Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam là nghiên cứu loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) một cách hệ thống và đầy đủ về các mặt: Thực vật (vi phẫu, trình tự gen), thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGŨ TRƯỜNG NHÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành : Hóa học hợp chất thiên nhiên Mã số : 44 01 17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2019 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Nguyễn Mạnh Cường Người hướng dẫn khoa học 2: TS Đỗ Hữu Nghị Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Việt Nam có diện tích khoảng 330000 km2, trải dài 1650 km qua 15 vĩ độ, có khí hậu nhiệt đới gió mùa, hai mùa nóng ẩm, độ ẩm tương đối lớn (trên 80%), lượng mưa hàng năm dồi (trung bình 1200-2800 mm) Với đặc thù môi trường thiên nhiên tạo hệ thực vật đa dạng phong phú chủng loại, quanh năm xanh tốt, có nhiều cơng dụng phục vụ sống người lương thực, chế biến đồ dùng nội ngoại thất, làm cảnh, làm thuốc,… Theo số liệu thống kê, hệ thực vật bậc cao Việt Nam có 10.000 lồi, có khoảng 3.200 lồi sử dụng y học dân tộc làm thuốc chữa bệnh Trong hệ thực vật chi Trắc (Dalbergia) thuộc họ Đậu (Fabaceae) ba chi có số lồi đa dạng phong phú Theo tìm hiểu qua tri thức địa nhiều lồi chi Trắc hoàng đàn Dalbergia assamica Bent, Trắc Dalbergia foliacea Wall ex Benth, Cẩm lai hạt Dalbergia candenatenis, Dalbergia rimosa, Dalbergia odorifera , sử dụng rộng rãi y học dân gian nhiều quốc gia để chữa nhiều bệnh như: đau đầu, chữa ung nhọt, ho suyễn, gãy xương, phong thấp, chảy máu cam, nhiễm trùng, bệnh giang mai, tiêu chảy, huyết áp, tim mạch, v/v Trong đó, lồi Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) bị khai thác mức, có danh mục sách Đỏ Việt Nam (2007), phân hạng mức nguy cấp Các nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy loài chi Dalbergia chứa lớp chất flavonoid (flavone, isoflavone, neoflavone, flavans, flavonol), hợp chất phenol terpen Các cao chiết hợp chất phân lập từ chi Dalbergia có hoạt tính sinh học q làm giảm đau, kháng viêm, kháng androgen, chống dị ứng, ho suyễn, chống bệnh than, huyết áp, điều hòa miễn dịch, có tác dụng liên quan đến tim mạch Cho đến loài Sưa Việt Nam chưa nghiên cứu đầy đủ toàn diện thực vật học, thành phần hóa học tác dụng sinh học Cịn mặt hóa học có cơng trình nghiên cứu sơ nước Từ sở khoa học thực tiễn nêu định hướng cho lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Việt Nam’’ Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) cách hệ thống đầy đủ mặt: thực vật (vi phẫu, trình tự gen), thành phần hóa học hoạt tính sinh học Các nội dung nghiên cứu luận án Để đạt mục tiêu nêu trên, luận án thực nội dung sau: - Nghiên cứu thực vật (vi phẫu lá, thân, bột lõi thân trình tự gen) lồi Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) - Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain): điều chế cặn chiết phân đoạn, phân lập hợp chất từ cặn chiết phương pháp sắc ký, xác định cấu trúc hợp chất phân lập phương pháp hóa lý đại - Khảo sát số hoạt tính sinh học: kháng khuẩn ức chế enzyme glucosidase cao chiết tổng, cao chiết phân bố số hợp chất phân lập từ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Việt Nam CHƯƠNG TỔNG QUAN Phần tổng quan tài liệu tập hợp nghiên cứu nước quốc tế vấn đề: 1.1 Tổng quan họ đậu (Fabaceae) chi trắc (Dalbergia) 1.1.1 Tổng quan họ Đậu (Fabaceae) 1.1.1.1 Tổng quan chi Trắc (Dalbergia) 1.1.1.2 Tổng quan loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Trắc (Dalbergia) giới CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phần mơ tả chi tiết q trình xử lý mẫu nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu vi phẫu trình tự gen, điều chế phần chiết, phân tách sắc ký phân lập hợp chất, phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.1 Đối tượng nghiên cứu Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) thu hái thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đăk Lăk Tên khoa học loài xác định TS Nguyễn Quốc Bình, Bảo Tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Mẫu tiêu lưu trữ phòng tiêu thực vật, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, kí hiệu mẫu C-561 C-612 Mẫu Sưa (lá, vỏ, thân lõi gỗ) sau thu hái rửa sạch, loại bỏ phần vỏ, lấy phần thân lõi có màu đỏ để phân lập chất, phơi khơ Sau mẫu xay nhỏ ngâm chiết kiệt nhiều lần MeOH nhiệt độ phòng Sau cất loại dung môi, cặn cô chiết phân đoạn với dung mơi có độ phân cực tăng dần như: n-hexan, chloroform dichloromethane, etyl acetate nước Lõi gỗ (3,7 kg) Ngâm MeOH (5 x 7,0L) Cao methanol (120 g, M) Bã sau chiết Chiết phân bố Đun nước (4 x 3,0L) n-hexane W (4,2 g) ethyl acetate dichloromethane MH (29,0 g) MD (45,1 g) ME (11,1 g) nước MW (12,0 g) Sơ đồ 2.1 Xử lý mẫu chiết tách từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu vi phẫu: Thực Bộ môn Thực vật- Trường Đại học Dược Hà Nội 2.2.2 Nghiên cứu trình tự gen: Thực Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.2.3 Phương pháp phân lập hợp chất từ dịch chiết Các phương pháp sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel pha thường (Merck loại 40-63 m) pha đảo (ODS, YMC (30-50 μm)), sắc ký cột Dianion HP-20, Sephadex LH-20 Bên cạnh cịn dùng phương pháp kết tinh để thu chất 2.2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học chất kết hợp thông số vật lý với phương pháp phổ đại bao gồm: Phổ khối ion hóa bụi điện tử ESI-MS ghi máy ghi Agilent 6310 Ion Trap, phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS đo máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS máy MicroQ-TOF III mass spectrometer (Bruker Daltonics, Germany) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-, 13C-và DEPT NMR) hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) ghi máy Bruker Avance 500 MHz đo với TMS chất chuẩn nội Sử dụng dung môi hịa tan hồn tồn mẫu thử chủ yếu DMSO-d6, MeOD-d4, CDCl3 Trong luận án sử dụng phổ CD (lưỡng sắc vòng - circular dichroism) để xác định cấu hình tuyệt đối hợp chất 2.2.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.2.5.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định số chủng: Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Aspergillus niger, Fusarium oxyporum, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans Thực Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.2.5.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase Thực Khoa Dược, Trường Đại học Tam Kang, Đài Loan Enzyme glucosidase từ gạo, nấm men (Saccharomyces cerevisiae), vi khuẩn (B stearothermophilus), chuột với chất p-nitrophenyl -D-glucopyranoside (pNPG) acarbose mua hãng Sigma Aldrich, St Louis City, MO, USA 2.2.6 Thông số hóa lý kiện phổ hợp chất phân lập Phần trình bày chi tiết kiện phổ số vật lý 18 hợp chất phân lập từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinenis Prain) CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chương trình bày kết nghiên cứu vi phẫu, DNA, kết phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất, hoạt tính kháng khuẩn ức chế enzyme -glucosidase 3.1 Kết nghiên cứu vi phẫu trình tự gen lồi Sưa (Dalbergia tonkinenis Prain) Phần mô tả chi tiết kết hình thái vi phẫu lá, thân bột lõi thân loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 3.1.1 Kết nghiên cứu vi phẫu Chúng tiến hành nghiên cứu vi phẫu lá, thân bột lõi thân loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) thu Tp Buôn Ma thuột để hỗ trợ cho việc phân loại hình thái bổ sung sở liệu di truyền cho loài Một số kết trình bày hình đây: 1- Lơng che chở; 2- Biểu bì trên; 3-Mơ dày trên; 4; 7- Mơ cứng; 5- Gỗ; 6- Libe; 8- Mô dày dưới; 9- Mơ mềm; 10- Biểu bì Hình 3.1 Vi phẫu Sưa 11- Biểu bì trên; 12- Hạ bì trên; 13- Mơ giậu; 14- Mơ khuyết; 15 – Biểu bì Hình 3.2 Phiến Sưa 3.1.2 Kết nghiên cứu trình tự gen Trong nghiên cứu chúng tơi tiến hành xác định trình tự vùng gen lục lạp rbcL, rpoB rpoC mẫu Sưa thu Tp Buôn Ma Thuột (C-561-L) thu Hà Nội (C-564-L) so sánh khoảng cách di truyền vùng gen với lồi Dalbergia khác cơng bố trình tự GenBank Kết cho thấy (hình 3.3) ba vùng gen rbcL, rpoB rpoC thích hợp để sử dụng cho nghiên cứu phân loại loài thuộc chi Sưa (Dalbergia) với tỉ lệ phân biệt 99%, 98% 97% Trình tự vùng gen lục lạp rbcL, rpoB rpoC loài Sưa (Dalbergia tonkinenis Prain) Việt Nam đăng ký ngân hàng gen với số hiệu KY283103, KY287755 KY287750 Hình 3.3 So sánh khả phân biệt loài Dalbergia vùng gen nghiên cứu 3.2 Kết phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Phần mô tả chi tiết kết phân lập, phân tích phổ xác định cấu trúc hóa học lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain), có 02 hợp chất cịn lại hợp chất biết Kết phân lập xác định cấu trúc 18 hợp chất từ lõi gỗ Sưa bao gồm: 08 hợp chất từ cao chiết dichloromethane, 07 hợp chất từ cao chiết ethyl acetate 03 hợp chất từ cao nước Cấu trúc 18 hợp chất phân lập trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Bảng tổng hợp hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Pinocembrin Naringenin 3'-hydoxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol Medicarpin Buteaspermanol Daltonkin A (2S)-8-carboxyethylpinocemprin (Chất mới) Dalbergin Daltonkin B (2S)-2,6-dicarboxyethylnaringenin (Chất mới) Liquiritigenin 7,3',5'-trihydroxyflavanone Sativanone 3'-O-methylviolanone Vestitone Calycosin Formononetin 7,3',4'-trihydroxyaurone (Sulfuretin) 4',7-dihydroxy-3-methoxyflavone Isoliquiritigenin 3.2.1 Hợp chất daltonkin A Hợp chất daltonkin A phân lập dạng chất rắn vơ định hình Phổ khối phun bụi electron phân giải cao (HR-ESI-MS), cho pic ion giả phân tử m/z = Hình 3.7 Phổ COSY hợp chất daltonkin A Hình 3.8 Phổ HMBC hợp chất daltonkin A Thêm vào đó, tương quan proton H-9 với carbon C-7, C-8 C-8a phổ HMBC cho phép xác định nhóm carboxyethyl gắn vào vị trí C-8 vịng A Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất daltonkin A Vị trí daltonkin A (*) δH (ppm) (J , Hz) δC (ppm) 5,47, dd, 13,0; 3,0 80,5, d 2,80, dd, 17,0; 3,0, H-3eq 3,11, dd, 17,0; 13,0, H-3ax 44,3, t 197,5, s 4a 103,3, s 162,8, s 6,02, s 95,6, d 166,1, s 108,5, s 8a 162,8, s 2,86, t, 8,0 18,7, t 10 2,49, t, 8,0 34,1, t 11 177,7, s 9' 10' 11' 1' 140,5, s 2',6' 7,52, d, 7,5 127,3, d 4' 7,39, t, 7,5 129,6, d 3',5' 7,44, d, 7,5 129,7, d (*)1H-NMR (500 MHz, methanol-d4); 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) 11 Các nghiên cứu trước cho thấy flavanone cấu hình 2S phổ CD (lưỡng sắc vịng - circular dichroism) thường có hiệu ứng Cotton dương vùng gần 330 nm (n–*) hiệu ứng Cotton âm vùng 270–290 nm Phổ CD (c 0,4, MeOH) hợp chất daltonkin A (hình 3.9) cho thấy có hiệu ứng Cotton dương 330 + 2,10 (n–*) hiệu ứng Cotton âm 288 – 10,43 (– * ) Như vậy, hợp chất flavanone daltonkin A có cấu hình 2S Hình 3.9 Phổ CD hợp chất daltonkin A Qua phân tích tổng hợp liệu phổ cho phép xác định hợp chất daltonkin A (2S)-8-carboxyethylpinocembrin, hợp chất lần phân lập từ thiên nhiên Hình 3.10 Cấu trúc hóa học hợp chất daltonkin A Hình 3.11 Các tương tác HMBC (H→C) COSY (H→H) hợp chất daltonkin A 12 3.2.2 Xác định cấu trúc hợp chất daltonkin B Hợp chất daltonkin B phân lập dạng chất bột vơ định hình màu trắng Phổ hồng ngoại (IR) hợp chất daltonkin B xuất cực đại hấp thụ đặc trưng cho nhóm hydroxyl OH (νmax 3369 cm-1) nhóm carbonyl C=O (νmax 1751 cm-1) liên kết C=C (benzene) (νmax, 1751, 1676, 1575 cm-1) Phổ tử ngoại UV tương tự hợp chất daltonkin A xuất đỉnh đặc trưng cho nối đôi liên hợp UV (MeOH) λmax nm (logε): 297 nm Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) hợp chất daltonkin B cho pic ion giả phân tử m/z = 415,1014 [M – H]– (tính tốn 415,1024) Cơng thức phân tử hợp chất daltonkin B C21H19O9 Hình 3.12 Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS hợp chất daltonkin B Tương tự hợp chất daltonkin A, tín hiệu carbon hợp chất đặc trưng cho khung flavanone bao gồm: tín hiệu carbon methylene δC 44,0 (C-3), tín hiệu carbon nhóm oxymethine vị trí δC 80,3 (C-2) tín hiệu carbon nhóm carbonyl δC 197,5 (C-4) phổ 13C-NMR Phổ 1H 13 C-NMR daltonkin B có tín hiệu tương tự flavanone narigenin, phân lập từ loài Dalbergia odorifera, ngoại trừ thay hai proton vòng benzene (H-6 H-8) hợp chất narigenin tín hiệu hai nhóm carboxyethyl (H-9 [δH 2,85, m]/C-9 [δC 18,8], H-10 [δH 2,55, m]/C-10 [δC 34,4], C-11 [δC 179,1]) (H-9' [δH 2,81, m]/C-9' [δC 19,4], H-10' [δH 2,51, 13 m]/C-10' [δC 34,8] C-11' [δC 179,2]) Các số liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất daltonkin B trình bày (bảng 3.3) Hình 3.13 Phổ 1H-NMR hợp chất daltonkin B Hình 3.14 Phổ 13C-NMR hợp chất daltonkin B Các kiện phổ chiều HSQC, HMBC, COSY sử dụng để xác định cấu trúc khung flavanone, nhóm carboxyethyl vị trí gắn chúng với vòng A daltonkin B Trên phổ COSY ta thấy rõ tương quan proton methylene H9/H-10 H-9'/H-10' Phổ HMBC khẳng định có hai nhóm carboxyethyl qua tương tác proton methylene H-9 H-10 với carbonyl carbon C-11 tương tác proton H-9' H-10' với carbon C-11' Vị trí gắn kết hai nhóm carboxyethyl xác định qua tương tác proton H-9' với carbon C-5, C-6 C-7, tương tác proton H-9 với C-7, C-8 C-8a phổ 14 HMBC Các tương tác cho phép kết luận hai nhóm carboxyethyl gắn vào vị trí C-6 C-8 vịng A Hình 3.15 Phổ COSY hợp chất daltonkin B Hình 3.16 Phổ HMBC hợp chất daltonkin B Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất daltonkin B Vị trí 4a 8a 10 11 9' 10' 11' 1' 2',6' 4' 3',5' daltonkin B (*) δH (ppm) (J , Hz) 5,39, dd, 13,0, 3,0 2,79, dd, 17,0, 3,0, H-3eq 3,13, dd, 17,0, 13,0, H-3ax 2,85, m 2,55, m 2,81, m 2,51, m 7,36, d, 8,5 6,85, d, 8,5 δC (ppm) 80,3, d 44,0, t 198,6, s 103,4, s 159,8, s 109,0, s 163,9, s 108,3, s 161,1, s 18,8, t 34,4, t 179,1, s 19,4, t 34,8, t 179,2, s 131,4, s 128,8, d 158,9, s 116,4, d (*) H-NMR (500 MHz, methanol-d4); 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) 15 Tương tự daltonkin A, hợp chất daltonkin B xác định có cấu hình 2S Như vậy, cấu trúc hợp chất daltonkin B xác định Hợp chất dicarboxyethylflavanone có tên gọi (2S)-6,8dicarboxyethylnaringenin, lần đầu phân lập tự nhiên Hình 3.17 Cấu trúc hóa học hợp chất daltonkin B Hình 3.18 Các tương tác HMBC (H→C) COSY (H→H) hợp chất daltonkin B 3.2 Đánh giá tác dụng sinh học 3.2.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Các hợp chất pinocembrin, naringenin 3'-hydroxy-2,4,5- trimethoxydalbergiquinol phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định số chủng Kết (bảng 3.4) cho thấy hợp chất pinocembrin biểu hoạt tính ức chế mạnh hai chủng nấm mốc Fusarium oxyporum Aspergillus niger với nồng độ ức chế tối thiểu MIC = 50 µg/mL Lồi nấm Fusarium oxyporum loại gây bệnh thối cổ rễ Một bệnh gây hại nhiều đến mùa màng nước ta Còn chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus hợp chất pinocembrin cho thấy khả ức chế trung bình với giá trị MIC=100µg/mL Hợp chất naringenin có tác dụng ức chế vửa phải chủng vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus chủng nấm mốc Aspergillus niger Trong hợp chất 3'-hydroxy-2,4,5- 16 trimethoxydalbergiquinol khơng thể hoạt tính kháng vi sinh vật chủng thử nghiệm Bảng 3.4 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất phân lập từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Hoạt tính kháng khuẩn (MIC: µg/mL) Vi khuẩn Nấm mốc (sợi) Hợp chất Nấm men Bacillus subtillis Staphylococcus aureus Aspergillus niger Fusarium oxyporum Saccharomyces cerevisiae Candida albicans (-) (-) (-) 100 100 (-) 50 100 (-) 50 (-) (-) 100 (-) (-) 100 (-) (-) pinocembrin naringenin 3'-hydroxy2,4,5trimethoxydalbe rgiquinol (-): IC50 ≥ 200 µg/mL 3.2.2 Tác dụng ức chế enzyme -glucosidase Cao chiết methanol lõi gỗ, vỏ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đánh giá hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase, cao chiết methanol lõi gỗ có tác dụng mạnh với giá trị IC50 0,17 mg/mL, so với chất đối chứng dương acabose (IC50 1,21 mg/mL) 100 100 80 80 60 40 20 60 40 20 0 IC50B (mg/mL) 1.6 1.6 1.4 1.4 1.2 1.2 EC50 (mg/mL) A 1.0 0.8 0.6 Lõi gỗ Heartwood Heartwood Vỏ bark Trunk Trunk bark 0.4 Lá Leaves Leaves Acarbose 0.2 Acarbose Acarbose 0.0 5 (mg/mL) Concentration (mg/mL) NồngConcentration độ (mg/mL) B EC50 (mg/mL) A aGI (%) aGI (%) Ức chế (%) 1.25 1.0 0.8 0.78 0.57 1.25 0.78 0.57 0.6 0.4 0.17 0.17 0.2 0.0 Heartwood Bark Leaves Acarbose Heartwood Bark Leaves Acarbose LõiPart gỗ used Vỏ Lá Part used Acarbose Hình 3.19 Khả ức chế α-glucosidase phận loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Đánh giá tác dụng ức chế enzyme -glucosidase phân đoạn cao chiết methanol lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 17 Bảng 3.5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase cao phân đoạn từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Ức chế enzyme α-glucosidase Mẫu IC50 (mg/mL) ức chế (%)* HDT (cao methanol) 0,172±0,011 98±3,2 HDT-1 (cao phân đoạn hexane) 1,712±0,210 73±4,1 HDT-2 (cao phân đoạn 0,124±0,003 90±2,5 0,069±0,001 95±3,7 0,513±0,051 82±2,3 1,357 62 dichloromethane ) (cao phân đoạn ethyl HDT-3 acetate ) HDT-4 (cao phân đoạn nước) Acarbose (đối chứng dương) (*): Khả ức chế acarbose phân đoạn xác định khoảng nồng độ 0,1-5 mg/mL Từ bảng 3.5 cho thấy cao chiết ethyl acetate (HDT-3) có hoạt tính ức chế mạnh tương ứng 95% giá trị IC50 0,069 mg/mL Dựa đánh giá sắc ký lớp mỏng Chúng chọn cao chiết phân đoạn cao chiết nước để phân lập hợp chất theo định hướng tác dụng sinh học Kết từ hai phân đoạn 3.1.2 4.3.3, 02 hợp chất sativanone formononetin phân lập Tác dụng ức chế enzyme αglucosidase hợp chất so với acarbose thể hình 3.20 B C 80 80 80 60 80 aGI (%) 100 80 60 40 4.3.6 4.3.5 4.3.4 20 Components separated from HDT-4.3 Các phân đoạn HDT-4.3 Compound Acarbose1 (purified HDT-3.1.2) Compound (purified HDT-4.3.3) Acarbose (positive control) Concentration (mg/mL) Nồng độ (mg/mL) Hình 3.20 Tác dụng ức chế α-glucosidase cao phân đoạn hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 18 4.7 4.8 4.5 4.1 3.1.7 3.1.8 Sativanone Formononetin 40 4.3.3 3.1.5 60 20 4.3.2 3.1.6 3.1.3 Các phân đoạnEHDT-3.1 100 4.3.1 aGI (%) Sub-fractions of HDT-4 Các phân đoạn HDT-4 Components separated from HDT-3.1 D Ức chế (%) 3.1.4 3.1.1 Sub-fractions of HDT-3 Các phân đoạn HDT-3 3.1.2 3.12 3.9 3.10 3.11 3.7 3.8 3.5 3.6 3.3 3.4 20 3.1 20 4.6 40 20 4.3 40 4.4 40 60 4.2 60 aGI (%) 100 aGI (%) 100 3.2 Ức chế (%) aGI (%) A 100 Từ hình 3.20, thấy khả ức chế α-glucosidase hợp chất sativanone formononetin mạnh acarbose (chất đối chứng dương) với tỉ lệ ức chế giá trị IC50 (90%, 0,23 mg/mL), (98%, 0,059 mg/mL) so với acarbose (62%, 1,321 mg/mL) Đây hợp chất lần đầu phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Kết thử hoạt tính chức chế enzyme α-glucosidase hợp chất phân lập từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) enzyme αglucosidase từ nguồn khác Bảng 3.6 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase sativanone formononetin so với acarbose nguồn enzyme α-glucosidase khác STT Nguồn enzyme Khả ức chế tính theo IC50 (mg/mL) Sativanone Formononetin Acarbose Nấm men 0,23±0,012 0,06±0,002 1,321±0,048 Chuột 0,37±0,022 0,23±0,037 0,121±0,001 Vi khuẩn 0,07±0,001 0,03±0,002 0,001±0,000 Gạo 0,81±0,023 0,98±0,029 0,031±0,005 (-) khơng có tác dụng; tất thử nghiệm tiến hành lần Nhận xét: thí nghiệm enzyme α-glucosidase từ nấm men, từ chuột, từ vi khuẩn từ gạo sử dụng để đánh giá tác dụng chống đái tháo đường in vitro hoạt chất phân lập từ lõi gỗ Sưa Kết cho thấy hợp chất có khả ức chế enzyme α-glucosidase từ nguồn enzyme α-glucosidase nấm men, chuột, vi khẩn gạo Enzyme α-glucosidase từ nấm men sử dụng làm enzyme đích để sàng lọc chống đái tháo đường thử nghiệm in vitro báo cáo Tuy nhiên, αglucosidase từ chuột cho nguồn enzyme tốt để đánh giá chất ức chế mạnh enzyme tương tư với enzyme người Trong nghiên cứu này, sativanone formononetin chứng minh khả ức chế enzyme αglucosidase mạnh so với acarbose, kết cho thấy tác dụng tương đương chúng acarbose enzyme α-glucosidase chuột 19 Bảng 3.7 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase chuột cao chiết phận hợp chất từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Khả ức chế enzyme α-glucosidase chuột Thành phần IC50 (mg/mL ) Cao chiết methanol lõi gỗ Cao chiết methanol vỏ Cao chiết methanol Phân đoạn EtOAc (HDT-3) HDT-3.1 HDT-3.1.2 Sativanone Cao nước (HDT-4) HDT-4.3 HDT-4.3.3 Fomononetin Acarbose 1,72±0,116 2,91±0,289 2,78±0,173 1,31±0,057 1,13±0,057 0,92±0,023 Ức chế cực đại (%) 61±3,46 51±4,62 54±4,60 68±5,77 75±5,20 77±5,18 0,357±0,006 91±4,61 1,43±0,115 67±2,89 0,87±0,035 78±4,61 0,55±0,012 84±6,42 0,251±0,006 94±5,11 0,119±0,005 93±2,50 Kết bảng 3.7 cho thấy cao chiết tổng methanol lõi gỗ hợp chất sativanone formononetin từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) tác nhân ức chế enzyme α-glucosidase mạnh có tiềm phát triển thành chế phẩm hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường tương lai 20 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Về kết nghiên cứu thực vật - Các đặc điểm vi phẫu lá, thân bột lõi thân Sưa miêu tả cụ thể, góp phần tiêu chuẩn hóa lồi gỗ q - Đã xác định trình tự 03 vùng gen lục lạp rbcL, rpoB rpoC mẫu Sưa so sánh khoảng cách di truyền vùng gen với 05 lồi Dalbergia khác cơng bố trình tự GenBank - 03 vùng gen lục lạp rbcL, rpoB rpoC có khả phân biệt lồi thuộc chi Sưa (Dalbergia) với tỉ lệ tương ứng 99%, 98% 97% - Trình tự 03 vùng gen rbcL, rpoB rpoC loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Việt Nam đăng ký ngân hàng gen với số hiệu KY283103, KY287755 KY287750 Về mặt hóa học - Lần từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) phân lập xác định cấu trúc hóa học 18 hợp chất flavonoid: pinocembrin, naringenin, 3'-hydroxy2,4,5-trimethoxydalbergiquinol, medicarpin, buteaspermanol, daltonkin A [(2S)8-carboxyethylpinocembrin], daltonkin B [(2S)-2,6-dicarboxyethylnaringenin], dalbergin, isoliquiritigenin, 7,3',5'-trihydroxyflavanone, vestitone, calycosin, 4',7dihydroxy-3-methoxyflavone, liquiritigenin, sativanone, 3'-O-methylviolanone, 7,3',4'-trihydroxyaurone formononetin - 02 hợp chất daltonkin A daltonkin B hợp chất mono- dicarboxyethylflavanone Tác dụng sinh học cao chiết hợp chất phân lập - Tác dụng kháng khuẩn Hợp chất pinocembrin biểu hoạt tính ức chế nấm sợi (với nồng độ ức chế tối thiểu [MIC] 50 µg/mL), nấm men vi khuẩn Gram dương staphylococcus aureus hợp chất pinocembrin naringenin cho thấy khả ức chế trung bình với giá trị MIC 100 µg/mL - Tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase 21 - Cao chiết methanol lõi gỗ, vỏ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đánh giá hoạt tính ức chế enzyme glucosidase, cao chiết methanol lõi gỗ có tác dụng mạnh với giá trị IC50 0,17 mg/mL, so với chất đối chứng dương acabose (IC50 1,21 mg/mL) - Phân lập theo định hướng ức chế enzyme α-glucosidase xác định hợp chất sativanone formononetin có khả mạnh acarbose (chất đối chứng dương) với tỉ lệ ức chế giá trị IC50 sativanone (90%, 0,23 mg/mL) formononetin (98%, 0,06 mg/mL) so với acarbose (62%, 1,321 mg/mL) - Cao chiết methanol từ lõi gỗ Sưa (HDT) có tác dụng ức chế enzyme αglucosidase chuột mạnh vỏ với IC50 1,72 mg/ mL - Sativanone formononetin có tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase chuột với tỉ lệ ức chế giá trị IC50 (91%, 0,357 mg/mL), (94%, 0,251 mg/mL) 22 KIẾN NGHỊ Các kết nghiên cứu chúng tơi lồi Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain), dẫn đến việc phân lập xác định nhiều hợp chất có cấu trúc lý thú có hoạt tính ức chế mạnh enzyme α-glucosidase với dẫn liệu phong phú mặt thực vật (vi phẫu DNA) - Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học phận gỗ, rễ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) nhằm tạo liệu đầy đủ hệ thống loài Sưa Việt Nam - Nghiên cứu sâu tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase khả điều trị bệnh đái tháo đường 02 hoạt chất sativanone, formononetin cao chiết methanol lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 23 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Luận án đóng góp kết thực vật, hóa học hoạt tính sinh học sau: Đã đưa đặc điểm, mô tả vi phẫu lá, thân bột lõi thân Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Đã xác định trình tự 03 vùng gen lục lạp rbcL, rpoB rpoC 02 mẫu Sưa so sánh khoảng cách di truyền vùng gen với 05 lồi Dalbergia khác cơng bố trình tự GenBank Trình tự 03 vùng gen rbcL, rpoB rpoC loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Việt Nam đăng ký ngân hàng gen với số hiệu KY283103, KY287755 KY287750 Lần từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) phân lập xác định cấu trúc hóa học 18 hợp chất flavonoid: pinocembrin, naringenin, 3'-hydroxy-2,4,5trimethoxydalbergiquinol, medicarpin, buteaspermanol, daltonkin A [(2S)-8carboxyethylpinocembrin], daltonkin B [(2S)-2,6-dicarboxyethylnaringenin], dalbergin, isoliquiritigenin, 7,3',5'-trihydroxyflavanone, vestitone, calycosin, 4',7dihydroxy-3-methoxyflavone, liquiritigenin, sativanone, 3'-O-methylviolanone, 7,3',4'-trihydroxyaurone formononetin 02 hợp chất daltonkin A daltonkin B hợp chất mono- dicarboxyethylflavanone Đã đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của lõi gỗ, vỏ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain), phân đoạn cao chiết methanol, phân lập đánh giá tác dụng ức chế α-glucosidase hợp chất Cao chiết methanol từ lõi gỗ Sưa (HDT) có tác dụng ức chế enzyme αglucosidase chuột mạnh vỏ với IC50 1,72 mg/ mL Sativanone formononetin có tác dụng ức chế α-glucosidase từ nấm men mạnh acarbose (chất đối chứng dương) với tỉ lệ ức chế giá trị IC50 (90%, 0,23 mg/mL), (98%, 0,059 mg/mL) so với acarbose (62%, 1,321 mg/mL) Sativanone formononetin có tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase chuột với tỉ lệ ức chế giá trị IC50 (91%, 0,357 mg/mL) (94%, 0,251 mg/mL) 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nguyen Manh Cuong, Ngu Truong Nhan, Ninh The Son, Do Huu Nghi, To Dao Cuong, Daltonkins A and B, Two New Carboxyethylflavanones from the Heartwood of Dalbergia tonkinensis, Korean Chemical Society, 2017, 38 (12), 1511–1514 (SCI, IF: 0.76) Van Bon Nguyen, San-Lang Wang, Ngu Truong Nhan, Thi Hanh Nguyen, Nguyen Phuong Dai Nguyen, Do Huu Nghi, Nguyen Manh Cuong, New Records of Potent In-Vitro Antidiabetic Properties of Dalbergia tonkinensis Heartwood and the Bioactivity-Guided Isolation of Active Compounds, Molecules, 2018, 23 (7), 1589-1600 (SCI-E, IF: 3.098) Ngu Truong Nhan, Ninh The Son, To Dao Cuong, Nguyen Phuong Dai Nguyen, Pham Ngoc Khanh, Tran Thu Huong, Nguyen Manh Cuong, Further study on chemical constituents from the heartwood of Dalbergia tonkinensis, Vietnam Journal of Science and Technology, 2018, 56 (4A), 252-258 (ACI) Nguyễn Mạnh Cường, Ngũ Trường Nhân, Nguyễn Phương Đại Nguyên, Phạm Ngọc Khanh, Ninh Thế Sơn, Trần Thu Hường, Tô Đạo Cường, Nguyễn Thị Hồng Mai, Nguyễn Thị Phương Trang, So sánh khả phân loại loài sưa đỏ (Dalbergia tonkinensis) Việt Nam số vùng gen lục lạp, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Sinh học tồn Quốc, Hà Nội, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 2018, 100-106, ISBN: 978-604-913-759-4 Ngũ Trường Nhân, Nguyễn Mạnh Cường, Đỗ Hữu Nghị, Tổng quan lớp chất flavonoid phân lập từ chi Dalbergia, họ Đậu (Fabaceae), Tạp chí Dược học, 2018, 505 (58), 16-21 ... chọn đề tài ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Việt Nam? ??’ Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) cách... Tổng quan lồi Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Trắc (Dalbergia) giới CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phần mơ tả chi... vật (vi phẫu DNA) - Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học phận gỗ, rễ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) nhằm tạo liệu đầy đủ hệ thống loài Sưa Việt Nam - Nghiên cứu sâu tác dụng ức