Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài An xoa (Helicteres hirsuta) và Màng kiêng (Pterospermum truncatolobatum) thuộc họ

Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài An xoa (Helicteres hirsuta) và Màng kiêng (Pterospermum truncatolobatum) thuộc họ Trôm (Sterculiaceae) tại Việt Nam có bố cục bao gồm: Mở đầu; Tổng quan; Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm; Kết quả và thảo luận; Kết luận; Danh mục các công trình công bố; Tài liệu tham khảo. Mời các bạn cùng tham khảo luận án.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI LÊ THỊ KHÁNH LINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH  SINH HỌC CỦA HAI LỒI AN XOA (HELICTERES   HIRSUTA) VÀ MÀNG KIÊNG (PTEROSPERMUM   TRUNCATOLOBATUM) THUỘC HỌ TRƠM  (STERCULIACEAE) TẠI VIỆT NAM Chun ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 9.44.01.14 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. ĐẶNG NGỌC QUANG 2. PGS. TS. PHẠM HỮU ĐIỂN Phản biện 1: GS. TSKH Lưu Văn Bơi – Trường Đại học KHTN – ĐHQG Hà   Nội Phản biện 2: PGS. TS. Vũ Đình Hồng – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Phản biện 3: PGS. TS. Vũ Quốc Trung – Trường ĐHSP Hà Nội Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường  họp tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội          vào hồi … giờ … ngày … tháng… năm… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện Quốc Gia, Hà Nội GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Lý do chọn đề tài Sự  phát triển xã hội ngày nay ln đi kèm với sự  biến đổi của mơi trường   sống của con người và các lồi sinh vật. Mơi trường ơ nhiễm dẫn đến các loại   bệnh dịch nguy hiểm đến tính mạng con người như ung thư, AIDS, COVID­19…   vẫn chưa có thuốc điều trị hiệu nghiệm. Trong một cơng bố mới đây của Tổ chức  Y tế  thế  giới, năm 2020 tồn cầu có 19,3 triệu người mắc ung thư, trong đó 9,96  triệu người chết vì ung thư. Theo dự đốn của các chun gia, con số này sẽ khơng  dừng lại   đó mà cịn gia tăng trong những năm tiếp theo. Chính vì vậy, các nhà   khoa học khơng ngừng nghiên cứu nhằm tìm ra được các dược phẩm mới, có khả  năng phịng và chữa bệnh cao hơn so với các loại thuốc đã sử dụng.  Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa với đầy đủ  các   dạng địa hình, khí hậu, thổ  nhưỡng… nên có hệ  thực vật vơ cùng phong phú, đa  dạng và độc đáo. Dưới tác động của con người cũng như  tự  nhiên, hệ  thực vật  ln ln bị biến đổi. Qua q trình thu thập, chọn lọc và thử nghiệm, nhân dân ta  đã phát hiện ra các lồi thực vật họ  Trơm (Sterculiaceae) có nhiều tác dụng sinh  học q và đã được sử  dụng trong các bài thuốc cổ truyền của dân tộc. Trong dân   gian, tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh bằng cây An xoa (Helicteres hirsuta) thuộc chi  Thâu kén họ  Trơm cịn khá mới mẻ.  Ở  Bắc Kạn và Thái Nguyên,  người dân đã   dùng rễ, lá cây này làm thuốc chữa bệnh hen cho kết quả tốt.  Ở Vân Nam (Trung   Quốc), thân và lá cây được dùng trị đau bụng. Tại Việt Nam, cây An xoa được tìm   thấy       tỉnh   miền   núi     Lâm   Đồng,   Hà   Giang…   Cây   Màng   kiêng  (Pterospermum truncatolobatum) là một trong số ít các lồi thuộc chi Pterospermum  họ  Trơm (Sterculiaceae) được tìm thấy tại Việt Nam. Cho đến nay, trên thế  giới   cũng như  tại Việt Nam, cây Màng kiêng dù đã được phát hiện nhưng chỉ  được  nhắc đến trong các cơng trình nghiên cứu về  phân loại  thực vật. Vì những lý do  trên đây, trong khn khổ  Luận án tiến sĩ hóa học này, chúng tơi chọn đề  tài:  “Nghiên   cứu   thành   phần   hóa   học     hoạt   tính   sinh   học     hai   lồi   An   xoa   (Helicteres hirsuta) và Màng kiêng (Pterospermum truncatolobatum) thuộc họ Trơm   (Sterculiaceae) tại Việt Nam” Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là 2 lồi thuộc họ  Trơm (Sterculiaceae) tại  Việt   Nam:   cây  An   xoa   (Helicteres   hirsuta),  cây   Màng   kiêng(Pterospermum   truncatolobatum) Những đóng góp mới của luận án Luận án đã đóng góp những hiểu biết mới về  thành phần hóa học và hoạt  tính sinh học của hai lồi thực vật họ Trơm được tìm thấy ở  Việt Nam là cây An  xoa (Helicteres hirsuta), cây Màng kiêng(Pterospermum truncatolobatum) Từ các cặn chiết của thân lá và rễ cây An xoa,phân lập và xác định cấu trúc  hóa học của  14 hợp chất, trong đó có 9 hợp chất từ  rễ  (L1÷L9), 5 hợp chất từ  thân lá (L10­L14) cây An xoa. Trong đó, hợp chất 3β­benzoylbetulinic acid (L3) là  chất mới Từ cặn chiết của thân lá cây Màng Kiêng, lần đầu tiên phân lập và xác định  cấu trúc hóa học của 8 hợp chất. Trong đó, cấu trúc của M4 và M7 cịn được xác  định bằng X­ray đơn tinh thể Đã tiến hành thử  nghiệm  đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định,  hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính gây độc tế bào của một số cặn chiết. Qua đó  phát hiện một số cặn chiết có tiềm năng sử dụng để bảo vệ và nâng cao sức khỏe  con người: cặn chiết EtOAc ở thân lá và rễ cây An xoa có hoạt tính chống oxi hóa;  cặn chiết EtOAc  ở rễ cây An xoa và cây Màng kiêng cho hoạt tính  ức chế tế bào  ung thư; cặn chiết butanol ở thân lá và rễ cây An xoa cho hoạt tính kháng khuẩn Kết quả  thử  nghiệm hoạt tính gây độc các dịng tế  bào ung thư  SK­Lu­1,  Hep­G2, Hela, SK­Mel­2, AGS của 13 chất phân lập được cho thấy 6 chất từ cây   An xoa (L1, L5, L9, L10, L11, L14) và hai hợp chất từ cây Màng kiêng (M3, M4)  có hoạt tính. Các hợp chất cịn lại khơng có hoạt tính Kết quả  mơ phỏng tương tác đã chỉ  ra trong số  các hợp chất thể  hiện hoạt  tính kháng tế bào ung thư, có hai hợp chất M3 và L5 thể hiện ái lực liên kết mạnh  với wMUS81 kèm theo là các tương tác tạo thành với những amino axit quan trọng   trong vùng hoạt động của đích protein này. Qua đó có thể  nhận định bước đầu  rằng hai hoạt chất này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư thơng qua cơ chế  bất hoạt đích sinh học là protein wMUS81 Bố cục của luận án Luận án bao gồm 130 trang với 22 bảng số liệu, 62 hình, 6 sơ  đồ. Kết cấu  của luận án gồm: Mở  đầu (2 trang), Tổng quan (25 trang), Phương pháp nghiên  cứu và thực nghiệm (19 trang), Kết quả và thảo luận (65 trang), Kết luận (2 trang),  Danh mục các cơng trình cơng bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (10 trang) TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về thực vật họ Trơm Họ  Trơm là họ  thực vật có hoa bao gồm 68 chi, trong đó có chi  Helicteres,   Pterospermum, với khoảng 1000 lồi phân bố ở vùng nhiệt đới tới ơn đới. Ở Việt Nam,  GS.Võ Văn Chi đã ghi nhận họ Trơm có 15 chi với 34 lồi có thể làm thuốc 1.2. Thực vật chi Helicteres họ Trơm 1.2.1. Giới thiệu chung thực vật chi Helicteres họ Trơm Chi Thâu kén (Helicteres) họ  Trơm có khoảng 60 lồi, phân bố  chủ  yếu  ở  vùng nhiệt đới. Theo GS Võ Văn Chi và Đặng Văn Sơn, tại Việt Nam hiện tím  thấy có 7 lồi thuộc chi Thâu kén.  1.2.2. Thành phần hóa học các lồi thuộc chi Helicteres họ Trơm Dựa theo các loại nhóm chất, chia các hợp chất tách được chi này thành 5  loại: các diterpenoid, các flavonoid, các neolignan, các quinine và các triterpenoid 1.2.3. Ứng dụng của chi Helicteres Trong một cơng bố khoa học gần đây  (2016) Kejuan Li và các cộng sự [48] cho   thấy cao chiết nước từ rễ cây Dó hẹp Helicteres angustifolia có khả năng ức chế phát  triển tế bào ung thư xương U2OS ở mức khá (IC50 = 62,13   3,94%). Trong khi đó,  cao chiết chloroform từ quả Dó trĩn Helicteres isora lại có khả năng kháng tế bào ung  thư vú MCF­7 khá mạnh với giá trị IC50 = 875   35.3  g/ml.  1.2.4. Cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour) Cây An xoa có tên khoa học là Helicteres hirsuta Lour., cịn gọi là Dó lơng.  Theo y học cổ truyền, chức năng chính của cây An xoa là hỗ trợ giải độc gan, giúp  gan hồi phục chức năng, kèm theo kích thích tuần hồn, tiêu hóa tốt Khi nghiên cứu về  cây An xoa (Helicteres hirsuta)được thu hái tại miền tây  Java, Indonesia, nhóm nghiên cứu của trường Đại học Ohio (Hoa Kỳ) đã phân lập       lignan   từ   vỏ   thân         (+/­)­pinoresinol,   (+/­)­medioresinol,   (+/­)­ syringaresinol,   (­)­boehmenan,   (­)­boehmenan   H     alcohol   (+/­)­trans­ dihydrodiconiferyl. Trong đó hoạt chất (+/­)­pinoresinol, có hoạt tính gây độc tế bào  ung thư  khá mạnh với các dịng tế  bào ung thư  phổi Lu1, tế  bào ung thư  tiền liệt   tuyến phụ thuộc hormone LNCaP, tế bào ung thư vú MCF­7 và tế bào ung thư màng   trong tĩnh mạch rốn HUVEC với giá trị ED50 lần lượt là 0,8, 0,5, 1,7 và 1,1  g/mL (đối  chứng dương là Paclitaxel, 0,001­0,008  g/mL) 1.3. Thực vật chi Pterospermum họ Trơm 1.3.1. Giới thiệu chung thực vật chi Pterospermum họ Trơm Pterospermum là một chi thực vật có hoa, họ Trơm. Cho đến nay, chỉ có một  số  lồi trong số  74 lồi được tìm thấy thuộc chi này được đặt tên khoa học trong  danh sách thực vật. Ở Việt Nam có 22 lồi phân bố khắp từ Bắc vào Nam.  1.3.2. Thành phần hóa học các lồi thuộc chi Pterospermum họ Trơm Cho đến nay, khơng có nhiều các cơng trình cơng bố về thành phần hóa học  của các lồi trong chi Pterospermum.  Năm 2011, P. Dixit và cộng sự đã phân lập được 17 hợp chất từ hoa của cây  Pterospermum acerifolium trong đó có 3 hợp chất mới gồm 2 hợp chất flavonoid và   1 lactone đó là pterospermin A, pterospermin B và pterospermin C.  Khi   nghiên   cứu  thành   phần   hóa   học   có     rễ   của  loàiPterospermum   heterophyllum, Shuai Li và cộng sự đã phân lập được hai triterpenoid mới là taraxer­14­ ene­1α,3β­diol     3β­hydroxytaraxer­14­ene­1­one  Ngoài     cịn   có   5­hydroxy­2­ methoxy­1,4­naphthoquinone,5,7­dihydroxy­6,8­dimethylchromone    với     8  triterpene khác.  Từ cành và lá của lồi Pterospermum yunnanense Hsue, Haoliang Li và cộng  sự đã phân lập được 1 naphthol mới là 7­hydroxy­6­methyl­1­naphthoic acid methyl  ester. Ngồi ra, nhóm nghiên cứu cịn tách được 8 hợp chất đã biết khác. Tất cả các  hợp chất được phân lập lần đầu tiên từ P. yunnanense Hsue 1.3.3. Ứng dụng của chi Pterospermum Tại  Ấn Độ,  Pterospermum acerifoliumthường được gọi là Kanakchampa, theo  truyền thống được sử dụng để cầm máu, viêm, đau tai, đau dạ dày, loét máu, thủy đậu,  bệnh lậu, bệnh bạch cầu, bệnh phong, thuốc chống tăng huyết áp và trị giun. Hoa của  P. acerifolium được người dân ở vùng Chota Nagpur thuộc Jharkhand (Ấn Độ) sử dụng  làm thuốc.  Ở Việt Nam, rễ cây Pterospermum heterophyllum được dùng để khử phong,  trừ thấp, dã cơ, hoạt huyết và thông lạc 1.3.4. Cây Màng kiêng (Pterospermum truncatolobatum) Cây Màng kiêng (Pterospermum truncatolobatum) hay cịn gọi là Lịng mang  (lá) cụt, hay Mang cụt. Điều kiện thích hợp nhất cho sự  phát triển của cây Màng  kiêng là khí hậu nóng ẩm theo mùa và được tiếp xúc với ánh sáng mặt trời đầy đủ.  Trên thế  giới cũng như  tại Việt Nam, dù đã được phát hiện và nghiên cứu     thực   vật     chưa   có   nghiên   cứu       thành   phần   hóa   học   cây  Pterospermum truncatolobatum Gagnep (Màng kiêng).  Ở  Việt Nam, cây này được  tìm thấy tại các tỉnh miền núi như Lạng Sơn, Hịa Bình, Lâm Đồng 1.4. Phương pháp mơ phỏng docking phân tử Docking là một trong những phương pháp phổ  biến nhất dùng trong q   trình thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc vì có khả năng dự đốn với độ chính xác khá  cao sự  hình thành liên kết của cấu tử  với thụ  thể  trong túi liên kết. Ra đời từ  những năm 1980, docking phân tử đã trở thành một cơng cụ thiết yếu trong nghiên   cứu và phát triển thuốc. Q trình docking được thực hiện thơng qua ba bước:   chuẩn bị cấu tử, chuẩn bị protein, mơ phỏng docking Methyl methanesulfonate ultraviolet­sensitive gene clone 1 (MUS81) là một  thành viên của họ Xpf của endonuclease DNA có vai trị thiết yếu trong việc hồn  thành q trình tái tổ hợp tương đồng. Việc ức chế protein MUS81 có tác dụng cải   thiện   hoạt   lực       loại   thuốc   chống   ung   thư   ví   dụ:   5­fluorouracil,   camptothecin, olaparib và cisplatin thơng qua nhiều cơ  chế  khác nhau trong các tế  bào  ung thư.  Dựa  trên những  kết quả  tích  cực  đã ghi  nhận  trong  nghiên  cứu,  MUS81 hiện được các nhà khoa học xác định là một mục tiêu mới tiềm năng trong   phát triển thuốc điều trị chống ung thư trong tương lai PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu thập mẫu:  2.1.2. Phương pháp xử lý và tạo cao chiết Sử  dụng các phương pháp sắc ký như: Sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột  thường (CC), sắc ký lỏng điều chế (prep.HPLC) và các phương pháp kết tinh để chiết  tách các cao chiết và phân lập các hợp chất 2.1.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất Cấu trúc các hợp chất được xác định nhờ  sự  kết hợp các phương pháp phổ  hiện đại: phổ khối lượng (ESI­MS,FT­ICR­MS). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một  chiểu (1H­NMR,  13C­NMR, DEPT), hai chiều(HMBC, HSQC, ROESY). Cấu trúc  lập thể của các hợp chất cịn được xác định bằng phổ X­Ray đơn tinh thể 2.1.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.1.4.1. Hoạt tính chống oxy hóa:  Hoạt tính chống oxy hóa được xác định theo  phương pháp DPPH [20] 2.1.4.2. Hoạt tính kháng sinh:  Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được xác định  dựa trên phương pháp của Hadacek F. [8].   2.1.4.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được  xác định theo phương pháp của Scudiero D. A. và cộng sự [71].   2.1.5. Phương pháp Docking Phương pháp này được tiến hành viện Hóa học các hợp chất thiên,   Viện  Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam 2.1.6. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ­ Thiết bị, dụng cụ ­ Hóa chất: methanol, n­hexane, dichlorofom, ethyl acetate, butanol, nước cất 2.2. Thực nghiệm 2.2.1. Cây An xoa 2.2.1.1. Xử lý mẫu thực vật và ngâm chiếttạo cao chiết 2.2.1.2. Xác định thành phần hóa học cây An xoa Sơ đồ 23. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ rễ cây An xoa (chất L1­L9) Phơi, sấy khơ,  Mẫu tươ  i   nghiền nhỏ  Rễ An Xoa (4,5 kg)  Ngâm chiết với methanol (7ngày)  Cao tổng (620 g)  ­ Hòa tan trong 600ml nước  ­ Chiết lần lượt với n­hexane, dichloromethane, ethyl acetate, butanol  Cao n­hexane  RE  (53,4 g)  1. CC, H:E = 10:1  2. CC, H:A=12:1    RH3.1 (45mg)     HPLC, H: E =1:1     L1(5mg)  Cao dichloromethane   RD  (37,18g)  Cao ethyl acetate  RE   (28,01g)    Cao butanol  RB   (123,32g)   Nước   CC, H:A=10:1  RD4 (57mg)     L5 (5mg)   CC, H:A=10:1  L9 (4mg)  L2 (4mg)    10 H NMR H (ppm), J (Hz) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 3,19, (dd, J=11,0; 4,0 Hz) 0,77 (m) 2,04 (dt, J=13,0; 3,0Hz) 5,54 (dd, J=8,0; 3,0 Hz) 1,92 (dd, J=14,5; 2,0Hz) 1,70 (m) 0,93 (s) 0,91 (s) 13 C NMR C (ppm) 37,76 27,17 79,08 38,99 55,4 18,81 35,13 38,77 48,78 37,58 17,5 35,79 37,73 158,12 116,88 36,69 38,02 49,3 41,35 28,8 33,72 33,11 28,0 15,45 67 H NMR H (ppm), J(Hz) 3,19 5,52 0,92 0,90 13 C NMR C (ppm) 37,6 27,0 79,0 39,2 55,2 18,6 35,0 38,6 48,5 37,5 17,2 35,6 37,6 158,0 116,7 36,6 38,2 49,0 41,2 29,6 33,6 33,0 28,2 15,4 25 26 27 28 29 30 0,98 (s) 1,09 (s) 0,82 (s) 0,80 (s) 0,91 (s) 0,95 (s) 15,42 29,83 25,90 29,92 33,35 21,32 0,97 1,08 0,82 0,80 0,90 0,94 15,2 29,7 25,5 29,7 33,2 21,2 Tám hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc từ các cao chiết của cây Màng kiêng HO O 11 20 18 16 14 12 19 17 15 Icosanoic acid (M2) β­sitosterol (M1) 68 10 13 Bentulonic acid (M3) Simiarenol (M4) Stigmasterol (M5) β­taraxerol (M7) Stigmasterol glucoside(M6) 2­Methoxy benzoic acid(M8) 69 3.2.2 Hoạt tính sinh học các cao chiết từ cây Màng kiêng Bảng 3­20. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào các cao chiết từ cây Màng kiêng STT Tên mẫu Giá trị IC50  (µg/ml) Cao n­Hexane Cao CH2Cl2 54,09 ± 1,52 Cao EtOAc 7,6±0,41 70 14,57±1,40 Cao butanol Cao H2O Ellipticin e 182,51±5,68 >256 0,21±0,05 Kết quả thu được cho thấy cao chiết  n­hexane, CH2Cl2 và EtOAc có hoạt tính khả quan. Trong đó cao EtOAc có hoạt   tính gây độc tế bào ung thư KB mạnh nhất (IC50 7,6 ± 0,41μg/ml). Cao butanol khơng thể hiện hoạt tính 3.2.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư các chất sạch Bảng 3. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của M3, M4, M7 IC50 ( Hợp chất M3 (Bentulonic  acid) ) Hep­G2 Lu­1 KB MCF7 44,78 ± 3,68 147,91 ±  8,04 35,24 ± 2,09 82,53 ± 3,35 71 M4 (Simiarenol) M7 (β­Taraxerol) 90,31 ±  6,29 113,54 ±  7,16 >64 109,98 ±  8,45 >64 >64 >64 >64 Ellipticin 1,46 ± 0,12 1,30 ± 0,12 0,98 ± 0,08 2,07 ± 0,12 Kết quả  cho thấy hợp chất   M3  thể  hiện hoạt tính khá với 3 dịng tế  bào ung thư   Hep­G2,  KB,  MCF7 (IC50