53 mg) Phân đoạn 5.4 được rửa giải bằng hệ dung môi chloroform: methanol (15:1, 9:1), sau đó được làm tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel thu được hợp
chất KS6 (71,5 mg)
Trang 108
Trang 112.5 N ứ ừ q x (Melia azedarach)
5 T
Mẫu quả xoan (Melia azedarach) được thu hái vườn Quốc gia Pù Huống,
Nghệ An, Việt Nam tháng 08 năm 2016, Mẫu nghiên cứu được định danh bởi PGS TS Trần Huy Thái (Viện Tài nguyên và Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam) Tiêu bản (DHV 2016) được lưu giữ tại khoa Hóa học-Trường Đại học Vinh
5 C ế x , x ị
Mẫu thực vật thu thập và sấy khô ở nhiệt độ từ 400
-500C trong 48 giờ, sau khi sấy khô và xay nhỏ (5,0kg) ngâm với MeOH, với thời gian 8 ngày, sau
đó lọc và dịch lọc được cất giảm áp suất bằng thiết bị quay cất chân không thu được cao metanol (425g) Phân bố cao metanol trong nước, sau đó chiết lần lượt với các dung môi etyl axetat và butanol, quay cất chân không thu được
125 g cao etyl axetat và 67 g cao butanol
Cao etyl axetat được phân tách trên cột silicagel, với hệ dung môi rửa giải là cloroform: metanol (100:0, 40:1: 30:1; 20:1; 10:1: 4:1; 2:1) thu được 7 phân đoạn Phân đoạn 1 được phân tách lại bằng sắc ký cột với hệ dung môi
hexane: acetone (15:1) thu được chất hợp chất MA-6 (128 mg) Phân đoạn 3
được phân tách lại bằng sắc ký cột với hệ dung môi hexan: axeton (7:1) thu
được chất hợp chất MA-3 (28 mg) và hợp chất MA-5 (31 mg) Phân đoạn 5
được tiến hành sắc ký cột với silica gel với hệ dung môi rửa giải cloroform:
metanol (10:1) thu được chất MA-4 (51mg)
Cao butanol được phân tách trên cột silicagel, với hệ dung môi rửa giải là cloroform: metanol (30:1; 20:1; 10:1: 4:1; 2:1) thu được 5 phân đoạn Phân đoạn 2 được phân tách lại bằng sắc ký cột với hệ dung môi cloroform: metanol
(15:1) thu được chất hợp chất MA-1 (12) mg) và phân đoạn 3 được phân tách
lại bằng sắc ký cột với hệ dung môi cloroform: metanol (10:1) thu được chất
hợp chất MA-2 (21,5 mg) Phân đoạn 5 được phân tách tiếp với hệ dung môi cloroform: metanol (10:1) thu được chất hợp chất MA-7 (41mg)
Trang 1210
Trang 13Từ dịch chiết metanol của quả gội nước (Anphanamixis polystachya),
bằng các phương pháp sắc ký cột trên silica gel đã phân lập được 6 hợp chất và xác định các hợp chất này bằng các phương pháp phổ (Bảng 3.1)
B Các hợp chất được tách ra từ quả gội nước S
2 AP-2 Chisocheton compound E C31H46O4 31
3 AP-3 chisocheton compound G C33H48O5 21
Quả xà cừ (Khaya senegalensis) được ngâm chiết bằng dung môi
metanol Cất thu hồi dung môi dịch chiết thu được cao thô metanol Hòa tan cao metanol vào trong nước và chiết phân bố với dung môi cloroform thu được cao clorofom và dịch nước
Từ cao cloroform của quả xà cừ (Khaya senegalensis), bằng các phương
pháp sắc ký cột trên silica gel đã phân lập được 8 hợp chất và xác định các hợp chất này bằng các phương pháp phổ (Bảng 3.8)
B 8 Các hợp chất được tách ra từ quả xà cừ (Khaya senegalensis)
Trang 1412
Q x (Melia azedarach)
P
Quả xoan (Melia azedarach) được ngâm chiết bằng dung môi metanol, sau
đó lọc Dịch lọc thu được cất thu hồi dung môi thu được cao thô metanol tiếp tục được hòa tan trong nước và chiết phân bố với dung môi etyl axetat thu được cao etyl axetat
Từ cao etyl axetat của quả xoan (Melia azedarach), bằng các phương pháp
sắc ký cột trên silica gel đã phân lập được 8 hợp chất và xác định các hợp chất này bằng các phương pháp phổ (Bảng 3.15).Kết quả của quá trình nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.15
B 5 Các hợp chất được tách ra từ quả xoan (Melia azedarach)
Hợp chất MA-1 là chất bột màu trắng có tính quang hoạt và phổ
HR-ESI-MS của hợp chất MA-1 cho công thức phân tử C37H44O9 (m/z 655,2879,
[M+Na]+) Phổ UV cho hấp thụ cực đại tại 205, 218, 244, và 273 nm chứng tỏ
sự có mặt của vòng benzen liên hợp [99] Phổ 1
H-NMR của hợp chất MA-1
(bảng 3.16.) xuất hiện các tín hiệu singlet đặc trưng của 4 nhóm methyl [H
1.00 (6H, CH3-20, -22), 1,18 (3H, CH3-18), và 1,25 (3H, CH3-21)], 1 nhóm oxymethylene [H 3,13 (m) và 3,45 (d, J = 7,5 Hz)], và các tín hiệu của phần
vòng furan [H 6,16 (br s), 7,13 (br s), và 7,28 (br s)], tương ứng, chứng tỏ
rằng hợp chất MA-1 là tương tự như các hợp chất trichilinin [48] Ngoài ra,
còn có sự có mặt của các tín hiệu của các proton singlet thuộc nhóm acetyl [H
1,90 (3H) và 1,91 (3H)] và 1 mảnh benzoyl [H 7,43 (2H, t, 7,5), 7,56 (1H, t, 7,5), và 8,08 (2H, d, 7,5)] So sánh các dự kiện phổ ở trên với trichilinin E
[48], quan sát thấy sự khác biệt hợp chất MA-1 có nhiều hơn 1 nhóm acetyl Vị