Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài An xoa (Helicteres hirsuta) và Màng kiêng (Pterospermum truncatolobatum) thuộc họ Trôm (Sterculiaceae) tại Việt Nam có bố cục bao gồm: Mở đầu; Tổng quan; Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm; Kết quả và thảo luận; Kết luận; Danh mục các công trình công bố; Tài liệu tham khảo. Mời các bạn cùng tham khảo luận án.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI LÊ THỊ KHÁNH LINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LỒI AN XOA (HELICTERES HIRSUTA) VÀ MÀNG KIÊNG (PTEROSPERMUM TRUNCATOLOBATUM) THUỘC HỌ TRƠM (STERCULIACEAE) TẠI VIỆT NAM Chun ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 9.44.01.14 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. ĐẶNG NGỌC QUANG 2. PGS. TS. PHẠM HỮU ĐIỂN Phản biện 1: GS. TSKH Lưu Văn Bơi – Trường Đại học KHTN – ĐHQG Hà Nội Phản biện 2: PGS. TS. Vũ Đình Hồng – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Phản biện 3: PGS. TS. Vũ Quốc Trung – Trường ĐHSP Hà Nội Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội vào hồi … giờ … ngày … tháng… năm… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện Quốc Gia, Hà Nội GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Lý do chọn đề tài Sự phát triển xã hội ngày nay ln đi kèm với sự biến đổi của mơi trường sống của con người và các lồi sinh vật. Mơi trường ơ nhiễm dẫn đến các loại bệnh dịch nguy hiểm đến tính mạng con người như ung thư, AIDS, COVID19… vẫn chưa có thuốc điều trị hiệu nghiệm. Trong một cơng bố mới đây của Tổ chức Y tế thế giới, năm 2020 tồn cầu có 19,3 triệu người mắc ung thư, trong đó 9,96 triệu người chết vì ung thư. Theo dự đốn của các chun gia, con số này sẽ khơng dừng lại đó mà cịn gia tăng trong những năm tiếp theo. Chính vì vậy, các nhà khoa học khơng ngừng nghiên cứu nhằm tìm ra được các dược phẩm mới, có khả năng phịng và chữa bệnh cao hơn so với các loại thuốc đã sử dụng. Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa với đầy đủ các dạng địa hình, khí hậu, thổ nhưỡng… nên có hệ thực vật vơ cùng phong phú, đa dạng và độc đáo. Dưới tác động của con người cũng như tự nhiên, hệ thực vật ln ln bị biến đổi. Qua q trình thu thập, chọn lọc và thử nghiệm, nhân dân ta đã phát hiện ra các lồi thực vật họ Trơm (Sterculiaceae) có nhiều tác dụng sinh học q và đã được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền của dân tộc. Trong dân gian, tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh bằng cây An xoa (Helicteres hirsuta) thuộc chi Thâu kén họ Trơm cịn khá mới mẻ. Ở Bắc Kạn và Thái Nguyên, người dân đã dùng rễ, lá cây này làm thuốc chữa bệnh hen cho kết quả tốt. Ở Vân Nam (Trung Quốc), thân và lá cây được dùng trị đau bụng. Tại Việt Nam, cây An xoa được tìm thấy tỉnh miền núi Lâm Đồng, Hà Giang… Cây Màng kiêng (Pterospermum truncatolobatum) là một trong số ít các lồi thuộc chi Pterospermum họ Trơm (Sterculiaceae) được tìm thấy tại Việt Nam. Cho đến nay, trên thế giới cũng như tại Việt Nam, cây Màng kiêng dù đã được phát hiện nhưng chỉ được nhắc đến trong các cơng trình nghiên cứu về phân loại thực vật. Vì những lý do trên đây, trong khn khổ Luận án tiến sĩ hóa học này, chúng tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hai lồi An xoa (Helicteres hirsuta) và Màng kiêng (Pterospermum truncatolobatum) thuộc họ Trơm (Sterculiaceae) tại Việt Nam” Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là 2 lồi thuộc họ Trơm (Sterculiaceae) tại Việt Nam: cây An xoa (Helicteres hirsuta), cây Màng kiêng(Pterospermum truncatolobatum) Những đóng góp mới của luận án Luận án đã đóng góp những hiểu biết mới về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai lồi thực vật họ Trơm được tìm thấy ở Việt Nam là cây An xoa (Helicteres hirsuta), cây Màng kiêng(Pterospermum truncatolobatum) Từ các cặn chiết của thân lá và rễ cây An xoa,phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 14 hợp chất, trong đó có 9 hợp chất từ rễ (L1÷L9), 5 hợp chất từ thân lá (L10L14) cây An xoa. Trong đó, hợp chất 3βbenzoylbetulinic acid (L3) là chất mới Từ cặn chiết của thân lá cây Màng Kiêng, lần đầu tiên phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 8 hợp chất. Trong đó, cấu trúc của M4 và M7 cịn được xác định bằng Xray đơn tinh thể Đã tiến hành thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính gây độc tế bào của một số cặn chiết. Qua đó phát hiện một số cặn chiết có tiềm năng sử dụng để bảo vệ và nâng cao sức khỏe con người: cặn chiết EtOAc ở thân lá và rễ cây An xoa có hoạt tính chống oxi hóa; cặn chiết EtOAc ở rễ cây An xoa và cây Màng kiêng cho hoạt tính ức chế tế bào ung thư; cặn chiết butanol ở thân lá và rễ cây An xoa cho hoạt tính kháng khuẩn Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thư SKLu1, HepG2, Hela, SKMel2, AGS của 13 chất phân lập được cho thấy 6 chất từ cây An xoa (L1, L5, L9, L10, L11, L14) và hai hợp chất từ cây Màng kiêng (M3, M4) có hoạt tính. Các hợp chất cịn lại khơng có hoạt tính Kết quả mơ phỏng tương tác đã chỉ ra trong số các hợp chất thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư, có hai hợp chất M3 và L5 thể hiện ái lực liên kết mạnh với wMUS81 kèm theo là các tương tác tạo thành với những amino axit quan trọng trong vùng hoạt động của đích protein này. Qua đó có thể nhận định bước đầu rằng hai hoạt chất này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư thơng qua cơ chế bất hoạt đích sinh học là protein wMUS81 Bố cục của luận án Luận án bao gồm 130 trang với 22 bảng số liệu, 62 hình, 6 sơ đồ. Kết cấu của luận án gồm: Mở đầu (2 trang), Tổng quan (25 trang), Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm (19 trang), Kết quả và thảo luận (65 trang), Kết luận (2 trang), Danh mục các cơng trình cơng bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (10 trang) TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về thực vật họ Trơm Họ Trơm là họ thực vật có hoa bao gồm 68 chi, trong đó có chi Helicteres, Pterospermum, với khoảng 1000 lồi phân bố ở vùng nhiệt đới tới ơn đới. Ở Việt Nam, GS.Võ Văn Chi đã ghi nhận họ Trơm có 15 chi với 34 lồi có thể làm thuốc 1.2. Thực vật chi Helicteres họ Trơm 1.2.1. Giới thiệu chung thực vật chi Helicteres họ Trơm Chi Thâu kén (Helicteres) họ Trơm có khoảng 60 lồi, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới. Theo GS Võ Văn Chi và Đặng Văn Sơn, tại Việt Nam hiện tím thấy có 7 lồi thuộc chi Thâu kén. 1.2.2. Thành phần hóa học các lồi thuộc chi Helicteres họ Trơm Dựa theo các loại nhóm chất, chia các hợp chất tách được chi này thành 5 loại: các diterpenoid, các flavonoid, các neolignan, các quinine và các triterpenoid 1.2.3. Ứng dụng của chi Helicteres Trong một cơng bố khoa học gần đây (2016) Kejuan Li và các cộng sự [48] cho thấy cao chiết nước từ rễ cây Dó hẹp Helicteres angustifolia có khả năng ức chế phát triển tế bào ung thư xương U2OS ở mức khá (IC50 = 62,13 3,94%). Trong khi đó, cao chiết chloroform từ quả Dó trĩn Helicteres isora lại có khả năng kháng tế bào ung thư vú MCF7 khá mạnh với giá trị IC50 = 875 35.3 g/ml. 1.2.4. Cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour) Cây An xoa có tên khoa học là Helicteres hirsuta Lour., cịn gọi là Dó lơng. Theo y học cổ truyền, chức năng chính của cây An xoa là hỗ trợ giải độc gan, giúp gan hồi phục chức năng, kèm theo kích thích tuần hồn, tiêu hóa tốt Khi nghiên cứu về cây An xoa (Helicteres hirsuta)được thu hái tại miền tây Java, Indonesia, nhóm nghiên cứu của trường Đại học Ohio (Hoa Kỳ) đã phân lập lignan từ vỏ thân (+/)pinoresinol, (+/)medioresinol, (+/) syringaresinol, ()boehmenan, ()boehmenan H alcohol (+/)trans dihydrodiconiferyl. Trong đó hoạt chất (+/)pinoresinol, có hoạt tính gây độc tế bào ung thư khá mạnh với các dịng tế bào ung thư phổi Lu1, tế bào ung thư tiền liệt tuyến phụ thuộc hormone LNCaP, tế bào ung thư vú MCF7 và tế bào ung thư màng trong tĩnh mạch rốn HUVEC với giá trị ED50 lần lượt là 0,8, 0,5, 1,7 và 1,1 g/mL (đối chứng dương là Paclitaxel, 0,0010,008 g/mL) 1.3. Thực vật chi Pterospermum họ Trơm 1.3.1. Giới thiệu chung thực vật chi Pterospermum họ Trơm Pterospermum là một chi thực vật có hoa, họ Trơm. Cho đến nay, chỉ có một số lồi trong số 74 lồi được tìm thấy thuộc chi này được đặt tên khoa học trong danh sách thực vật. Ở Việt Nam có 22 lồi phân bố khắp từ Bắc vào Nam. 1.3.2. Thành phần hóa học các lồi thuộc chi Pterospermum họ Trơm Cho đến nay, khơng có nhiều các cơng trình cơng bố về thành phần hóa học của các lồi trong chi Pterospermum. Năm 2011, P. Dixit và cộng sự đã phân lập được 17 hợp chất từ hoa của cây Pterospermum acerifolium trong đó có 3 hợp chất mới gồm 2 hợp chất flavonoid và 1 lactone đó là pterospermin A, pterospermin B và pterospermin C. Khi nghiên cứu thành phần hóa học có rễ của loàiPterospermum heterophyllum, Shuai Li và cộng sự đã phân lập được hai triterpenoid mới là taraxer14 ene1α,3βdiol 3βhydroxytaraxer14ene1one Ngoài cịn có 5hydroxy2 methoxy1,4naphthoquinone,5,7dihydroxy6,8dimethylchromone với 8 triterpene khác. Từ cành và lá của lồi Pterospermum yunnanense Hsue, Haoliang Li và cộng sự đã phân lập được 1 naphthol mới là 7hydroxy6methyl1naphthoic acid methyl ester. Ngồi ra, nhóm nghiên cứu cịn tách được 8 hợp chất đã biết khác. Tất cả các hợp chất được phân lập lần đầu tiên từ P. yunnanense Hsue 1.3.3. Ứng dụng của chi Pterospermum Tại Ấn Độ, Pterospermum acerifoliumthường được gọi là Kanakchampa, theo truyền thống được sử dụng để cầm máu, viêm, đau tai, đau dạ dày, loét máu, thủy đậu, bệnh lậu, bệnh bạch cầu, bệnh phong, thuốc chống tăng huyết áp và trị giun. Hoa của P. acerifolium được người dân ở vùng Chota Nagpur thuộc Jharkhand (Ấn Độ) sử dụng làm thuốc. Ở Việt Nam, rễ cây Pterospermum heterophyllum được dùng để khử phong, trừ thấp, dã cơ, hoạt huyết và thông lạc 1.3.4. Cây Màng kiêng (Pterospermum truncatolobatum) Cây Màng kiêng (Pterospermum truncatolobatum) hay cịn gọi là Lịng mang (lá) cụt, hay Mang cụt. Điều kiện thích hợp nhất cho sự phát triển của cây Màng kiêng là khí hậu nóng ẩm theo mùa và được tiếp xúc với ánh sáng mặt trời đầy đủ. Trên thế giới cũng như tại Việt Nam, dù đã được phát hiện và nghiên cứu thực vật chưa có nghiên cứu thành phần hóa học cây Pterospermum truncatolobatum Gagnep (Màng kiêng). Ở Việt Nam, cây này được tìm thấy tại các tỉnh miền núi như Lạng Sơn, Hịa Bình, Lâm Đồng 1.4. Phương pháp mơ phỏng docking phân tử Docking là một trong những phương pháp phổ biến nhất dùng trong q trình thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc vì có khả năng dự đốn với độ chính xác khá cao sự hình thành liên kết của cấu tử với thụ thể trong túi liên kết. Ra đời từ những năm 1980, docking phân tử đã trở thành một cơng cụ thiết yếu trong nghiên cứu và phát triển thuốc. Q trình docking được thực hiện thơng qua ba bước: chuẩn bị cấu tử, chuẩn bị protein, mơ phỏng docking Methyl methanesulfonate ultravioletsensitive gene clone 1 (MUS81) là một thành viên của họ Xpf của endonuclease DNA có vai trị thiết yếu trong việc hồn thành q trình tái tổ hợp tương đồng. Việc ức chế protein MUS81 có tác dụng cải thiện hoạt lực loại thuốc chống ung thư ví dụ: 5fluorouracil, camptothecin, olaparib và cisplatin thơng qua nhiều cơ chế khác nhau trong các tế bào ung thư. Dựa trên những kết quả tích cực đã ghi nhận trong nghiên cứu, MUS81 hiện được các nhà khoa học xác định là một mục tiêu mới tiềm năng trong phát triển thuốc điều trị chống ung thư trong tương lai PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu thập mẫu: 2.1.2. Phương pháp xử lý và tạo cao chiết Sử dụng các phương pháp sắc ký như: Sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC), sắc ký lỏng điều chế (prep.HPLC) và các phương pháp kết tinh để chiết tách các cao chiết và phân lập các hợp chất 2.1.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất Cấu trúc các hợp chất được xác định nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại: phổ khối lượng (ESIMS,FTICRMS). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiểu (1HNMR, 13CNMR, DEPT), hai chiều(HMBC, HSQC, ROESY). Cấu trúc lập thể của các hợp chất cịn được xác định bằng phổ XRay đơn tinh thể 2.1.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.1.4.1. Hoạt tính chống oxy hóa: Hoạt tính chống oxy hóa được xác định theo phương pháp DPPH [20] 2.1.4.2. Hoạt tính kháng sinh: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được xác định dựa trên phương pháp của Hadacek F. [8]. 2.1.4.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được xác định theo phương pháp của Scudiero D. A. và cộng sự [71]. 2.1.5. Phương pháp Docking Phương pháp này được tiến hành viện Hóa học các hợp chất thiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam 2.1.6. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất Thiết bị, dụng cụ Hóa chất: methanol, nhexane, dichlorofom, ethyl acetate, butanol, nước cất 2.2. Thực nghiệm 2.2.1. Cây An xoa 2.2.1.1. Xử lý mẫu thực vật và ngâm chiếttạo cao chiết 2.2.1.2. Xác định thành phần hóa học cây An xoa Sơ đồ 23. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ rễ cây An xoa (chất L1L9) Phơi, sấy khơ, Mẫu tươ i nghiền nhỏ Rễ An Xoa (4,5 kg) Ngâm chiết với methanol (7ngày) Cao tổng (620 g) Hòa tan trong 600ml nước Chiết lần lượt với nhexane, dichloromethane, ethyl acetate, butanol Cao nhexane RE (53,4 g) 1. CC, H:E = 10:1 2. CC, H:A=12:1 RH3.1 (45mg) HPLC, H: E =1:1 L1(5mg) Cao dichloromethane RD (37,18g) Cao ethyl acetate RE (28,01g) Cao butanol RB (123,32g) Nước CC, H:A=10:1 RD4 (57mg) L5 (5mg) CC, H:A=10:1 L9 (4mg) L2 (4mg) 10 H NMR H (ppm), J (Hz) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 3,19, (dd, J=11,0; 4,0 Hz) 0,77 (m) 2,04 (dt, J=13,0; 3,0Hz) 5,54 (dd, J=8,0; 3,0 Hz) 1,92 (dd, J=14,5; 2,0Hz) 1,70 (m) 0,93 (s) 0,91 (s) 13 C NMR C (ppm) 37,76 27,17 79,08 38,99 55,4 18,81 35,13 38,77 48,78 37,58 17,5 35,79 37,73 158,12 116,88 36,69 38,02 49,3 41,35 28,8 33,72 33,11 28,0 15,45 67 H NMR H (ppm), J(Hz) 3,19 5,52 0,92 0,90 13 C NMR C (ppm) 37,6 27,0 79,0 39,2 55,2 18,6 35,0 38,6 48,5 37,5 17,2 35,6 37,6 158,0 116,7 36,6 38,2 49,0 41,2 29,6 33,6 33,0 28,2 15,4 25 26 27 28 29 30 0,98 (s) 1,09 (s) 0,82 (s) 0,80 (s) 0,91 (s) 0,95 (s) 15,42 29,83 25,90 29,92 33,35 21,32 0,97 1,08 0,82 0,80 0,90 0,94 15,2 29,7 25,5 29,7 33,2 21,2 Tám hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc từ các cao chiết của cây Màng kiêng HO O 11 20 18 16 14 12 19 17 15 Icosanoic acid (M2) βsitosterol (M1) 68 10 13 Bentulonic acid (M3) Simiarenol (M4) Stigmasterol (M5) βtaraxerol (M7) Stigmasterol glucoside(M6) 2Methoxy benzoic acid(M8) 69 3.2.2 Hoạt tính sinh học các cao chiết từ cây Màng kiêng Bảng 320. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào các cao chiết từ cây Màng kiêng STT Tên mẫu Giá trị IC50 (µg/ml) Cao nHexane Cao CH2Cl2 54,09 ± 1,52 Cao EtOAc 7,6±0,41 70 14,57±1,40 Cao butanol Cao H2O Ellipticin e 182,51±5,68 >256 0,21±0,05 Kết quả thu được cho thấy cao chiết nhexane, CH2Cl2 và EtOAc có hoạt tính khả quan. Trong đó cao EtOAc có hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB mạnh nhất (IC50 7,6 ± 0,41μg/ml). Cao butanol khơng thể hiện hoạt tính 3.2.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư các chất sạch Bảng 3. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của M3, M4, M7 IC50 ( Hợp chất M3 (Bentulonic acid) ) HepG2 Lu1 KB MCF7 44,78 ± 3,68 147,91 ± 8,04 35,24 ± 2,09 82,53 ± 3,35 71 M4 (Simiarenol) M7 (βTaraxerol) 90,31 ± 6,29 113,54 ± 7,16 >64 109,98 ± 8,45 >64 >64 >64 >64 Ellipticin 1,46 ± 0,12 1,30 ± 0,12 0,98 ± 0,08 2,07 ± 0,12 Kết quả cho thấy hợp chất M3 thể hiện hoạt tính khá với 3 dịng tế bào ung thư HepG2, KB, MCF7 (IC50