Kết cấu Luận án gồm có phần mở đầu, nội dung, phần kết luận và danh mục tài liệu tham khảo. Trong phần nội dung co 3 chương: Chương 1 - Tổng quan; Chương 2 - Đối tượng, phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm; Chương 3 - Kết quả và thảo luận. Mời các bạn cùng tham khảo!
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI HOÀNG ĐỨC THUẬN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY RÂU MÈO (ORTHOSIPHON STAMINEUS BENTH.) VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC HÀ NỘI - 2020 Cơng trình đƣợc hồn thành TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS VŨ QUỐC TRUNG TS NGUYỄN PHI HÙNG Phản biện 1: GS.TSKH Trần Văn Sung Viện Hóa học Phản biện 2: GS.TS Trần Đình Thắng Trường Đại học Vinh Phản biện 3: PGS.TS Phạm Hữu Điển Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp Trƣờng, họp Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia, Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Phịng Tư liệu khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Việt Nam nước có vị trí địa lý nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, địa hình nhiều đồi núi chia cắt nên điều kiện khí hậu đa dạng, có nhiều tiểu vùng khí hậu đặc trưng.Những yếu tố tạo nên hệ sinh thái, thảm thực vật nhiệt đới phong phú phát triển với nhiều loài thực vật q mà giới khơng có Cây Râu mèo (Cat’s whiskers), gọi Râu mèo xoắn, Bơng bạc, có tên khoa học Orthosiphon stamineus Benth., thuộc họ Bạc hà (Lamiaceae) Ở Việt Nam, Râu mèo phân bố rải rác vùng đồng miền núi như: Lào Cai (Sa Pa), Cao Bằng, Thanh Hóa (Vĩnh Lộc), Hà Nội (Văn Điển, Ba Vì), Sơn La, Bắc Giang, Lâm Đồng (Đà Lạt), Phú Yên (Tuy Hòa), Ninh Thuận (Phan Rang), Kiên Giang (Phú Quốc) Theo Đơng y, Râu mèo có vị nhạt, tính mát, khơng độc; có tác dụng lợi tiểu, nhiệt, trừ thấp, dùng làm thuốc lợi tiểu mạnh, thông mật, dùng bệnh sỏi thận, sỏi túi mật, viêm túi mật, dùng trị viêm thận cấp tính mạn tính; viêm bàng quang; sỏi tiết niệu Thành phần hóa học bao gồm flavonoids,cácdẫn xuất caffeic acid đặc biệt số hợp chất diterpenes nhận dạng thành phần hóa học có mặt loài Râu mèo Trên giới có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Râu mèo, phải kể đến hoạt tính trội chống ơxihóa, kháng viêm, hạ huyết áp, ức chế phát triển khối u, đặc biệt tác dụng lợi tiểu sử dụng điều trị sỏi thận, sỏi tiết niệu Tuy nhiên Việt Nam, nghiên cứu thành phần hóa học Râu mèo cịn ít, chưa chuyên sâu, nghiên cứu tác dụng sinh học chưa công bố nhiều.Cho tới chưa có cơng trình nước đặt vấn đề nghiên cứu cách hệ thống thành phần hóa học tác dụng sinh học theo hướng chống tiểu đường, béo phì chống ung thư lồi Râu mèo thực Do vậy, chúng tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth) Việt Nam”để nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu thành phần hóa học phần mặt đất Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất phân lập theo hướng chống tiểu đường ung thư Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu quy trình tách chiết để phân lập hợp chất từ Râu mèo Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập phép phân tích kết hợp phương pháp phổ Đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất phân lập theo hướng tác dụng liên quan bệnh tiểu đường (ức chế enzyme PTP1B tăng cường hấp thụ đường 2-NBDG) ung thư (ức chế số dòng tế bào ung thư vú) Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu chúng tơi chọn tồn phần mặt đất Râu mèo (Orthosiphon stamineus) thu hái Trung tâm nghiên cứu chế biến thuốc Hà Nội – Viện Dược liệu (địa chỉ:km-13, Ngũ Hiệp, Thanh Trì, Hà Nội) Những đóng góp luận án Đây cơng trình nghiên cứu chi tiết thành phần hóa học Râu mèo (O stamineus).Từ cao chiết tổng loài phân lập 40 hợp chất bao gồm: 08 hợp chất khung phenylpropanoids dẫn xuất lithospermic acid rosmarinic acid (B1–B8), 07 hợp chất dẫn xuất benzoic acid (B10– B17),17 hợp chất khung flavonoids (B9, E18–E33), 07 hợp chất diterpen khung pimarine (C34–C40) Trong số hợp chất phát 01 hợp chất đặt tên orthospilarate (B2) Tất 40 hợp chất phân lập đánh giá tác dụng ức chế enzyme protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) 17 hợp chất phenylpropanoids (B1–B17 )và 07 hợp chất diterpen (C34–C40) đánh giá tác dụng tăng cường hấp thụ đường 2-NBDG in vitro dịng tế bào mơ mỡ 3T3-L1 Kết hầu hết hợp chất thể tác dụng theo hướng phụ thuộc vào nồng độ 16 hợp chất flavonoid (E18–E33) phân lập từ phân đoạn EtOAc đánh giá tác dụng ức chế sinh trưởng phát triển 03 dòng tế bào ung thư vú người gồm MCF-7, MCF7/TAMR, MDA-MB-231 Kết có 04 hợp chất (E30–E33) thể tác dụng mạnh 03 dòng tế bào ung thu thử nghiệm, số hợp chất khác thể tác dụng chọn lọc số dịng có tác dụng trung bình yếu, hợp chất cịn lại khơng thể tác dụng Bố cục luận án Luận án bao gồm 137 trang với 14 bảng số liệu, 64 hình, sơ đồ Kết cấu luận án gồm: mở đầu (6 trang), tổng quan (23 trang), phương pháp nghiên cứu thực nghiệm (16 trang), kết thảo luận (78 trang), kết luận (3 trang), danh mục cơng trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (10 trang) II NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN Chúng tơi trình bày nội dung sau: 1.1 Giới thiệu Chi Orthosiphon Râu mèo (Orthosiphon stamineus) 1.1.1.Sơ lược chi Orthosiphon 1.1.2 Sơ lược Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) 1.2 Tình hình nghiên cứu Râu mèo 1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.2.1.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học Râu mèo 1.2.1.2 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học Râu mèo 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước Râu mèo CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG,PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.1 Phương pháp thu thập mẫu bảo quản Phương pháp thu thập mẫu thực vật tuân thủ theo tiêu chuẩn yêu cầu thực vật học để tiện cho lưu trữ, phân loại giám định thực vật Mẫu thu có thơng tin địa điểm, tên mẫu, phận thu, ảnh mẫu Tạo tiêu mẫu: Các tiêu lưu trữ kho bảo quản để đảm bảo mẫu không bị hỏng tiêu bản, tiện cho việc tra cứu tìm thơng tin sau 2.1.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc chất phân lập Để phân tích phân tách phân lập hợp chất, sử dụng phương pháp sắc ký như: Sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)của hãng Agilent phương pháp hóa lý 2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc hợp chất Cấu trúc hợp chất khảo sát nhờ kết hợp phương pháp phổ: Phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (EI-MS, ESI-MS, HR-ESI-MS) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H- và13CNMR) và2 chiều (COSY, HMBC, HSQC, NOESY) Phổ lưỡng sắc tròn (CD) đo độ quay cực [α]D 2.1.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học Phương pháp thử hoạt tính sinh học thực phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam.Ngồi ra, số kết thực thêm phía đối tác nước ngồi 2.2 Hóa chất thiết bị 2.2.1 Hóa chất: Các dung mơi sử dụng chiết xuất, chạy sắc ký thường: methanol, ethanol,nhexane, chloroform, ethylacetate, acetone, buthanol, nước cất Các dung mơi dùng phân tích SKLM, HPLC sử dụng loại tinh khiết Merck, Pháp Hàn Quốc, dùng cho loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại dung mơi phân tích 2.2.2 Thiết bị 2.2.3 Dụng cụ 2.3 Thực nghiệm 2.3.1 Nghiên cứu phân lập hợp chất từ Râu mèo xoắn 2.3.1.1 Chiết xuất tách phân đoạn từ nguyên liệu Râu mèo Nguyên liệu Râu mèo (2.1 kg) Chiết với MeOH (5L x lần) Sử dụng siêu âm 40 oC, 5h/mẻ Lọc, cô quay loại dung môi thu hồi cao chiết Cao MeOH tổng (195 g) Hòa tan 1L nước cất, Chiết phân đoạn với CHCl3, EtOAc, BuOH 1L x lần Cô quay đuổi dung môi thu hồi cao chiết Phân đoạn CHCl3 (> 25 g) Phân đoạn EtOAc (> 11 g) Phân đoạn BuOH (45 g) Phân đoạn nƣớc Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết cao tổng cao phân đoạn từ Râu mèo 2.3.1.2 Phân lập hợp chất từ cặn chiết BuOH Sơ đồ 2.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn BuOH 2.3.1.3 Phân lập hợp chất từ cặn chiết EtOAc Sơ đồ 2.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn EtOAc 2.3.1.4 Phân lập hợp chất từ cặn chiết CHCl3 Sơ đồ 2.4.Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn CHCl3 2.3.2 Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất phân lập - Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme PTP1B hợp chất -Đánh giá hoạt tính tăng cường hấp thụ đường 2-NBDG hợp chất dịng tế bào mơ mỡ 3T3-L1 - Đánh giá hoạt tính ức chế sinh trưởng phát triển tế bào ung thư vú người hợp chất CHƢƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thu thập xác định tên khoa học mẫu thực vật Tiến hành thu thập mẫu Râu mèo nghiên cứu địa điểm:Ngũ Hiệp, Thanh Trì, Hà Nội Mẫu dược liệu tạo tiêu mẫu so sánh xác định tên khoa học TS Nguyễn Quốc Bình, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 3.2 Kết phân lập tinh chế hợp chất Từ ba cao phân đoạn CHCl3, EtOAc BuOH kỹ thuật sắc ký khác (SKBM, SKC, SKC nhanh, HPLC) phân lập tinh chế thu 40 hợp chất 3.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ phân đoạn BuOH Hình 3.1.Cấu trúc hóa học hợp chất (B1‒B17) phân lập từ phân đoạn BuOH Râu mèo 3.3.1 Hợp chất B1 (OSB-7.4.2): Lithospermic acid Dữ liệu phổ hợp chất B1: [α]D +56.5 (c 0.5, MeOH); UV (MeOH): λmax: 252, 286, 304, 332 nm H-NMR (400 MHz, methanol-d4) H (ppm): 7.82 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7), 7.21 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6), 6.81 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5), 6.79 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2''), 6.76 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'), 6.75 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5''), 6.73 (1H, d, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6''), 6.68 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'), 6.61 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H6'), 6.33 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8), 5.91 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-7''), 5.16 (1H, dd, J = 4.0, 8.0 Hz, H-8'), 4.37 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-8''), 3.07 (1H, dd, J = 4.0, 14.0 Hz, H-7'a), 2.99 (1H, dd, J = 8.0, 14.0 Hz, H-7'b); 13 C-NMR (100 MHz, methanol-d4) C (ppm): 175.3 (C-9''), 173.7 (C-9'), 168.2 (C-9), 148.9 (C-3), 146.8 (C-3'), 146.7 (C-3''), 146.2 (C-4), 145.3 (C-4'), 145.3 (C-4''), 144.2 (C-7), 133.9 (C-1''), 129.4 (C1'), 127.8 (C-2), 124.7 (C-1), 122.0 (C-6), 121.8 (C-6''), 118.4 (C-5), 118.3 (C-6'), 117.7 (C-2'), 116.5 (C8, C-2''), 116.4 (C-5'), 113.5 (C-5''), 88.9 (C-7''), 74.9 (C-8'), 57.7 (C-8''), 38.0 (C-7') Dựa kết phân tích chi tiết liệu phổ hợp chất B1, kết hợp so sánh với liệu công bố tài liệu tham khảo, cho phép xác định cấu trúc hóa học hợp chất B1 lithospermic acid Hình 3.2.Cấu trúc hóa học tín hiệu tương tác HMBC hợp chất B1 (lithospermic acid) 3.3.2 Hợp chất B2(OSB-7.4.4): Hợp chất Hợp chất B2 thu dạng màu nâu nhạt, vô định hình 22 Giá trị độ quay cực [] D + 66.5 (c 0.5, MeOH) đo dung môi methanol; Phổ UV hợp chất B2 biểu thị dải hấp thụ cực đại bước sóng max (MeOH): 252, 288, 304, 332 nm; IR (KBr): 3338, 2966, 1722, 1612, 1518, 1250, 1190, 1091 cm-1; CD (c 0.4, MeOH): ∆ε254 (nm) + 33.54, ∆ε283 (nm) + 0.36, ∆ε330 (nm) + 10.03; HR-ESI-MS: m/z 535.1247 [M H] (calcd for C28H23O11 535.1241); Công thức phân tử hợp chất B2 xác định C28H24O11 dựa peak ion giả phân tử m/z 535.1247 [M‒H]‒ (tính tốn cho công thức phân tử C28H24O11, KLPT: 535.1241) thu phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS) So sánh phổ NMR chiều B2 với hai hợp chất B1 B3 cho thấy có tương đồng Trên Phổ 1H NMR B2 thể có nhóm proton aliphatic vị trí H 6.29 (d, J = 15.6 Hz, H-8), 7.71 (d, J = 15.6 Hz, H-7) tiếp hợp với nhóm carboxyl Hình 3.3.Cấu trúc hóa học hợp chất B2 (hợp chất mới) Tất liên kết xếp nhóm liên kết, nhóm chức cấu trúc hợp chất B2 chứng minh dựa phân tích kỹ phổ NMR chiều kết hợp với phổ chiều (bao gồm COSY, HSQC, HMBC) NMR (Hình 3.3) Hình 3.4.Các tín hiệu HMBC, COSY and NOESY hợp chất B2 Bảng 3.2.Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, methanol-d4) 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) hợp chất B2 hợp chất tham khảo (Orthosiphoic acid A): Hợp chất B2 Orthosiphoic acid A TT δH(mult., J Hz) δH (mult., J Hz) δC δC 127.0 127.9 124.7 124.9 146.9 149.0 145.3 144.1 118.5 6.81 (1H, d, 8.5) 118.4 6.81 (1H, d, 8.4) 122.0 7.18 (1H, d, 8.5) 122.0 7.20 (1H, d, 8.4) 143.8 7.71 (1H, d, 15.6) 144.2 7.82 (1H, d, 15.6) 116.9 6.29 (1H, d, 15.6) 116.5 6.32 (1H, d, 15.6) 168.3 168.4 129.1 129.0 1 131.7 7.12 (1H, d, 8.4) 131.6 7.12 (1H, d, 8.5) 2 116.4 6.71 (1H, d, 8.4) 116.3 6.70 (1H, d, 8.5) 3 157.4 157.4 4 116.4 6.71 (1H, d, 8.4) 116.3 6.70 (1H, d, 8.5) 5 6 131.6 7 38.0 7.12 (1H, d, 8.5) 3.14 (1H, dd, 4.0, 14.5) 3.04 (1H, dd, 8.5, 14.5) 5.18 (1H, dd, 4.0, 8.5) 131.7 38.0 7.12 (1H, d, 8.4) 3.12 (1H, dd, 4.2, 14.4) 3.05 (1H, dd, 8.4, 14.45) 5.17 (1H, dd, 4.2, 8.4) 75.5 75.4 8 174.9 173.7 9 133.9 133.6 1 113.6 6.79 (1H, d, 2.4) 116.5 6.77 (1H, d, 2.0) 2 146.9 146.7 3 146.8 149.0 4 116.6 6.75 (1H, d, 8.4) 113.6 6.75 (1H, d, 8.0) 5 118.4 6.72 (1H, dd, 2.4, 8.4) 118.4 6.70 (1H, dd, 2.0, 8.0) 6 89.1 5.91 (1H, d, 4.8) 88.7 5.88 (1H, d, 5.0) 7 57.9 4.35 (1H, d, 4.8) 57.4 4.43 (1H, d, 5.0) 8 175.3 174.4 9 53.3 3.71 (3H, s) 9-OCH3 Cấu trúc tương đối vị trí C-7′′ C-8′′ vòng benzofuran nhận dạng trans dựa vào việc tính tốn số liên kết proton H-7′′ H-8′′ tương ứng J = 5.0 Hz Trên phổ CD hợp chất B2 xuất dải sóng hấp thụ cực đại dương (hiệu ứng Cotton) bước sóng 254 nm với giá trị ∆ε254 (nm) + 33.54 chứng minh cấu trúc tuyệt đối vị trí C-7′′ có dạng S Hợp chất B2 thể giá trị độ quay cực dương + 66.5 (c 0.5, MeOH) chứng tỏ cấu trúc tuyệt đối vị trí C-8′ có dạng R Từ kết phân tích phổ nêu trên, hợp chất B2 nhận dạng 9-Methyl orthosiphoate A Đây hợp chất đặt tên orthospilarate 3.3.3 Hợp chất B.3 (OSB-7.5.4):9-Methyl lithospermate Hợp chất B3 thu dạng màu nâu nhạt, vơ định hình Phổ UV B3 thể píc hấp thụ λmax: 253, 286, 305, 333 nm H-NMR (500 MHz, methanol-d4) H (ppm): 7.71 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7), 7.18 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6), 6.80 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5), 6.77 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2''), 6.76 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'), 6.75 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5''), 6.71 (1H, d, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6''), 6.67 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'), 6.61 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H6'), 6.29 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8), 5.88 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-7''), 5.19 (1H, dd, J = 4.0, 8.5 Hz, H-8'), 4.43 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-8''), 3.69 (3H, s, 9''-OCH3), 3.15 (1H, dd, J = 4.0, 14.0 Hz, H-7'a), 3.04 (1H, dd, J = 8.5, 14.0 Hz, H-7'b); 13 C-NMR (125 MHz, methanol-d4) C (ppm): 174.4 (C-9''), 173.8 (C-9'), 168.3 (C-9), 149.0 (C-3), 146.9 (C-3'), 146.8 (C-3''), 146.2 (C-4), 145.3 (C-4'), 145.2 (C-4''), 143.8 (C-7), 133.5 (C-1''), 129.8 (C-1'), 127.0 (C-2), 124.7 (C-1), 122.0 (C-6), 121.8 (C-6''), 118.4 (C-5, C-6'), 117.6 (C-2'), 117.0 (C-8), 116.5 (C2''), 116.4 (C-5'), 113.6 (C-5''), 88.7 (C-7''), 75.4 (C-8'), 57.5 (C-8''), 53.4 (9''-OCH3), 38.0 (C-7') Phổ 1H 13C NMR hợp chất B3 cho thấy giống với hợp chất B1 ngoại trừ xuất nhóm methoxy vị trí H3.69 (3H, s, 9′′-OCH3) C 53.4 Dựa kết phân tích chi tiết liệu phổ hợp chất B3 kết hợp so sánh với liệu công bố tài liệu tham khảo, cho phép xác định cấu trúc hóa học hợp chất B3 9-Methyl lithospermate Hình 3.5 Cấu trúc hóa học tín hiệu tương tác HMBC hợp chấtB3 3.3.4 Hợp chất B4 (OSB-3.3.1): (S)-()-rosmarinic acid 22 Dữ liệu phổ hợp chất B4: [] D 110° (c 0.5, MeOH); H-NMR (400 MHz, methanol-d4) H (ppm): 7.56 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-7), 7.06 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.94 (1H, dd, J = 2.0, 8.4 Hz, H-6), 6.78 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5), 6.71 (1H, s, H-2'), 6.70 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5'), 6.57 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 6.28 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-8), 5.17 (1H, dd, J = 4.4, 8.4 Hz, H-8'), 3.09 (1H, dd, J = 14.0, 4.4 Hz, H-7'a), 3.00 (1H, dd, J = 14.0, 8.4 Hz, H-7'b); C-NMR (100 MHz, methanol-d4) C (ppm): 173.7 (C-9'), 168.5 (C-9), 149.5 (C-4), 148.0 (C-7), 146.8 (C-4'), 146.6 (C-3), 146.5 (C-3'), 129.6 (C-1), 127.8 (C-1'), 123.4 (C-6), 121.9 (C-6'), 117.7 (C-2'), 116.4 (C-8), 115.4 (C-2), 114.7 (C-5'), 114.3 (C-5), 74.6 (C-8'), 37.8 (C-7') Dựa vào liệu phân tích phổ nêu kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo cho phép xác định cấu trúc hóa học hợp chất B4 (S)-()-rosmarinic acid 13 Hình 3.6 Cấu trúc hóa học hợp chất B4 3.3.5 Hợp chất B5 (OSB-3.3.2): (R)-()-rosmarinic acid 22 Dữ liệu phổ hợp chất OSB-3.3.2: [] D +108° (c 0.5, MeOH); H-NMR (400 MHz, methanol-d4) H (ppm): 7.56 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-7), 7.06 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.94 (1H, dd, J = 2.0, 8.4 Hz, H-6), 6.78 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5), 6.71 (1H, s, H-2'), 6.70 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5'), 6.57 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 6.28 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-8), 5.22 (1H, dd, J = 5.2, 7.2 Hz, H-8'), 3.11 (1H, dd, J = 14.0, 5.2 Hz, H-7'a), 3.01 (1H, dd, J = 14.0, 7.2 Hz, H-7'b); 13 C-NMR (100 MHz, methanol-d4) C (ppm): 173.7 (C-9'), 168.5 (C-9), 149.5 (C-4), 148.0 (C-7), 146.6 (C-4'), 146.5 (C-3), 144.8 (C-3'), 129.3 (C-1), 127.6 (C-1'), 123.4 (C-6), 121.9 (C-6'), 117.7 (C-2'), 116.4 (C-8), 115.4 (C-2), 114.7 (C-5'), 114.3 (C-5), 74.6 (C-8'), 37.8 (C-7') Tất liệu phổ hợp chất B5 cho thấy giống tương tự với hợp chất B4 ngoại trừ giá trị độ quay cực hợp chất B5 đo 22 độ C +108°, điều chứng minh cấu hình dạng R vị trí C-8' Do đó, cấu trúc hóa học hợp chất B5 xác định (R)-()-rosmarinic acid Hình 3.7 Cấu trúc hóa học hợp chấtB5 3.3.6 Hợp chất B6 (OSB-3.3.3): methyl rosmarinate H-NMR (400 MHz, methanol-d4) H (ppm): 7.55 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7), 7.05 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.96 (1H, dd, J = 2.0, 8.4 Hz, H-6), 6.78 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5), 6.71 (1H, s, H-2'), 6.70 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5'), 6.57 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 6.27 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8), 5.19 (1H, dd, J = 5.6, 7.2 Hz, H8'), 3.68 (3H, s, OCH3), 3.10 (1H, dd, J = 14.0, 5.6 Hz, H-7'a), 3.02 (1H, dd, J = 14.0, 7.2 Hz, H-7'b); 13 C-NMR (100 MHz, methanol-d4) C (ppm): 172.3 (C-9'), 168.5 (C-9), 149.9 (C-4), 148.1 (C-7), 146.9 (C-4'), 146.3 (C-3), 145.5 (C-3'), 128.9 (C-1), 127.7 (C-1'), 123.4 (C-6), 121.9 (C-6'), 117.7 (C-2'), 116.4 (C-8), 115.4 (C-2), 114.7 (C-5'), 114.3 (C-5), 74.8 (C-8'), 38.0 (C-7'), 52.9 (OCH3) Phổ 1H- 13C-NMR hợp chất B6 giống với hợp chất số B4 B5, ngoại trừ xuất nhóm methyl liên kết với nguyên tử oxy nhóm carboxy hợp chất B6 [H3.68 (3H, s, OCH3), C52.9 (OCH3)] Do đó, cấu trúc hóa học hợp chất B6 nhận dạng methyl rosmarinate Hình 3.8 Cấu trúc hóa học hợp chất B6 3.3.7 Hợp chất B7 (OSB-7.1.2):clinopodic acid A Dữ liệu phổ hợp chất B7: H-NMR (400 MHz, methanol-d4) H (ppm): 7.52 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-7), 7.03 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.93 (1H, dd, J = 2.0, 8.4 Hz, H-6), 6.77 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5), 7.12 (2H, d, J = 8.4 Hz, H2', H-6'), 6.70 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3', H-5'), 6.26 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-8), 5.17 (1H, dd, J = 2.8, 5.6 Hz, H-8'), 3.14 (1H, dd, J = 2.8, 9.6 Hz, H-7'a), 3.05 (1H, dd, J = 5.6, 9.6 Hz, H-7'b); 11 Figure 3.12 Chemical structure and 1D NMR data assigment of compound B10 3.3.11 Compound B11 (OSB-1.2.0): protocatechuic acid Comparing the NMR data of compound B11 with published data, led to the identifying structure of compound B11 as protocatechuic acid Figure 3.13 Chemical structure of compound B11 3.3.12 Hợp chất B12 (OSB-1.2.1): dihydrocaffeic acid Compound B12 was also identified as dihydrocaffeic acid based on the comparison of its 1D NMR data with published values Figure 3.14 Chemical structure and 1D NMR data assigment of compound B12 3.3.13 Compound B13 (OSB-1.2.2): p-hydroxybenzoic acid Comparing the NMR data of compound B13 with published data, led to the identifying structure of compound B13 as p-hydroxybenzoic acid Figure 3.15 Chemical structure of compound B13 3.3.14 Compound B14 (OSB-2.1.1): oresbiusin A Compound B12 was also identified as oresbiusin A by comparison of its 1D NMR data with published values Figure 3.16 Chemical structure and 1D NMR data assigment of compound B14 3.3.15 Compound B15 (OSB-2.1.2): Caffeic acid Based on the analysis of the 1H and 13C NMR data of compound B15 led to the structure determination of compound B15 to be caffeic acid Hình 3.17 Chemical structure and 1D NMR data assigment of compound B15 3.3.16 Compound B16 (OSB-2.3.1): Methyl 3,4-dihydroxycinnamate Comparison of the obtained NMR data with published value allowed the establishing structure of compound B16 to be methyl 3,4-dihydroxycinnamate 12 Figure 3.18 Chemical structure and 1D NMR data assigment of compound B16 3.3.17 Compound B17 (OSB-2.3.2): Vanillic acid Based on the analysis of the NMR data together with comparing with published data, the structure of compound B17 was thus characterized as vanilic acid Figure 3.19 Chemical structure of compound B17 3.4 Structural determination of compounds isolated from EtOAc fraction Figure 3.20 Chemical structure of compounds (E18‒E33) isolated from EtOAc fraction 3.4.1 Compound E18 (OSEA-12.1.1): 3,7,3′,4'-tetramethylquercetin Spectroscopic data of compound E18: CTPT: C19H18O7; KLPT: m/z = 358.10; IR νmax (MeOH): 3497, 3320, 2959, 1685, 1635, 1603, 1527, 1280, 1182, 1112, 853, 810 cm−1; UV (MeOH) λmax: 270 and 340 nm H NMR (400 MHz, acetone-d6) δH ppm: 6.87 (1H, br s, H-6), 6.78 (1H, br s, H-8), 7.63 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2ʹ), 7.15 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5ʹ), 7.71 (1H, dd, J = 2.0, 8.4 Hz, H-6ʹ), 3.80, 3.98, 3.93, 3.96 (3H, s, 3,7,3′,4′-OCH3); 13 C NMR (100 MHz, acetone-d6) δC ppm: 153.4 (C-2), 132.8 (C-3), 182.8 (C-4), 158.9 (C-5), 90.8 (C-6), 164.8 (C-7), 90.7 (C-8), 152.5 (C-9), 106.3 (C-10), 123.9 (C-1′), 111.3 (C-2′), 153.3 (C3′), 149.5 (C-4′), 108.9 (C-5′), 120.3 (C-6′), 61.1, 56.3, 56.3, 56.3 (3,7,3′,4′-OCH3) Based on the analysis of NMR data of compound E18 together with comparison of its NMR data with published values, led to the structure determination of compound E18 to be 5-hydroxy3,7,3′,4'-tetramethoxyflavone or 3,7,3′,4'-tetramethylquercetin Figure 3.21 Chemical structure of compound E18 13 3.4.2 Compound E19 (OSEA-11.9):3,5-dihydroxy-7,4'-dimethoxyflavone Spectroscopic data of compound E19: CTPT: C17H14O6; KLPT: m/z = 314.079; H NMR (400 MHz, acetone-d6) δH ppm: 6.87 (1H, br s, H-6), 6.70 (1H, br s, H-8), 8.03 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2ʹ/H-6ʹ), 7.12 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-3ʹ/5ʹ), 3.91 (3H, s, 4ʹ-OCH3), 3.99 (3H, s, 7OCH3), 7.58 (1H, br s, 3-OH), 12.69 (1H, s, 5-OH); 13 C NMR (100 MHz, acetone-d6) δC ppm: 151.2 (C-2), 136.5 (C-3), 183.5 (C-4), 163.7 (C-5), 104.2 (C-6), 164.8 (C-7), 91.6 (C-8), 147.3 (C-9), 106.5 (C-10), 131.3 (C-1ʹ), 129.0 (C-2ʹ/C-5′), 115.4 (C-3ʹ/C-4′), 56.8 (7-OCH3), 56.0 (4ʹ-OCH3) From the analysis of NMR data of compound E19 and the comparison of its NMR data with published values, compound E19 was thus identified as 3,5-dihydroxy-7,4'-dimethoxyflavone Figure 3.22 Chemical structure of compound E19 3.4.3 Compound E20 (OSEA-11.6.3): 5,7,4'-trimethoxyflavone hay 5,7,4'-trimethylapigenin Spectroscopic data of compound E20: CTPT: C18H16O5; KLPT: m/z = 312.0998; H NMR (400 MHz, CDCl3) δH ppm: 6.59 (1H, s, H-3), 6.54 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.35 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 7.81 (1H, br d, J = 9.0, H-2ʹ/ H-6ʹ), 6.98 (1H, br d, J = 9.0 Hz, H-5ʹ/ H-3ʹ), 3,86 (3H, s, 4′-OCH3), 3,89 (3H, s, 5-OCH3), 3,94 (3H, s, 7-OCH3) Based on the analysis of NMR data of compound E20 together with comparison of its NMR data with published values, led to the structure determination of compound E20 as 5,7,4′trimethoxyflavone or 5,7,4′-trimethylapigenin Figure 3.23 Chemical structure of compound E20 3.4.4 compound E21 (OSEA-11.1.5.1):pentamethylquercetin Spectroscopic data of compound E21: CTPT: C20H20O7; KLPT: m/z = 372.1209; IR νmax (MeOH): 3497, 3320, 2959, 1685, 1635, 1603, 1527, 1280, 1182, 1112, 853, 810 cm−1; H NMR (400 MHz, acetone-d6) δH ppm: 7.11 (1H, br s, H-6), 6.58 (1H, br s, H-8), 7.57 (1H, d, J = 1.6, H-2ʹ), 7.13 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-5ʹ), 7.64 (1H, dd, J = 1.6, 7.5 Hz, H-6ʹ), 3.82, 3.88, 4.00, 3.91, 3.95 (each 3H, s, 3, 5, 7, 3′, 4′-OCH3) Based on the analysis of NMR data of compound E21 together with comparison of its NMR data with published values, led to the structure determination of compound E21 to be pentamethylquercetin Figure 3.24 Chemical structure of compound E21 3.4.5 Compound E22 (OSEA-11.1.4.0): 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone Spectroscopic data of compound E22: CTPT: C18H16O6; KLPT: m/z = 328.0947; H NMR (400 MHz, acetone-d6) δH ppm: 6.88 (1H, br s, H-6), 6.74 (1H, br s, H-8), 8.05 (1H, br d, J = 9.0, H-2ʹ/ H-6ʹ), 7.13 (1H, br d, J = 9.0 Hz, H-5ʹ/ H-3ʹ), 3.80, 3.92, 3.99 (3H, s, -OCH3); 13 C NMR (100 MHz, acetone-d6) δC ppm: 154.2 (C-2), 135.6 (C-3), 183.6 (C-4), 163.9 (C-5), 104.4 (C-6), 165.0 (C-7), 92.1 (C-8), 154.0 (C-9), 106.6 (C-10), 1244 (C-1ʹ), 129.1 (C-2ʹ/ C-6ʹ), 115.5 (C-3ʹ/ C-5ʹ), 160.2 (C-4ʹ), 56.1 (4ʹ-OCH3), 56.9 (3-OCH3), 60.6 (7-OCH3) 14 From the analysis of NMR data of compound E22 and the comparison of its NMR data with published values, compound E22 was thus identified as 5-hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavone Figure 3.25 Chemical structure of compound E22 3.4.6 Compound E23 (OSEA-11.1.4.1): 3,5,7,4'-tetramethoxyflavone Spectroscopic data of compound E23: CTPT: C19H18O6; KLPT: m/z = 342.1103; H NMR (400 MHz, acetone-d6) δH ppm: 7.10 (1H, br s, H-6), 6.53 (1H, br s, H-8), 7.95 (1H, br d, J = 9.0, H-2ʹ/ H-6ʹ), 7.08 (1H, br d, J = 9.0 Hz, H-5ʹ/ H-3ʹ), 3.81, 3.87, 3.99, 3.89, (3H, s, 3, 5, 7, 4′-OCH3); 13 C NMR (100 MHz, acetone-d6) δC ppm: 152.3 (C-2), 141.3 (C-3), 176.5 (C-4), 163.2 (C-5), 107.2 (C-6), 161.5 (C-7), 97.7 (C-8), 153.2 (C-9), 113.6 (C-10), 124.6 (C-1ʹ), 128.5 (C-2ʹ/ C-6ʹ), 115.6 (C-3ʹ/ C-5ʹ), 158.8 (C-4ʹ), 55.9 (4ʹ-OCH3), 56.8 (3-OCH3), 61.5 (7-OCH3), 62.4 (5-OCH3) From the analysis of NMR data of compound E23 and the comparison of its NMR data with published values, compound E23 was thus identified as 3,5,7,4′-tetramethoxyflavone Figure 3.26 Chemical structure of compound E23 3.4.7 Compound E24 (OSEA-10.6.1):5,7,2′,5′-tetramethoxyflavone Spectroscopic data of compound E24: CTPT: C19H18O6; KLPT: m/z = 342.1103; H NMR (400 MHz, CDCl3) δH ppm: 6.58 (1H, s, H-3), 6.54 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.35 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 7.45 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2ʹ), 7.38 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, H-4ʹ), 6.92 (1H, d, d, J = 8.5 Hz, H5′), 3.89 (6H, s), 3.93 3,95 (each 3H, s, -OCH3); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δC ppm: 157.5 (C-2), 114.1 (C-3), 177.9 (C-4), 160.7 (C-5), 95.8 (C6), 163.8 (C-7), 92.6 (C-8), 159.8 (C-9), 109.0 (C-10), 120.9 (C-1ʹ), 114.4 (C-2ʹ), 152.1 (C-3ʹ), 116.6 (C4′), 112.7 (C-5′), 153.2 (C-6ʹ), 55.6 (5-OCH3), 56.3 (7-OCH3), 55.8 (3′-OCH3), 56.0 (6ʹ-OCH3) From the analysis of NMR data of compound E24 and the comparison of its NMR data with published values, compound E24 was thus identified as 5,7,2',5'-tetramethoxyflavone Figure 3.27 Chemical structure of compound E24 3.4.8 Compound E25 (OSEA-10.5.1):3-hydroxy-5,7,4′-trimethoxyflavone Spectroscopic data of compound E25: CTPT: C18H16O6; KLPT: m/z = 328,0947; H NMR (400 MHz, CDCl3) δH ppm: 6.80 (1H, br s, H-6), 6.57 (1H, br s, H-8), 7.79 (1H, br d, J = 8.7 Hz, H-2ʹ/ H-6ʹ), 6.97 (1H, br d, J = 8.7 Hz, H-5ʹ/ H-3ʹ), 3.86 (3H, s, 4′-OCH3), 3.99 (6H, s, 5/7-OCH3); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δC ppm: 152.1 (C-2), 136.8 (C-3), 177.2 (C-4), 161.6 (C-5), 107.0 (C-6), 162.3 (C-7), 96.4 (C-8), 152.3 (C-9), 112.4 (C-10), 124.1 (C-1ʹ), 127.8 (C-2ʹ/ C-6ʹ), 114.6 (C3ʹ/ C-5ʹ), 144.4 (C-4ʹ), 55.7 (4ʹ-OCH3), 56.6 (3-OCH3), 62.8 (7-OCH3) From the analysis of NMR data of compound E25 and the comparison of its NMR data with published values, compound E25 was thus identified as 3-hydroxy-5,7,4′-trimethoxyflavone 15 Figure 3.28 Chemical structure of compound E25 3.4.9 Compound E26 (OSEA-10.5.2):5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone Spectroscopic data of compound E26: CTPT: C19H18O6; KLPT: m/z = 342,1103; H NMR (400 MHz, CDCl3) δH ppm: 6.58 (1H, s, H-3), 6.54 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 6.35 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 7.30 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-2ʹ), 6.94 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5ʹ), 7.49 (1H, dd, J = 1.6, 8.4 Hz, H-6′), 3.90 (3H, s, 5-OCH3), 3.95 (9H, s, 7/3′/4′-OCH3); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δC ppm: 160.0 (C-2), 111.2 (C-3), 177.9 (C-4), 161.0 (C-5), 96.3 (C-6), 164.2 (C-7), 93.0 (C-8), 160.9 (C-9), 109.4 (C-10), 124.2 (C-1ʹ), 108.7 (C-2ʹ), 149.4 (C-3ʹ), 151.9 (C-4′), 108.1 (C-5′), 119.7 (C-6ʹ), 56.0 (5-OCH3), 56.7 (7-OCH3), 56.3 (3′-OCH3), 56.3 (4ʹ-OCH3) From the analysis of NMR data of compound E26 and the comparison of its NMR data with published values, compound E26 was thus identified as 5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone Figure 3.29 Chemical structure of compound E26 3.4.10 Compound E27 (OSEA-10.2.1):7-hydroxy-3,5,3′,4′-tetramethoxyflavone Spectroscopic data of compound E27: CTPT: C19H18O7; KLPT: m/z = 358.1053; UV (c 0.02, MeOH) λmax nm:272, 341; H NMR (400 MHz, CDCl3) δH ppm: 6.73 (1H, br s, H-6), 6.51 (1H, br s, H-8), 7.23 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2ʹ), 6.89 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5ʹ), 7.42 (1H, dd, J = 2.1, 8.4 Hz, H-6′), 3.90 (3H, s, 3OCH3), 3.89 (3H, s, 5-OCH3), 3.85 (3H, s, 3′-OCH3), 3.93 (3H, s, 4′-OCH3); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δC ppm: 152.5 (C-2), 140.3 (C-3), 177.2 (C-4), 157.7 (C-5), 107.3 (C6), 161.1 (C-7), 96.3 (C-8), 151.8 (C-9), 112.8 (C-10), 124.0 (C-1ʹ), 111.1 (C-2ʹ), 154.5 (C-3ʹ), 149.2 (C-4′), 108.5 (C-5′), 119.6 (C-6ʹ), 56.1 (3-OCH3), 61.1 (5-OCH3), 62.2 (7-OCH3), 56.4 (4′-OCH3) From the analysis of NMR data of compound E27 and the comparison of its NMR data with published values, compound E27 was thus identified as 7-hydroxy-3,5,3′,4′-tetramethoxyflavone Figure 3.30 Chemical structure of compound E27 3.4.11 Compound E28 (OSEA-10.2.2):7,3′,4′-trimethylquercetin Spectroscopic data of compound E28: CTPT: C19H18O7; KLPT: m/z = 358.1053; UV (c 0.02, MeOH) λmax nm: 270, 340; H NMR (400 MHz, acetone-d6) δH ppm: 6.89 (1H, br s, H-6), 6.69 (1H, br s, H-8), 7.53 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2ʹ), 7.14 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5ʹ), 7.59 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, H-6′), 3.80 (3H, s, 3′OCH3), 3.96 (3H, s, 4′-OCH3), 4.00 (3H, s, 7-OCH3), 8.09 (1H, s, 3-OH), 12.94 (1H, s, 5-OH); 13 C NMR (100 MHz, acetone-d6) δC ppm: 152.5 (C-2), 140.3 (C-3), 183.9 (C-4), 161.1 (C-5), 104.5 (C-6), 161.1 (C-7), 92.0 (C-8), 151.8 (C-9), 112.8 (C-10), 124.9 (C-1ʹ), 113.7 (C-2ʹ), 154.5 (C3ʹ), 149.2 (C-4′), 112.5 (C-5′), 119.8 (C-6ʹ), 56.5 (3-OCH3), 60.6 (7-OCH3), 56.9 (4′-OCH3) From the analysis of NMR data of compound E28 and the comparison of its NMR data with published values, compound E28 was thus identified as 3,5-dihydroxy-7,3′,4'-trimethoxyflavone hay 7,3′,4′-trimethylquercetin Figure 3.31 Chemical structure of compound E28 16 3.4.12 Compound E29 (OSEA-9.6.1): 3,5,3′-trihydroxy-7,4′-dimethoxyflavone Spectroscopic data of compound E29: CTPT: C17H14O6; KLPT: m/z = 314.079; H NMR (400 MHz, acetone-d6) δH ppm: 6.90 (1H, br s, H-6), 6.66 (1H, br s, H-8), 7.52 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2ʹ), 7.14 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5ʹ), 7.58 (1H, dd, J = 2.1, 8.4 Hz, H-6ʹ), 4.00 (3H, s, 7OCH3),3.94 (3H, s, 4ʹ-OCH3), 8.09 (1H, br s, 3-OH), 12.67 (1H, s, 5-OH); 13 C NMR (100 MHz, acetone-d6) δC ppm: 154.9 (C-2), 131.1 (C-3), 183.5 (C-4), 165.0 (C-5), 91.7 (C-6), 164.9 (C-7), 104.4 (C-8), 157.2 (C-9), 106.5 (C-10), 125.1 (C-1ʹ), 113.6 (C-2ʹ), 147.9 (C3ʹ), 151.7 (C-4′), 112.5 (C-5′), 119.7 (C-6ʹ), 56.9 (7-OCH3), 56.5 (4′-OCH3) Based on the analysis of NMR data of compound E29 together with comparison of its NMR data with published values, led to the structure determination of compound E29 to be 3,5,3′trihydroxy-7,4′-dimethoxyflavone Figure 3.32 Chemical structure of compound E29 3.4.13 Compound E30 (OSEA-9.6.2):5,7,3′,4′-tetramethylquercetin Spectroscopic data of compound E30: CTPT: C19H18O7; KLPT: m/z = 358.10; UV (c 0.02, MeOH) λmax nm: 273, 344; H NMR (400 MHz, acetone-d6) δH ppm: 7.14 (1H, br s, H-6), 6.52 (1H, br s, H-8), 7.48 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2ʹ), 7.12 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5ʹ), 7.52 (1H, dd, J = 2.1, 8.4 Hz, H-6′), 3.82 (3H, s, 3′OCH3), 3.87 (3H, s, 5-OCH3),3.94 (3H, s, 4′-OCH3), 4.01 (3H, s, 7-OCH3), 8.07 (1H, br s, 3-OH); 13 C NMR (100 MHz, acetone-d6) δC ppm: 153.3 (C-2), 141.4 (C-3), 176.6 (C-4), 158.9 (C-5), 107.4 (C-6), 161.7 (C-7), 97.8 (C-8), 155.4 (C-9), 113.6 (C-10), 125.3 (C-1ʹ), 113.4 (C-2ʹ), 147.9 (C-3ʹ), 151.3 (C4′), 112.5 (C-5′), 119.2 (C-6ʹ), 61.5 (5-OCH3), 62.4 (7-OCH3), 56.8 (3′-OCH3), 56.5 (4′-OCH3) Based on the analysis of NMR data of compound E30 together with comparison of its NMR data with published values, led to the structure determination of compound E30 to be 5,7,3′,4′tetramethylquercetin Figure 3.33 Chemical structure of compound E30 3.4.12 Compound E31 (OSEA-9.6.3):5,7,4′-trimethylquercetin Spectroscopic data of compound E31: CTPT: C19H18O7; KLPT: m/z = 358.1053; H NMR (acetone-d6, 400 MHz) δH ppm: 7.12 (1H, br s, H-6), 6.51 (1H, br s, H-8), 7.48 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2ʹ), 7.12 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5ʹ), 7.52 (1H, dd, J = 2.1, 8.4 Hz, H-6′), 3.87 (3H, s, 5OCH3), 3.94 (3H, s, 4′-OCH3), 4.01 (3H, s, 7-OCH3), 8.03 (1H, br s, 3-OH); 13 C NMR (acetone-d6, 100 MHz) δC ppm: 154.9 (C-2), 131.1 (C-3), 183.5 (C-4), 165.0 (C-5), 104.4 (C-6), 164.9 (C-7), 91.7 (C-8), 157.2 (C-9), 106.5 (C-10), 125.1 (C-1ʹ), 113.6 (C-2ʹ), 147.9 (C3ʹ), 151.7 (C-4′), 112.5 (C-5′), 119.7 (C-6ʹ), 60.5 (5-OCH3), 56.5 (7-OCH3), 56.9 (4′-OCH3) From the analysis of NMR data of compound E31 and the comparison of its NMR data with published values, compound E31 was thus identified as 3,3′-dihydroxy-5,7,4'-trimethoxyflavone or 5,7,4′-trimethylquercetin Figure 3.34 Chemical structure of compound E31 3.4.12 Compound E32 (OSEA-9.6.11): 5,6,7,3',4'-pentamethoxyflavanone Spectroscopic data of compound E32: CTPT: C20H22O7; KLPT: m/z = 374,1366; H NMR (acetone-d6, 400 MHz) δH ppm: 5.45 (1H, dd, J = 3.0, 12.6 Hz, H-2), 3.00 (1H, dd, J = 12.6, 16.2 Hz, H-3ax), 2.70 (1H, dd, J = 3.0, 16.2 Hz, H-3eq), 6.38 (1H, s, H-8), 7.20 (1H, d, J = 1.8 17 Hz, H-2ʹ), 6.99 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5ʹ), 7.08 (1H, dd, J = 1.8, 8.4 Hz, H-6ʹ), 3.83 (3H, s, 4′-OCH3), 3.84 (3H, s, 3′-OCH3), 3.85 (3H, s, 5-OCH3), 3.70 (3H, s, 6-OCH3), 3.94 (3H, s, 7-OCH3); 13 C NMR (acetone-d6, 100 MHz) δC ppm: 79.9 (C-2), 46.4 (C-3), 188.5 (C-4), 158.8 (C-5), 133.1 (C-6), 159.7 (C-7), 91.1 (C-8), 158.9 (C-9), 112.4 (C-10), 124.1 (C-1ʹ), 127.8 (C-2ʹ), 150.5 (C3ʹ), 150.6 (C-4ʹ), 114.6 (C-5ʹ), 128.9 (C-6ʹ), 56.2 (4ʹ-OCH3), 56.2 (3ʹ-OCH3), 56.4 (7-OCH3), 56.6 (5OCH3), 60.9 (6-OCH3) From the analysis of NMR data of compound E32 and the comparison of its NMR data with published values, compound E32 was thus identified as 5,6,7,3',4'-pentamethoxyflavanone Figure 3.35 Chemical structure of compound E32 3.4.12 Compound E33 (OSEA-9.6.12): 5′-hydroxy-5,7,3′,4′-tetramethoxyflavanone Spectroscopic data of compound E33: CTPT: C19H20O7; KLPT: m/z = 360.1209; H NMR (acetone-d6, 400 MHz) δH ppm: 5.45 (1H, dd, J = 3.0, 12.6 Hz, H-2), 3.00 (1H, dd, J = 12.6, 16.2 Hz, H-3ax), 2.70 (1H, dd, J = 3.0, 16.2 Hz, H-3eq), 6.98 (1H, s, H-6), 6.44 (1H, s, H-8), 7.05 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-2ʹ), 6.97 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-6ʹ), 3.73 (3H, s, 4′-OCH3), 3.84 (3H, s, 3′OCH3), 3.87 (3H, s, 5-OCH3), 3.92 (3H, s, 7-OCH3); From the analysis of NMR data of compound E33 and the comparison of its NMR data with published values, compound E33 was thus identified as 5′-hydroxy-5,7,3′,4′-tetramethoxyflavanone Figure 3.36 Chemical structure of compound E33 3.5 Structural determination of compounds isolated from CHCl3 fraction Figure 3.37 Chemical structure of compounds (C34‒C40) isolated from CHCl3 fraction 18 3.5.1 Compound C34 (OSC-1.5): orthosiphol F Spectroscopic data of compound C34: CTPT: C38H44O11; KLPT: m/z = 676.2884; H NMR (acetone-d6, 500 MHz) δH ppm: 5.21 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-1), 5.52 (1H, dd, J = 2.0, 4.0 Hz, H-2), 4.97 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-3), 2.83 (1H, dd, J = 2.0, 13.5 Hz, H-5), 2.11 (1H, m, H-6a), 1.81 (1H, m, H-6b), 4.39 (1H, dd, J = 3.5, 6.0 Hz, H-7), 3.20 (1H, d, J = 5.5 Hz, H-9), 5.68 (1H, m, H-11), 2.71 (1H, dd, J = 4.5, 15.5 Hz, H-12a), 2.02 (1H, dd, J = 2.0, 15.5 Hz, H-12b), 5.72 (1H, dd, J = 11.0, 17.5 Hz, H-15), 4.94 (1H, dd, J = 0.5, 17.5 Hz, H-16a), 4.66 (1H, dd, J = 0.5, 11.0 Hz, H16b), 1.16 (3H, s, H-17), 0.96 (3H, s, H-18), 1.15 (3H, s, H-19), 1.53 (3H, s, H-20), 7.66 (2H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz, H-2/6), 7.33 (2H, t, J = 8.0 Hz, H-3/5), 7.56 (1H, m, H-4), 1.70 (3H, s, 2-OCOCH3), 1.47 (3H, s, 3-OCOCH3), 3.99 (1H, d, J = 4.5 Hz, 7-OH), 5.16 (1H, br s, 8-OH), 7.51 (2H, dd, J = 0.5, 8.0 Hz, H-2/6), 7.07 (2H, t, J = 8.0 Hz, H-3/5), 7.56 (1H, m, H-4); 13 C NMR (acetone-d6, 125 MHz) δC ppm:73.1 (C-1), 67.5 (C-2), 76.9 (C-3), 38.2 (C-4), 36.2 (C-5), 24.7 (C-6), 68.4 (C-7), 78.1 (C-8), 42.4 (C-9), 49.8 (C-10), 70.1 (C-11), 40.3 (C-12), 48.3 (C-13), 211.4 (C14), 143.9 (C-15), 113.2 (C-16), 27.4 (C-17), 28.2 (C-18), 22.8 (C-19), 17.5 (C-20), 131.8 (C-1), 130.6 (C2/6), 128.9 (C-3/5), 133.4 (C-4), 165.4 (C-7), 170.2 (2-OCOCH3), 20.8 (2-OCOCH3), 170.7 (3OCOCH3), 20.5 (3-OCOCH3), 130.6 (C-1), 130.3 (C-2/6), 128.5 (C-3/5), 132.9 (C-4), 166.3 (C-7) Based on the analysis of the NMR data of compound E34 together with the comparison of its NMR data with published values, led to the structural determination of compound E34 to be orthosiphol F Figure 3.38 Chemical structure of compounds C34 3.5.2 Compound C35 (OSC-1.4.4): siphonol D Spectroscopic data of compound C35: CTPT: C40H46O13; KLPT: m/z = 734,2938; H NMR (acetone-d6, 500 MHz) δH ppm:5.67 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-1), 5.44 (1H, dd, J = 2.0, 4.0 Hz, H-2), 4.98 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-3), 2.97 (1H, dd, J = 3.0, 13.5 Hz, H-5), 2.83 (1H, m, H-6a), 1.83 (1H, m, H-6b), 4.43 (1H, dd, J = 4.0, 6.0 Hz, H-7), 3.35 (1H, d, J = 5.5 Hz, H-9), 6.05 (1H, m, H-11), 2.75 (1H, dd, J = 5.5, 15.0 Hz, H-12a), 2.04 (1H, dd, J = 1.0, 15.0 Hz, H-12b), 5.73 (1H, dd, J = 10.5, 17.5 Hz, H-15), 4.95 (1H, dd, J = 0.5, 17.5 Hz, H-16a), 4.58 (1H, dd, J = 0.5, 10.5 Hz, H16b), 1.16 (3H, s, H-17), 0.99 (3H, s, H-18), 1.10 (3H, s, H-19), 5.22 (1H, d, J = 13.0 Hz, H-20a), 4.14 (1H, d, J = 13.0 Hz, H-20b), 7.76 (2H, dd, J = 1.5, 8.5 Hz, H-2/6), 7.37 (2H, t, J = 8.5Hz, H3/5), 7.57 (1H, m, H-4), 1.74 (3H, s, 2-OCOCH3), 1.47 (3H, s, 3-OCOCH3), 4.43 (1H, br s, 7-OH), 5.10 (1H, br s, 8-OH), 7.53 (2H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, H-2/6), 7.11 (2H, t, J = 8.0 Hz, H-3/5), 7.42 (1H, m, H-4), 2.20 (3H, s, 20-OCOCH3); 13 C NMR (acetone-d6, 125 MHz) δC ppm:70.9 (C-1), 68.4 (C-2), 76.6 (C-3), 37.9 (C-4), 36.3 (C-5), 24.6 (C-6), 69.9 (C-7), 78.2 (C-8), 42.4 (C-9), 48.1 (C-10), 68.2 (C-11), 40.0 (C-12), 48.4 (C13), 211.3 (C-14), 143.8 (C-15), 113.4 (C-16), 27.7 (C-17), 28.5 (C-18), 22.6 (C-19), 63.9 (C-20), 132.0 (C-1), 130.7 (C2/6), 129.0 (C-3/5), 133.6 (C-4), 165.3 (C-7), 170.0 (2-OCOCH3), 20.7 (2OCOCH3), 170.7 (3-OCOCH3), 20.5 (3-OCOCH3), 131.7 (C-1), 130.4 (C-2/6), 128.6 (C-3/5), 132.9 (C-4), 166.3 (C-7), 171.2 (20-OCOCH3), 21.2 (20-OCOCH3) Based on the analysis of the NMR data of compound E35 together with the comparison of its NMR data with published values, led to the structural determination of compound E35 to be siphonol D 19 Hình 3.39 Chemical structure of compounds C35 3.5.3 Compound C36 (OSC-1.4.3): siphonol B Spectroscopic data of compound C36: CTPT: C38H44O12; KLPT: m/z = 692,2833; H NMR (acetone-d6, 500 MHz) δH ppm:H: 5.60 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-1), 5.72 (1H, dd, J = 2.0, 4.0 Hz, H-2), 4.97 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-3), 2.92(1H, dd, J = 3.0, 13.5 Hz, H-5), 2.16 (1H, m, H-6a), 1.80 (1H, m, H-6b), 4.32 (1H, dd, J = 3.0, 6.0 Hz, H-7), 3.35 (1H, d, J = 5.5 Hz, H-9), 5.88 (1H, m, H-11), 2.77 (1H, dd, J = 4.0, 15.5 Hz, H-12a), 2.20 (1H, dd, J = 1.5, 15.5 Hz, H-12b), 5.76 (1H, dd, J = 10.5, 17.5 Hz, H-15), 4.88 (1H, dd, J = 0.5, 17.5 Hz, H-16a), 4.53 (1H, dd, J = 0.5, 10.5 Hz, H-16b), 1.23 (3H, s, H-17), 0.97 (3H, s, H-18), 1.18 (3H, s, H-19), 4.46 (1H, d, J = 13.0 Hz, H-20a), 4.14 (1H, d, J = 13.0 Hz, H-20b), 7.67 (2H, dd, J = 1.0, 8.5 Hz, H-2/6), 7.26 (2H, t, J = 8.5Hz, H-3/5), 7.49 (1H, m, H-4), 1.72 (3H, s, 2-OCOCH3), 1.50 (3H, s, 3-OCOCH3), 3.93 (1H, d, J = 3.0 Hz, 7-OH), 5.16 (1H, br s, 8OH), 7.45 (2H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, H-2/6), 7.03 (2H, t, J = 8.0 Hz, H-3/5), 7.35 (1H, m, H-4); 13 C NMR (acetone-d6, 125 MHz) δC ppm:70.6 (C-1), 68.6 (C-2), 76.9 (C-3), 38.0 (C-4), 36.4 (C-5), 24.8 (C-6), 68.7 (C-7), 77.6 (C-8), 43.9 (C-9), 49.8 (C-10), 70.9 (C-11), 39.0 (C-12), 48.4 (C-13), 212.6 (C14), 144.1 (C-15), 112.8 (C-16), 28.7 (C-17), 28.3 (C-18), 22.0 (C-19), 62.5 (C-20), 132.0 (C-1), 130.7 (C2/6), 129.0 (C-3/5), 133.6 (C-4), 165.3 (C-7), 169.9 (2-OCOCH3), 20.7 (2-OCOCH3), 170.7 (3OCOCH3), 20.6 (3-OCOCH3), 131.7 (C-1), 130.4 (C-2/6), 128.6 (C-3/5), 132.9 (C-4), 166.3 (C-7) Based on the analysis of the NMR data of compound E36 together with the comparison of its NMR data with published values, led to the structural determination of compound E36 to be siphonol B Hình 3.40 Chemical structure of compounds C36 3.5.4 Compound C37 (OSC-1.5.3): orthosiphol I Spectroscopic data of compound C37: CTPT: C31H38O10; KLPT: m/z = 570,2465; H NMR (acetone-d6, 500 MHz) δH ppm:6.35 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-1), 5.57 (1H, dd, J = 3.0, 4.0 Hz, H-2), 4.50 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-3), 2.67 (1H, dd, J = 2.0, 12.5 Hz, H-5), 2.04 (1H, m, H-6a), 1.77 (1H, m, H-6b), 4.23 (1H, m, H-7), 3.63 (1H, s, H-9), 2.65 (1H, d, J = 18.0 Hz, H-12a), 2.55 (1H, d, J = 18.0 Hz, H-12b), 5.41 (1H, dd, J = 10.5, 17.5 Hz, H-15), 4.71 (1H, dd, J = 1.0, 17.5 Hz, H16a), 4.10 (1H, dd, J = 1.0, 10.5 Hz, H-16b), 1.06 (3H, s, H-17), 0.95 (3H, s, H-18), 1.14 (3H, s, H19), 1.45 (3H, s, H-20), 8.10 (2H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz, H-2/6), 7.52 (2H, t, J = 8.0 Hz, H-3/5), 7.56 (1H, m, H-4), 1.86 (3H, s, 2-OCOCH3), 1.72 (3H, s, 3-OCOCH3); 13 C NMR (acetone-d6, 125 MHz) δC ppm:74.4 (C-1), 67.0 (C-2), 76.9 (C-3), 38.0 (C-4), 35.5 (C-5), 24.8 (C-6), 68.7 (C-7), 78.6 (C-8), 52.4 (C-9), 43.8(C-10), 207.4 (C-11), 48.1 (C-12), 45.0 (C13), 209.6 (C-14), 140.8 (C-15), 115.8 (C-16), 25.5 (C-17), 28.3 (C-18), 22.7 (C-19), 17.0 (C-20), 131.7 (C-1), 130.8 (C2/6), 129.2 (C-3/5), 133.8 (C-4), 165.1 (C-7), 170.1 (2-OCOCH3), 24.9 (2OCOCH3), 170.8 (3-OCOCH3), 25.0 (3-OCOCH3) Based on the analysis of the NMR data of compound E37 together with the comparison of its NMR data with published values, led to the structural determination of compound E37 to be orthosiphol I 20 Hình 3.41 Chemical structure of compounds C37 3.5.5 Compound C38 (OSC-1.5.2): orthosiphol G Spectroscopic data of compound C38: CTPT: C31H40O10; KLPT: m/z = 572,2621; H NMR (acetone-d6, 500 MHz) δH ppm:5.64 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-1), 5.50 (1H, dd, J = 2.5, 3.0 Hz, H-2), 4.97 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-3), 2.75 (1H, dd, J = 2.0, 13.0 Hz, H-5), 2.01 (1H, m, H-6a), 1.72 (1H, m, H-6b), 4.23 (1H, m, H-7), 2.78 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-9), 4.48 (1H, m, H-11), 2.26 (1H, dd, J = 5.0, 14.0 Hz, H-12a), 1.74 (1H, dd, J = 4.0, 14.0 Hz, H-12b), 5.92 (1H, dd, J = 11.0, 17.5 Hz, H-15), 4.90 (1H, dd, J = 1.0, 17.5 Hz, H-16a), 4.59 (1H, dd, J = 1.0, 11.0 Hz, H-16b), 1.15 (3H, s, H-17), 0.95 (3H, s, H-18), 1.15 (3H, s, H-19), 1.49 (3H, s, H-20), 8.10 (2H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz, H-2/6), 7.47 (2H, t, J = 8.0 Hz, H-3/5), 7.58 (1H, m, H-4), 1.89 (3H, s, 2-OCOCH3), 1.59 (3H, s, 3-OCOCH3); 13 C NMR (acetone-d6, 125 MHz) δC ppm:75.2 (C-1), 67.9 (C-2), 77.2 (C-3), 38.2 (C-4), 36.1 (C-5), 24.8 (C-6), 68.8 (C-7), 78.5 (C-8), 45.0 (C-9), 44.5 (C-10), 64.7 (C-11), 45.0 (C-12), 49.3 (C13), 212.3 (C-14), 143.3 (C-15), 113.8 (C-16), 26.7 (C-17), 28.4 (C-18), 23.0 (C-19), 16.8 (C-20), 133.0 (C-1), 130.5 (C2/6), 129.0 (C-3/5), 133.1 (C-4), 165.8 (C-7), 170.5 (2-OCOCH3), 21.1 (2OCOCH3), 170.7 (3-OCOCH3), 20.6 (3-OCOCH3) Based on the analysis of the NMR data of compound E38 together with the comparison of its NMR data with published values, led to the structural determination of compound E38 to be orthosiphol G Hình 3.42 Chemical structure of compounds C38 3.5.6 Compound C39 (OSC-1.3.2): orthosiphol B Spectroscopic data of compound C39: CTPT: C38H44O11; KLPT: m/z = 676,288; H NMR (acetone-d6, 500 MHz) δH ppm:4.92 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-1), 4.43 (1H, dd, J = 2.0, 4.0 Hz, H-2), 4.95 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-3), 2.50 (1H, dd, J = 2.5, 13.5 Hz, H-5), 2.10 (1H, m, H-6a), 1.96 (1H, m, H-6b), 5.47 (1H, dd, J = 2.0, 3.5 Hz, H-7), 3.30 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-9), 5.88 (1H, m, H-11), 2.66 (1H, dd, J = 5.0, 15.5 Hz, H-12a), 1.95 (1H, dd, J = 1.0, 15.5 Hz, H-12b), 5.79 (1H, dd, J = 10.5, 17.5 Hz, H-15), 4.91 (1H, dd, J = 0.5, 17.5 Hz, H-16a), 4.77 (1H, dd, J = 0.5, 10.5 Hz, H-16b), 1.12 (3H, s, H-17), 0.88 (3H, s, H-18), 1.13 (3H, s, H-19), 1.57 (3H, s, H-20), 8.04 (2H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz, H2/6), 7.47 (2H, t, J = 8.0 Hz, H-3/5), 7.60 (1H, m, H-4), 1.40 (3H, s, 3-OCOCH3), 2.19 (3H, s, 7OCOCH3), 7.89 (2H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, H-2/6), 7.13 (2H, t, J = 8.0 Hz, H-3/5), 7.43 (1H, m, H-4); 13 C NMR (acetone-d6, 125 MHz) δC ppm:79.1 (C-1), 66.2 (C-2), 79.2 (C-3), 38.0 (C-4), 37.4 (C-5), 22.0 (C-6), 71.3 (C-7), 76.0 (C-8), 42.4 (C-9), 48.1 (C-10), 69.8 (C-11), 40.7 (C-12), 48.5 (C-13), 207.6 (C14), 143.5 (C-15), 113.7 (C-16), 26.5 (C-17), 28.2 (C-18), 23.0 (C-19), 17.0 (C-20), 132.0 (C-1), 130.7 (C2/6), 129.0 (C-3/5), 133.6 (C-4), 167.6 (C-7), 170.7 (3-OCOCH3), 20.5 (3-OCOCH3), 169.9 (7OCOCH3), 21.3 (7-OCOCH3), 131.7 (C-1), 130.4 (C-2/6), 128.6 (C-3/5), 132.9 (C-4), 166.3 (C-7) Based on the analysis of the NMR data of compound E39 together with the comparison of its NMR data with published values, led to the structural determination of compound E39 to be orthosiphol B 21 Hình 3.43 Chemical structure of compounds C39 3.5.7 Compound C40 (OSC-1.3.1): orthosiphol N Spectroscopic data of compound C40: CTPT: C36H40O10; KLPT: m/z = 632,2621; H NMR (acetone-d6, 500 MHz) δH ppm:6.43 (1H, d, J = 3.5 Hz, H-1), 5.74 (1H, dd, J = 3.5, 4.0 Hz, H-2), 5.31 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-3), 2.86 (1H, dd, J = 3.0, 13.0 Hz, H-5), 2.10 (1H, m, H-6a), 1.82 (1H, m, H-6b), 4.44 (1H, m, H-7), 3.66 (1H, s, H-9), 2.65 (1H, d, J = 17.5 Hz, H-12a), 2.55 (1H, d, J = 17.5 Hz, H12b), 5.42 (1H, dd, J = 10.5, 17.5 Hz, H-15), 4.79 (1H, d, J = 17.5 Hz, H-16a), 4.10 (1H, d, J = 10.5 Hz, H16b), 1.23 (3H, s, H-17), 1.01 (3H, s, H-18), 1.11 (3H, s, H-19), 1.50 (3H, s, H-20), 8.04 (2H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz, H-2/6), 7.47 (2H, t, J = 8.0 Hz, H-3/5), 7.60 (1H, m, H-4), 1.86 (3H, s, 2-OCOCH3), 7.89 (2H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, H-2/6), 7.13 (2H, t, J = 8.0 Hz, H-3/5), 7.43 (1H, m, H-4); 13 C NMR (acetone-d6, 125 MHz) δC ppm:75.0 (C-1), 66.9 (C-2), 77.6 (C-3), 38.6 (C-4), 35.7 (C-5), 24.8 (C-6), 68.2(C-7), 78.5 (C-8), 52.2 (C-9), 44.3 (C-10), 208.0 (C-11), 48.9 (C-12), 50.0 (C13), 208.9 (C-14), 140.7 (C-15), 116.5 (C-16), 25.8 (C-17), 28.5 (C-18), 23.0 (C-19), 17.5 (C-20), 131.7 (C-1), 130.7 (C2/6), 129.0 (C-3/5), 133.6 (C-4), 167.0 (C-7), 170.1 (2-OCOCH3), 21.0 (2OCOCH3), 130.8 (C-1), 130.4 (C-2/6), 128.6 (C-3/5), 132.9 (C-4), 170.1 (C-7) The 1H-NMR and 13C-NMR spectra of compound C40 were similar with those of compound C37 (orthosiphol I) except for the replacement of an acetyl group in compound C37 by a benzoyl moiety at C-3 in compound C40 Thus, compound C40 was identified as orthosiphol N Figure 3.44 Chemical structure of compound C40 3.6 Biological activity of isolated compounds 3.6.1 Biological activity of phenylpropanoids (B1-B17) isolated from BuOH fraction Table 3.10 PTP1B inhibitory activity of total extract and phenylpropanoids (B1B17) Inhibition Inhibition No Compounds No Compounds a (IC50, μM) (IC50, μM)a Compound B1 (OSB-7.4.2) 1.53 ± 0.24 11 Compound B11 (OSB-1.2.0) > 30 Compound B2 (OSB-7.4.4) 19.50 ± 1.09 12 Compound B12 (OSB-1.2.1) > 30 Compound B3 (OSB-7.5.4) 8.26 ± 1.78 13 Compound B13 (OSB-1.2.2) > 30 Compound B4 (OSB-3.3.1) 5.08 ± 0.90 14 Compound B14 (OSB-2.1.1) > 30 Compound B5 (OSB-3.3.2) 9.29 ± 0.52 15 Compound B15 (OSB-2.1.2) 27.05 ± 1.94 Compound B6 (OSB-3.3.3) 11.82 ± 0.64 16 Compound B16 (OSB-2.3.1) 36.12 ± 0.89 Compound B7 (OSB-7.1.2) 9.79 ± 2.67 17 Compound B17 (OSB-2.3.2) > 30 Compound B8 (OSB-7.4.2.1) > 30 18 62.06 ± 0.19 OS-MeOH Compound B9 (OSB-7.1.1) 23.91 ± 1.51 19 3.42 ± 0.97 Ursolic acidb 22 12000 Glucose uptake (fold of induction) 10000 8000 6000 4000 2000 Compounds treatment (10 μM) Figure 3.45 2-NBDG glucose uptake stimulatory effects in 3T3-L1 adipocytes of isolated phenylpropanoids (B1‒ B17) isolated from BuOH fraction 3.6.2 Biological activity of flavonoids (E18E33) isolated from EtOAc fraction Table 3.21 PTP1B inhibitory activity of flavonoids (E18E33) isolated from EtOAc fraction Inhibition Inhibition No Compounds No Compounds a (IC50, μM) (IC50, μM)a Compound E18 (OSEA-12.1.1) > 30 Compound E26 (OSEA-10.5.2) > 30 Compound E19 (OSEA-11.9) 16.92 ± 2.12 10 Compound E27 (OSEA-10.2.1) 22.25 ± 1.71 Compound E20 (OSEA-11.6.3) > 30 11 Compound E28 (OSEA-10.2.2) > 30 Compound E21 (OSEA-11.1.5.1) > 30 12 Compound E29 (OSEA-9.6.1) > 30 Compound E22 (OSEA-11.1.4.0) > 30 13 Compound E30 (OSEA-9.6.2) 8.92 ± 0.72 Compound E23 (OSEA-11.1.4.1) > 30 14 Compound E31 (OSEA-9.6.3) 10.12 ± 1.09 Compound E24 (OSEA-10.6.1) > 30 15 Compound E32 (OSEA-9.6.1.1) 6.88 ± 0.76 Compound E25 (OSEA-10.5.1) > 30 16 Compound E33 (OSEA-9.6.1.2) 9.76 ± 0.66 Compound E26 (OSEA-10.5.2) > 30 17 3.42 ± 0.97 Ursolic acidb Table 33.12 Cytotoxic activity of flavonoids (E18E33) isolated from EtOAc fraction on human breast cancer cells: Inhibition activity (IC50, µM)a Compounds MCF7 MCF7/TAMR MDA-MB-231 E18 (OSEA-12.1.1) > 30 > 30 > 30 E19 (OSEA-11.9) > 30 14.3 ± 1.1 27.3 ± 0.8 E20 (OSEA-11.6.3) > 30 > 30 > 30 E21 (OSEA-11.1.5.1) > 30 > 30 > 30 E22 (OSEA-11.1.4.0) > 30 > 30 > 30 E23 (OSEA-11.1.4.1) > 30 > 30 > 30 E24 (OSEA-10.6.1) 25.6 ± 1.3 > 30 > 30 E25 (OSEA-10.5.1) > 30 > 30 > 30 E26 (OSEA-10.5.2) 14.8 ± 0.9 > 30 > 30 E27 (OSEA-10.2.1) 15.7 ± 1.9 > 30 > 30 E28 (OSEA-10.2.2) > 30 > 30 > 30 E29 (OSEA-9.6.1) > 30 > 30 > 30 E30 (OSEA-9.6.2) 28.4 ± 1.6 9.7 ± 0.4 15.8 ± 0.2 E31 (OSEA-9.6.3) 22.9 ± 0.6 10.8 ± 0.2 > 30 E32 (OSEA-9.6.1.1) 11.5 ± 0.7 8.9 ± 1.0 17.6 ± 1.2 E33 (OSEA-9.6.1.2) 15.4 ± 1.6 10.5 ± 0.7 21.3 ± 0.9 b Tamoxifen 11.9 ± 0.4 12.1 ± 0.7 12.7 ± 0.6 23 3.6.3 Biological activity of pimarane-diterpenes (C34C40) isolated from CHCl3 fraction Table 3.13 PTP1B inhibitory activity of pimarane-diterpenes (C34C40) isolated from CHCl3 fraction Inhibitory activity No Compounds (IC50, μM)a Compound C34 (OSC-1.5) 27.56 ± 2.99 Compound C35 (OSC-1.4.4) 24.75 ± 1.12 Compound C36 (OSC-1.4.3) 8.18 ± 0.41 Compound C37 (OSC-1.5.3) 0.33 ± 0.07 Compound C38 (OSC-1.5.2) 3.82 ± 0.20 Compound C39 (OSC-1.3-2) 9.84 ± 0.33 Compound C40 (OSC-1.3-1) 1.60 ± 0.17 b 3.42 ± 0.97 Ursolic acid 2.00 Glucose uptake (fold of induction) 1.80 1.60 1.40 1.20 µM 1.00 10 µM 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 Figure 3.46 2-NBDG glucose uptake stimulatory effects in 3T3-L1 adipocytes of isolated pimaranediterpenes (C34‒C40) isolated from CHCl3 fraction 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 Figure 3.47 Cytotoxicity of pimarane diterpene (C33–C40) on 3T3-L1 adipocyte cells 24 CONCLUSIONS Study on the chemical constituents and biological activities of O stamineus Benth has been obtanied some scientific results as: Collected and identified the scientific name of the studied plant species as Cat’s whiskers (Orthosiphon spiralis (Lour) Merr.), Lamiaceae family, with some synonym including Orthosiphon stamineus Benth., Orthosiphon aristatus (Blume) Miq., and Clerodendranthus spicatus (Thunb.) C.Y.Wu From the total extract of the plant, 40 natural compounds have been isolated and purified Chemical structure of the isolated compounds were identified by using analyses of their IR, UV, 1D-NMR (1H- and 13C-NMR), 2D-NMR (COSY, HMQC, HMBC, NOESY), and MS data, Among them, a new natural product has been identified Specifically: - 08 phenylpropanoids were the lithospermic acid and rosmarinic acid (B1–B8) derivatives: lithospermic acid (B1); orthospilarate (B2) (new compound); 9-Methyl lithospermate (B3); (S)-rosmarinic acid (B4); (R)rosmarinic acid (B5); methyl rosmarinate (B6); clinopodic acid A (B7); and clinopodic acid B (B8) - 07 caffeic acid and benzoic acid derivatives (B10–B17) including: 3-(3,4-dihydroxyphenyl)lactic acid (B10), protocatechuic acid (B11), dihydrocaffeic acid (B12), p-hydroxybenzoic acid (B13), oresbiusin A (B14), caffeic acid (B15), methyl 3,4-dihydroxycinnamate (B16), and vanillic acid (B17) - 17 flavonoids (B9, E18–E33): astragalin (B9); 3,7,3′,4'-tetramethylquercetin (E18);3,5-dihydroxy-7,4'dimethoxyflavone (E19) ;5,7,4'-trimethoxyflavone hay 5,7,4'-trimethylapigenin (E20); pentamethylquercetin (E21); 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone (E22); 3,5,7,4'-tetramethoxyflavone (E23); 5,7,2′,5′tetramethoxyflavone (E248); 3-hydroxy-5,7,4′-trimethoxyflavone (E25); 5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone (E26); 7-hydroxy-3,5,3′,4′-tetramethoxyflavone (E27); 7,3′,4′-trimethylquercetin (E28); 3,5,3′-trihydroxy-7,4′dimethoxyflavone (E29); 5,7,3′,4′-tetramethylquercetin (E30); 5,7,4′-trimethylquercetin (E31); 5,6,7,3',4'pentamethoxyflavanone (E328); and 5′-hydroxy-5,7,3′,4′-tetramethoxyflavanone (E33) - 07 pimarane-diterpen (C34–C40) including: orthosiphol F (C34); siphonol D (C35); siphonol B (C36); orthosiphol I (C37); orthosiphol G (C38); orthosiphol B (C39); orthosiphol N (C40) All of the 40 isolated compounds were tested for their biological activities: 4.1 PTP1B inhibitory activity of 40 compounds and the extract from O stamineus Among the isolates, phenylpropanoids (B1 – B8) showed strong PTP1B inhibitory activity with IC50 ranging from 1.53 to 11.82 μM, except for the new compound B2 and compound B8 with little IC50 values of 19.50 ± 1.09 and > 30 μM The caffeic acid and benzoic acid derivatives (B10 – B17) displayed weak or no activity (IC50 ≥ 30 μM) The flavonoids (B9, E18 – E33) showed weaker activities, there were 04 compounds (E30 – E33) showing remarkable activity with IC50 ranging from 6.88 to 10.12 μM, while the other flavonoids showed no activity (IC50 > 30 μM) All of the pimarane-diterpenes (C34 – C40) isolated from the chloroform fraction showed potential inhibitory activity with IC50 ranging from 0.33 to 9.84 μM against PTP1B activity, except for the two compounds C34 (IC50 27.56 ± 2.99 μM) and C35 (IC50 24.75 ± 1.12 μM) 4.2 When investigated the 2-NBDG glucose uptake effects on 3T3-L1 adipocyte cells of 17 phenylpropanoid derivatives (B1 – B17) isolated from BuOH fraction revealed that all the isolates displayed 2NBDG glucose uptake effects Among these, compound B1 (lithospermic acid) shoed strongest inhacing effect, the others (B2 – B8) showed stronger effects than the caffeic acid and benzoic acid derivatives (B10 – B17) The pimarane-diterpene (C34C40) isolated from CHCl3 fraction also showed potential effects with dose-dependant manner Compounds that possessed strong PTP1B inhibitory activity (C36C40) also displayed stronger 2-NBDG stimulatory effects than C34 and C35 with weak PTP1B inhibitory activity 4.3 16 flavonoids (E18 E33) isolated from the EtOAc fraction were tested for their growth inhibition on 03 human breast cancer cell lines including MCF-7, MCF-7/TAMR and MDA-MB-231 Among these, compounds E30 EA33, which possessed strong PTP1B inhibitory activity, also displayed cytotoxic activity over 03 tested cancer cells with IC50 values ranging from 9.7 – 21.3 μM We have published 07 scientific papers, 02 SCIE papers belong to Q1 and Q2 with high IF = 4.7 and 0.6 PUBLICATIONS Phi Hung Nguyen, Huynh Nhu Tuan, Duc Thuan Hoang, Quoc Trung Vu, Minh Quan Pham, Manh Hung Tran, and Dao Cuong To Glucose Uptake Stimulatory and PTP1B Inhibitory Activities of Pimarane Diterpenes from Orthosiphon stamineus Benth., Biomolecules, 2019, 9, 859‒870 (Q1, IF = 4.7) Dao-Cuong To, Duc-Thuan Hoang, Manh-Hung Tran, Minh-Quan Pham, Nhu-Tuan Huynh, and Phi-Hung Nguyen PTP1B Inhibitory Flavonoids from Orthosiphon stamineus Benth and Their Growth Inhibition on Human Breast Cancer Cells, Natural Product Communication, 2019, 15(1), 1‒9 (Q2, IF = 0.6) Hoang Duc Thuan, Nguyen Phi Hung, Vu Quoc Trung Methoxyflavones from Orthosiphon stamineus and their PTP1B inhibitory activities, Vietnam Journal of Science and Technology, 2018, 56(4A), 146‒152 Hoàng Đức Thuận, Vũ Quốc Trung, Phạm Quốc Long, Nguyễn Phi Hùng Methoxyflavones with Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitory activity from Orthosiphon stamineus, Kỷ yếu Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, 2018, 684 - 688 (ISBN: 978-604-913-759-4) Nguyen Phi Hung, Hoang Đuc Thuan, Do Huu Nghi, Vu Quoc Trung, Pham Quoc Long PTP1B inhibitory flavonoids from Orthosiphon stamineus Benth., Vietnam Journal of Chemistry, 2017, 55(5), 652‒656 Nguyen Phi Hung, Hoang Duc Thuan, Nguyen Thi Thao, Vu Quoc Trung, Pham Quoc Long Một số flavonoids phân lập từ Râu mèo (Orthosiphon stamienus Benth.) Việt Nam, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đại học Đà Nẵng, 2017, 5(114), 133‒135 Hoang Duc Thuan, Nguyen Phi Hung, Nguyen Thi Thao, Vu Quoc Trung, Pham Quoc Long Các chất ức chế enzyme PTP1B phân lập từ Râu mèo (Orthosiphon stamienus Benth.) Việt Nam, Tạp chí Khoa học Công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 2017, 5(114), 136‒139 ... 1.2.1.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học Râu mèo 1.2.1.2 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học Râu mèo 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước Râu mèo CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG,PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM... (Orthosiphon stamineus Benth) Việt Nam? ??để nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu thành phần hóa học phần mặt đất Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất phân lập... thống thành phần hóa học tác dụng sinh học theo hướng chống tiểu đường, béo phì chống ung thư loài Râu mèo thực Do vậy, chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Râu mèo (Orthosiphon