Nghiên cứu thu nhận aspergillus flavus không sinh độc tố afaltoxin nhằm tạo chế phẩm nấm đối kháng

Nguyễn Thị Thúy Hường giáo dục đào tạo trường đại học bách khoa hà nội - LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH : CƠNG NGHỆ SINH HỌC c«ng nghƯ sinh häc NGHIÊN CỨU THU NHẬN ASPERGILLUS FLAVUS KHÔNG SINH ĐỘC TỐ AFALTOXIN NHẰM TẠO CHẾ PHẨM NẤM ĐỐI KHÁNG NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG 2006 - 2008 Hµ néi 2008 Hµ Néi 2008 MỞ ĐẦU Aflatoxin nhóm hợp chất mang nhân difuranocumarin có độc tính gây ung thư mạnh mycotoxin phát Nó sản phẩm trao đổi chất thứ cấp chủ yếu hai loài nấm mốc Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Các aflatoxin thường tìm thấy nhiều loại nơng sản thực phẩm khác đậu phộng, cà phê, sữa, tương, thức ăn gia súc loại ngũ cốc khác… gây nguy hại cho sức khỏe người động vật Theo số nghiên cứu, aflatoxin gây đột biến gen, gây ung thư động vật Một số báo cáo Nam Á Châu Phi cho thấy aflatoxin liên quan đến ung thư gan, viêm gan cấp tính, hội chứng Reye’s, bệnh sơ gan trẻ suy dinh dưỡng gây chứng suy dinh dưỡng trẻ em [37] Đứng trước nguy đó, nhu cầu kiểm sốt hàm lượng aflatoxin có mặt sản phẩm thực phẩm vơ cấp thiết Các phương pháp truyền thống góp phần kiểm soát hàm lượng aflatoxin biện pháp xử lý sau thu hoạch, chọn tạo giống trồng kháng nấm sinh aflatoxin hay phương pháp phân tích aflatoxin… sử dụng thời gian dài Tuy nhiên, phương pháp này, dù phát triển đến đâu cho phép phát mốc giai đoạn muộn, độc tố sinh tồn sản phẩm thực phẩm Những năm gần đây, xu hướng phát triển tỏ hiệu việc kiểm soát hàm lượng aflatoxin từ thời điểm mầm mống ban đầu, việc sử dụng chủng Aspergillus flavus khơng có khả sinh tổng hợp aflatoxin có tính cạnh tranh cao (các chủng đối kháng) làm tác nhân kiểm sốt Hiện giới có chế phẩm nấm đối kháng cấp sáng chế sử dụng rộng rãi nông nghiệp chế phẩm Aspergillus flavus NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 NRRL 21882 chế phẩm Aspergillus flavus AF36 nhà khoa học thuộc nông nghiệp Mỹ phân lập Các chủng nấm đối kháng kể tỏ hiệu kìm hãm gần hoàn toàn khả sinh aflatoxin chủng nấm mốc sinh aflatoxin Tuy nhiên, khả đối kháng chủng nấm mốc thay đổi theo điều kiện khí hậu vùng Do việc ứng dụng chế phẩm nấm đối kháng cách rộng rãi khắp giới gặp phải khó khăn định Ở nước ta với khí hậu nóng ẩm điều kiện thuận lợi cho loài nấm mốc phát triển Sự khác biệt mặt nhiệt độ thổ nhưỡng làm cho việc ứng dụng chế phẩm nấm đối kháng nước đem lại kết khơng cao Do thiết cần phải phân lập chủng A.flavus khơng có khả sinh tổng hợp aflatoxin để sử dụng làm chế phẩm nấm đối kháng phù hợp với điều kiện nhiệt độ thổ nhưỡng Việt Nam Dựa sở tiến hành nghiên cứu thu nhận chủng A.flavus không sinh độc tố aflatoxin nhằm tạo chế phẩm nấm đối kháng phù hợp với điều kiện nhiệt độ thổ nhưỡng Việt Nam Đây đề tài có tính khả thi cao có khả áp dụng rộng rãi thực tế Nội dung nghiên cứu: Phân lập chủng A.flavus từ thóc lấy số địa phương Sàng lọc chủng A.flavus không sinh aflatoxin kỹ thuật sắc ký mỏng (TLC) PCR Sàng lọc tiếp chủng phân lập kỹ thuật PCR kiểm tra khả đối kháng chủng không sinh với chủng sinh aflatoxin Nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu thu nhận sinh khối chủng nấm mốc phân lập NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 Bước đầu nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm nấm đối kháng từ chủng không sinh aflatoxin NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 PHẦN I TỔNG QUAN I.1 Tình hình nhiễm aflatoxin Nấm mốc có mặt khắp nơi thường phát sinh, phát triển sản phẩm lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc…Bên cạnh việc nấm mốc gây hư hỏng, thối rữa, làm giảm chất lượng giá trị sử dụng nhiều loài nấm mốc tiết độc tố gây bệnh cho người vật nuôi mycotoxin, đặc biệt aflatoxin Các aflatoxin sản phẩm trao đổi chất chủ yếu hai loài nấm A.flavus A.parasiticus Đây hợp chất thứ cấp mang độc tính có khả gây ung thư, tác động đến sức khỏe người vật nuôi Các đối tượng lương thực thực phẩm dễ bị nhiễm aflatoxin gồm: - Ngũ cốc chế phẩm chúng: ngơ, thóc, lúa mỳ, lúa mạch, kê…, sản phẩm xay sát loại ngũ cốc - Các loại hạt có dầu chế phẩm chúng: hạt lạc, hạt bông, hạt hướng dương, hạt dưa, đậu tương, hạt điều, loại khô dầu ép từ loại hạt có dầu… - Các loại sữa sản phẩm chế biến từ sữa: loại sữa hộp, bột sữa, bơ, mát… - Thịt, trứng, rau quả, đồ uống thực phẩm khác - Thức ăn gia súc… I.1.1 Tình hình nhiễm aflatoxin giới Theo số nghiên cứu cho thấy nhiễm aflatoxin A.flavus gây nên vấn đề nghiêm trọng Mỹ Những nghiên cứu cho thấy việc NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 nhiễm A.flavus đất trồng ngô bị ảnh hưởng vụ canh tác trước Mật độ A.flavus đất trồng ngô cao 794 CFU/g năm 2001, đất trồng năm 2000 251 CFU/g, đất trồng lúa mì gối vụ năm 2002 457 CFU/g 43-59% chủng A.flavus phân lập đất có khả tạo aflatoxin Trong nhiễm cao quần thể đất ngô gối vụ năm 2001 Kết nghiên cứu cho thấy 84% A.flavus phân lập từ hạt ngơ có khả tạo aflatoxin Ở Thái Lan, 35% mẫu ngơ nhiễm AFB1 (mức trung bình 400 µg/kg) Trong 40% mẫu nhiễm AFB1 tìm thấy Uganda với mức nhiễm trung bình 133 µg/kg 97% mẫu đảo Cebu thuộc Philipin với mức nhiễm trung bình 213 µg/kg Hàm lượng aflatoxin mẫu ngơ gia đình liên quan đến bùng nổ bệnh gan độc tố cấp tính tây bắc Ấn Độ Ở Thái Lan 80-85% số mẫu ngô thu thập từ kho bảo quản mùa mưa 1984-1985 nhiễm AFB1 với lượng từ vài đến vài trăm ppb Nghiên cứu lạc bóc vỏ Mỹ cho thấy 15% 361 mẫu có aflatoxin giới hạn từ vết đến 50 µg/kg Ở Đan Mạch phát 86,5 % số 52 mẫu sản phẩm lạc nhập vào nước làm thức ăn gia súc có chứa aflatoxin, mẫu có 3465 µg/kg Các aflatoxin tìm thấy 41% 173 số mẫu lạc Sudan, 16 mẫu có 250 µg/kg 9% số mẫu có 1000 µg/kg Ở Philipin, tất mẫu bơ lạc kiểm tra năm 1967-1969, có aflatoxin với giá trị 155 µg/kg Các nhà khoa học Nhật Bản điều tra nhiễm nấm A.flavus sinh aflatoxin đất vùng sinh thái khác Nhật cho thấy, A.flavus tìm thấy bán đảo Okinawa, nơi có khí hậu gần với khí hậu nhiệt đới NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 Hiện nay, nhiều quốc gia Ấn Độ, Mỹ, Thái Lan… có chiến lược phịng chống giảm tổn thất aflatoxin gây nên cho ngô lạc giai đoạn trước sau thu hoạch Mối quan tâm đến sức khỏe người vật nuôi đưa đến việc điều chỉnh giới hạn lượng aflatoxin cho phép thực phẩm thức ăn động vật hầu giới [37] - Theo WHO FAO, aflatoxin sữa nên 0,5 µg/kg - Tổ chức dược phẩm thực phẩm Mỹ quy định aflatoxin khơng vượt q 20 µg/kg thực phẩm ăn 30 µg/kg thức ăn cho động vật - Ở Trung Quốc mức aflatoxin chấp nhận 20 µg/kg ngơ, lạc nhân, dầu lạc; 10 µg/kg gạo, dầu ăn thực phẩm khác 5µg/kg… I.1.2 Tình hình nhiễm aflatoxin Việt Nam Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm khơng khí thường cao, thời vụ canh tác thu hoạch thường rơi vào mùa mưa Trong phương tiện thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô thoáng mát tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho lương thực thực phẩm thức ăn chăn nuôi Cũng nhiều nước giới, Việt Nam đưa quy định giới hạn aflatoxin nhiễm thực phẩm NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 Bảng 1.1 Giới hạn độc tố vi nấm (Mycotoxin) thực phẩm Giới hạn nhiễm tối STT Tên độc tố vi nấm Sản phẩm Aflatoxin tổng số B1 Thức ăn 10 Aflatoxin M1 Sữa 0.5 Các độc tố vi nấm khác Thức ăn 35 đa cho phép (ppb) (Theo Quyết định 867/QĐ-BYT/1998 Bộ Y tế ) Theo số khảo sát cho thấy mức độ nhiễm aflatoxin Việt Nam cao có khác vùng miền: Viện Vệ sinh y tế công cộng TP Hồ Chí Minh kiểm nghiệm 115 mẫu thực phẩm (gồm đậu phộng, da cá, kẹo đậu phộng, nước tương làm từ đậu nành, đồ hộp chay làm từ loại đậu bột mì, cà phê, thức ăn gia súc…) lưu hành thị trường phát aflatoxin có 30% mẫu cà phê; 42,9% mẫu nước tương; 66,7% mẫu đồ hộp chay; 68,2% mẫu đậu phộng sản phẩm từ đậu phộng - Theo khảo sát Nguyễn Phụng Tiến (1992) nhận thấy tỷ lệ nhiễm aflatoxin ngô bị mốc miền Nam miền Bắc cao từ 73,3%95,5% với hàm lượng từ 16-100 ppb - Luco cộng (1971) kiểm tra 193 mẫu gạo miền Nam-Việt Nam thấy có 31 mẫu nhiễm aflatoxin - Theo báo cáo kiểm tra khả nhiễm aflatoxin Viện dinh dưỡng Hà Nội (1994 – 1995) cho thấy: lạc có 23% nhiễm aflatoxin với nồng độ từ 1,6 - 17,4 ppb/kg Riêng lạc mốc có 100% nhiễm aflatoxin với NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 nồng độ 26,3 -175 ppb/kg Sữa bò tươi có 50% nhiễm aflatoxin với nồng độ 0,05- 0,1 ppb/kg Bột đậu nành trẻ em có 25% bị nhiễm từ 14,5-18,2 ppb/kg Trà uống có 27% nhiễm aflatoxin mức độ vết Ngoài ra, số liệu gần phương tiện thông tin cho thấy mức độ nhiễm aflatoxin sản phẩm thực phẩm nghiêm trọng, độc tố có mặt sữa, loại sản phẩm đồ uống lên men truyền thống đặc biệt nhiều thức ăn gia súc Điều thực nguy hiểm người động vật sử dụng loại thực phẩm I.2 Aflatoxin I.2.1 Cấu trúc hóa học aflatoxin Aflatoxin sản phẩm trao đổi chất bậc dạng polyketide sinh thực phẩm thức ăn gia súc nhiễm bệnh có chứa chi Aspergillus nhóm Flavi, đặc biệt A.flavus, A.parasiticus Các aflatoxin hầu hết có khả gây đột biến gen, gây quái thai, gây ung thư [38] Đến có 16 cấu trúc hóa học gần aflatoxin xác định song song với độc tính chúng Dựa đặc tính lý hóa tính độc khác aflatoxin, aflatoxin chia thành nhiều nhóm: B (B1, B2); G (G1, G2); M (M1, M2); P1 Q1 Các loại aflatoxin khác biệt hóa học khơng nhiều khác biệt độc tính lớn Aflatoxin B1 G1 có khả gây ung thư cao nhiều so với aflatoxin lại A.flavus tạo aflatoxin B1, aflatoxin B2, A.parasiticus tạo sản phẩm trao đổi chất tương tự aflatoxin G1, aflatoxin G2 [37] NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 Aflatoxin có nhiều loại loại có cấu trúc khác Người ta phát 16 loại aflatoxin Các loại dạng biến đổi khác aflatoxin B, G M Phân tử aflatoxin nói chung có chứa nhân cumarin liên kết với hai vịng furan Cơng thức chung loại aflatoxin biểu diễn dạng sau : Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo chung aflatoxin Các nhánh R1, R2, R3, R4, R5 nhóm X aflatoxin khác trình bày bảng sau [1.2]: NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 79 - Dùng pipet lấy hỗn hợp dung dịch nhỏ giọt vào cốc chứa 300 ml dung dịch CaCl2 0.3M độ cao 30 cm để tạo hạt Quá trình tạo hạt khuấy nhẹ máy khuấy từ Sau để ổn định 10 phút Hạt thu đem lọc, rửa sấy khô cabin an toàn điều kiện 30oC 24 h - Chế phẩm sau sấy khô bảo quản 8oC Kết tạo hạt chế phẩm thu hình sau: Hình 3.15 Chế phẩm tạo phương pháp bao gói alginate Hạt chế phẩm sau kiểm tra cách cho nuôi lại môi trường khoai tây lỏng, mọc lại sau ngày nuôi NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 80 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Với mục đích phân lập chủng Aspergillus flavus khơng có khả sinh tổng hợp aflatoxin từ thóc để ứng dụng tạo chế phẩm nấm đối kháng, sau thời gian nghiên cứu thu số kết sau: - Đã phân lập 99 chủng Aspergillus flavus 14 mẫu thóc lấy từ tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An Hà Tĩnh - Sàng lọc kỹ thuật TLC thu 53 chủng không sinh aflatoxin - Sàng lọc kỹ thuật PCR thu 17 chủng không sinh aflatoxin; Kiểm tra khả cạnh tranh số 17 chủng không sinh aflatoxin, thu chủng có khả đối kháng mạnh chủng số Af25 chủng số L9.7 để ứng dụng tạo chế phẩm nấm đối kháng - Đã xác định điều kiện ni thích hợp để thu nhận sinh khối cao cho chủng A.flavus phân lập được: to=28oC, pH8.0, thời điểm cấy truyền 2436 giờ, lượng giống cấy truyền 4% - Bước đầu thử nghiệm điều kiện tạo chế phẩm nấm đối kháng dạng hạt từ chủng phân lập: nồng độ alginate 300 g/l; tỉ lệ giống/tỉ lệ alginate 1:2 (theo thể tích); kích thước hạt chế phẩm 2-3 mm; thành phần phụ gia lựa chọn bổ sung vào chế phẩm tripton, bột lõi ngô chloramphenicol Đề xuất nội dung nghiên cứu tiếp theo: - Tiếp tục kiểm tra khả đối kháng 16/17 chủng không sinh aflatoxin phân lập - Kiểm tra số độc tố khác A.flavus sinh ra: Cyclopiazonic acid, aspergillic acid, aspertoxin, acid oxalic, stremorgenic… NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 81 - Nghiên cứu điều kiện lên men A.flavus quy mô lớn (công nghiệp) - Đánh giá khả tạo chế phẩm chủng phân lập - Kiểm tra khả bảo quản chế phẩm - Thử nghiệm chế phẩm nấm đối kháng đồng ruộng NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2003), Sinh học phân tử, NXBGD Bùi Xuân Đồng (2003), Nguyên lý phòng chống nấm mốc mycotoxin, NXB KHKT-HN Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Văn Huy (2000), Vi nấm dùng công nghệ sinh học, NXB KHKT-HN Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, NXB ĐHQG-TPHCM, Tập Abbas H.K., (2005), Aflatoxin and Food Safety, Taylor & Francis Al-Samarrai T.H and Schmid J., (2000), A simple method for extraction of fungal genomic DNA, Letters in Applied Microbiology, 30, pp 53-56 Aquino S., Ferreira F., Ribeiro D.H.B., Correea B., Greiner R., Villavicencio A.L.C.H., (2005), Evaluation of viability of Aspergillus flavus and aflatoxins degradation in irradiated samples of maize, Brazillian Journal of Microbiology, 36, pp 352-356 Arrus K., Blank G., Abramson D., R.Clear, Holley R.A., (2005), Aflatoxin production by Aspergillus flavus in Brazil nuts, Journal of Stored Products Research, 41, pp 513-527 Bennett J.W., Klich M., (2003), Mycotoxins, Clinical Microbiology Review, 16(3), pp 497-516 10 Chang P.K., Horn B.W., Dorner J.W., (2005), Sequence breakpoints in the aflatoxin biosynthesis gene cluster and flanking regions in nonaflatoxigenic Aspergillus flavus isolates, Fungal Genetics and Biology, 42, pp 914-923 NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 83 11 Cotty P.J., (1992), Use of native Aspergillus flavus strains to prevent Aflatoxin contamination, United States Patent, (5171686) 12 Cotty P.J., Bayman P., (1993), Competitive Exclusion of a Toxigenic Strain of Aspergillus flavus by an Atoxigenic Strain, The American Phytopathological Society, 83(12), pp.1283-1287 13 Cotty P.J., Bhatnagar D., (1994), Variability among Atoxigenic Aspergillus flavus Strains in Ability to Prevent Aflatoxin Contamination and Production of Aflatoxin Biosynthetic Pathway Enzymes, Applied and Environmental Microbiology, 60(7), pp 2248-2251 14 Cotty P.J., Daigle D.J., (1995), Formulating Atoxigenic Aspergillus flavus for Field Release, Biocontrol Science and Technology, 5, pp.175-184 15 Criseo G., Bagnara A., Bisignano G., (2001), Differentiation of aflatoxinproducing and non-producing strains of Aspergillus flavus group, Letters in Applied Microbiology, 33, pp 291-295 16 Degola F., Berni E., Asta C.D., Spotti E., Marchelli R., Ferrero I., Restivo F.M., (2007), A multiplex RT-PCR approach to dectect aflatoxigenic strains of Aspergillus flavus, Journal of Applied Microbiology , 103, pp 409-417 17 Diener U.L., Cole R.J., Sanders T.H., Payne G.A., Lee L.S., Klich M.A., (1987), Epidemiology of aflatoxin formation by Aspergillus flavus, Ann Rev Phytopatho, 25, pp 249-270 18 Duran R.M., Cary J.W., Calvo A.M., (2006), Production of cyclopiazonic acid, aflatrem, and aflatoxin by Aspergillus flavus is regulated by veA, a gene necessary for sclerotial formation, Appl Microbiol Biotechnol NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 84 19 Ehrilich K.C., Chang P.K., Yu J., Cotty P.J., (2004), Aflatoxin Biosynthesis Cluster Gene cypA is required for G Aflatoxin formation, Applied and environmental Microbiology, 70(11), pp 6518-6452 20 Geisen R., (1996), Multiplex polymerase chain reaction for the detection of potential aflatoxin and sterigmatocystin producing fungi, Systematic and Applied Microbiology, 19, pp 388-392 21 Gnanamanickam S.S., (2002), Biological control of crop diseases, Marcel Dekker 22 Guerra M., Martins H.M., Rerreira S., Esquivel M., Bernardo F., (2007), Screening of Aflatoxin B1 in Laboratory Rat Feed, Scand J Lab Anim Sci, 34(2), pp 109-113 23 Gunterus A., Rose L.V., Beaudry R., Linz J.E., (2007), Ethylene inhibits Aflatoxin Biosynthesis in Aspergillus parasiticus Grown on Peanuts, Food Microbiol, 24(6), pp 658-663 24 Konietzny U., Greiner R., (2003), The application of PCR in the of mycotoxigenic fungi in foods, Brazilian Journal of Microbiology, 34, pp 283-300 25 Krska R., Schubert-Ullrich P., Molinelli A., Sulyok M., (2008), Mycotoxin analysis: An update, Food Additives & Contaminants, 25(2), pp 152-163 26 Jin J., Lee Y.K., Wickes B.L., (2004),Simple Chemical Extraction Method for DNA isolation from Aspergillus fumigatus and other Aspergillus Species, Journal of Clinical Microbiology, 24(9), pp 4293-4296 27 Liang Y., Baker M.E., Yeager B.T., Denton M.B., (1996), Quantitative Analysis of Aflatoxins NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG by High-Performance Thin-Layer CNSH CH06-08 85 Chromatography Utilizing a Scientifically Operated Charge-Coupled Device Detector, Analytical Chemistry, 68(22), pp 3885-3891 28 Mayer Z., Farber P., Geisen R., (2003), Monitoring the Production of Aflatoxin B1 in Wheat by Measuring the Concentration of nor-1 mRNA, Applied and Environmental Microbiology, 60(2), pp 1154-1158 29 Miller J.D., (2008), Mycotoxins in small grain and maize: Old problems, new challenges, Food Additives & Contaminants, 25(2), pp 219-230 30 Nakai V.K., Rocha L.O., Goncalez E., Fonseca H., Ortega E.M.M., Correa B., (2008), Distribution of fungi and aflatoxins in a stored peanut variety, Food Chemitry, 106, pp 285-290 31 Ozay G., Seyhan F., Pembeci C., Saklar S., Yilmaz A., (2008), Factors influencing fungal and aflatoxin levels in Turkish hazelnuts during growth, harvest, drying and storage: A 3-year study, Food Additives & Contaminants, 25(2), pp 209-218 32 Pitt J.I, Ailsa D.H, Diane R.Glenn, (1983), An improved medium for the detection of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus, Journal of Applied Bactergiology, 54, pp 109-114 33 Price M.S., Conners S.B., Tachdjian S., Kelly R.M., Payne G.A., (2005), Aflatoxin conducive and non-conducive growth conditions reveal new gene associations with aflatoxin production, Fungal Genetics and Biology, 42, pp 506-518 34 Rahimi P., Sharifnabi B., Bahar M., (2008), Detection of Aflatoxin in Aspergillus Species Isolated from Pistachio in Iran, Journal Phytopathology, 156, pp 15-20 NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 86 35 Report on plant desease, (1997), Mycotoxins and mycotoxicoses, Department of crop sciences University of illiois urbana-champaign, RPD (1105) 36 Robb J., Norval M., (1983), Comparison of Cytotoxicity and Thin-Layer Chromatography Methods for Detection of Mycotoxins, Applied and Environmental Microbiology, 46(4), pp 948-950 37 Ruiqian L., Quian Y., Thanaboripat.D., Thansukon P., Biocontrol of Aspergillus flavus and aflatoxin production, Department of Biotechnology, Faculty of Science, Harbin Institute of Technology, China & Department of Applied Biology, Thailand 38 Scherm B., Palomba B., Serra D., Marcello A., Migheli Q., (2005), Detection of transcripts of the aflatoxin genes aflD, aflO and aflP by reverse transcription-polymerase chain reaction allows differentiation of aflatoxin-producing and non-producing isolates of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus, International Journal of Food Microbiology, 98, pp 201-210 39 Shapira R., Paster N., Eyal O., Menasherow M., Mett A and Salomon R., (1996), Detection of aflatoxingenic molds in grains by PCR, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, Faculty of Agriculture, Hebrew University of Jerusalem, Rehovot, Isreal 40 Somashekar D., Rati E.R., Chandrashekar A., (2004), PCR-restriction fragment length analysis of aflR gene for differentiation and detection of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus in maize, Interntional Journal of Food Microbiology, 93, pp.101-107 41 Thanaboripat D., Mongkontanawut N., Suvathi Y., Ruangrattanamatee V., Inhibition of aflatoxin production and growth of Aspergillus flavus by NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 87 Citronella oid, Department of Applied Biology, Research and Developtment Institute and Department of Applied Statistics, Bangkok, Thailand 42 Verma R.J., (2004), Aflatoxin cause DNA damage, Int J Hum Genet, 4(4), pp 231-236 43 Wilson B.J (1996), Toxins other than Aflatoxins Produced by Aspergillus flavus, Bacteriological Review, 30(2) 44 Yildiz H., Sert S., Gurses M., (2008), Effects of different storage conditions on aflatoxin formation in Kome inoculated with Aspergillus parasiticus NRRL 2999, Journal of Food Safety, 28, pp 103-110 45 Yu J., Chang P.K., Cary J.W., Wright M., Bhatnagar D., Cleveland T.E., Payne G.A., Linz J.E., (1995), Comparative Mapping of Aflatoxin Pathway Gene Clusters in Aspergillus parasiticus and Aspergillus flavus, Applied and Environmental Microbiology, 61(6), pp 2365-2371 46 Yu J., Chang P.K., Ehrlich K.C., Cary J.W., Bhatnagar D., Cleveland T.E., Payne G.A., Linz J.E., Woloshuk C.P and Bennett J.W., (2004), Minireview: Clustered Pathway Genes in Aflatoxin Biosynthesis, Applied and environmental Microbiology, 70(3), pp 1253-1262 47 Zheng Z., Humphrey C.W., King R.S., Richard J.L., (2005), Validation of an ELISA test kit for the detection of total aflatoxins in grain and grain products by comparision with HPLC, Mycopathologia, 195, pp 255-263 NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 88 PHỤ LỤC Danh sách chủng phân lập Ký hiệu STT chủng Địa điểm lấy mẫu Kết kiểm Kết kiểm tra PCR với mồi tra TLC 1.1 Thọ Xuân-TH + 1.2 Thọ Xuân-TH + 1.3 Thọ Xuân-TH + 1.4 Thọ Xuân-TH - 2.2 Thọ Xuân-TH + 2.3 Thọ Xuân-TH + 2.4 Thọ Xuân-TH 3.1 pksA aflR aflJ ver1 ordA + - + + + - + - + + + Thọ Xuân-TH - - - + + + 3.2 Thọ Xuân-TH - - - - - - 10 3.3 Thọ Xuân-TH - - - + + + 11 3.4.1 Thọ Xuân-TH - - + + - + 12 3.4.2 Thọ Xuân-TH - - - - - - 13 3.5 Thọ Xuân-TH - - - + - + 14 3.6 Thọ Xuân-TH - + + - + + 15 3.7 Thọ Xuân-TH - - - - - + 16 T2.1 Thọ Xuân-TH - + - + - + 17 T2.2.1 Thọ Xuân-TH - - - - - - 18 T2.2.2 Thọ Xuân-TH - + + + + + 19 T2.2.3 Thọ Xuân-TH - - - + - - 20 T2.3 Thọ Xuân-TH - - - - - - 21 T3.3 Thọ Xuân-TH + 22 10.1.1 Diễn Châu-NA + NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 89 23 10.1.2 Diễn Châu-NA - 24 10.1.3 Diễn Châu-NA + 25 10.1.4.1 Diễn Châu-NA + 26 10.1.4.2 Diễn Châu-NA + 27 10.1.5 Diễn Châu-NA + 28 10.1.6 Diễn Châu-NA + 29 10.1.7 Diễn Châu-NA + 30 10.1.8 Diễn Châu-NA + 31 10.1.9 Diễn Châu-NA + 32 10.1.10 Diễn Châu-NA + 33 10.1.11 Diễn Châu-NA + 34 11.3.1.1 Đức Thọ - HT + 35 11.3.1.2 Đức Thọ - HT + 36 L1.6 Thiệu Hóa-TH + 37 L2.1 Đông Sơn-TH 38 L2.2.1 39 - + - - - - - - - + - Đông Sơn-TH - - + + - + L2.2.2 Đông Sơn-TH + 40 L2.3 Đông Sơn-TH + 41 L2.4.1 Đông Sơn-TH - + - + - - 42 L2.4.2 Đông Sơn-TH - + + + + + 43 L2.6 Đông Sơn-TH - - - - - - 44 L3.1 Thiệu Hóa-TH + 45 L3.2 Thiệu Hóa-TH - - - + - + 46 L3.3 Thiệu Hóa-TH - + + + + + 47 L3.4 Thiệu Hóa-TH + 48 L3.5 Thiệu Hóa-TH - - - - + + 49 L3.7 Thiệu Hóa-TH + 50 L3.8 Thiệu Hóa-TH - + - + + + NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 90 51 L3.9 Thiệu Hóa-TH + 52 L4.1 Hoằng Hóa-TH + 53 L4.2.1 Hoằng Hóa-TH + 54 L4.2.2 Hoằng Hóa-TH - 55 L4.3 Hoằng Hóa-TH + 56 L4.4 Hoằng Hóa-TH + 57 L4.5 Hoằng Hóa-TH - 58 L4.7 Hoằng Hóa-TH + 59 L4.8 Hoằng Hóa-TH - 60 L5.1 Hoằng Hóa-TH + 61 L5.4 Hoằng Hóa-TH 62 L5.5 63 - - - - - - - - - + + - + + + - - + - - - Hoằng Hóa-TH - + + + + + L5.6 Hoằng Hóa-TH + 64 L6.2 Hoằng Hóa-TH + 65 L6.3 Hoằng Hóa-TH - + - + + + 66 L6.4 Hoằng Hóa-TH + 67 L6.7 Hoằng Hóa-TH + 68 L6.8 Hoằng Hóa-TH - + + + + + 69 L6.9 Hoằng Hóa-TH + 70 L6.10 Hoằng Hóa-TH - + - - + + 71 L8.1 Nông Cống-TH + 72 L8.2.1 Nông Cống-TH + 73 L8.2.2 Nông Cống-TH - + + + - + 74 L8.3 Nông Cống-TH - + + + + + 75 L8.4.2 Nông Cống-TH - + + + + + 76 L8.6 Nông Cống-TH - + + + + + 77 L8.7 Nông Cống-TH + 78 L8.8 Nông Cống-TH + NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 91 79 L8.9 Nông Cống-TH + 80 L8.10 Nơng Cống-TH + 81 L2.5 Hoằng Hóa-TH - + + + + + 82 T2.3.2 Thọ Xuân-TH - + + + + + 83 T3.1 Thọ Xuân-TH + 84 T3.2 Thọ Xuân-TH + 85 T3.3.2 Thọ Xuân-TH + 86 T3.4 Thọ Xuân-TH + 87 T3.6 Thọ Xuân-TH + 88 T3.8 Thọ Xuân-TH + 89 T3.9 Thọ Xuân-TH - - - - - - 90 L3.6 Thiệu Hóa-TH + 91 L5.3 Hoằng Hóa-TH - - + + + + 92 L7.1 Nông Cống-TH + 93 L9.2 Nông Cống-TH - - - - - - 94 L9.3 Nông Cống-TH - - - - - - 95 L9.5 Nông Cống-TH - + - + + + 96 L9.6 Nông Cống-TH - - + - - - 97 L9.7 Nông Cống-TH - + - - + + 98 L8.5 Nông Cống-TH + 99 L8.4.1 Nông Cống-TH + 100 DA1 Viện STH - + + + + + 101 DA2 Viện STH - - - - - + 102 Af9 Viện STH - + + + + + 103 Af12 Viện STH - + + + - + 104 Af14 Viện STH + 105 Af23 Viện STH - + + + + + 106 Af25 Viện STH - - - - + + NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 92 Ghi chú: TH: Thanh Hóa +: Kết qủa dương tính HT: Hà Tĩnh -:Kết âm tính NA: Nghệ An NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 ... A .flavus khơng có khả sinh tổng hợp aflatoxin để sử dụng chế phẩm nấm đối kháng Dựa sở đó, chúng tơi tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu thu nhận Aspergillus flavus không sinh độc tố aflatoxin nhằm tạo. .. cứu tìm điều kiện tối ưu thu nhận sinh khối chủng nấm mốc phân lập NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG CNSH CH06-08 Bước đầu nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm nấm đối kháng từ chủng không sinh aflatoxin NGUYỄN... sinh tổng hợp aflatoxin để sử dụng làm chế phẩm nấm đối kháng phù hợp với điều kiện nhiệt độ thổ nhưỡng Việt Nam Dựa sở chúng tơi tiến hành nghiên cứu thu nhận chủng A .flavus không sinh độc tố