Nghiên cứu tính đối kháng của aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO LÊ THIÊN MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI  LÊ THIÊN MINH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRÊN NGÔ VÀ LẠC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2014 HÀ NỘI – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THIÊN MINH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN TRÊN NGÔ VÀ LẠC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THIÊN MINH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN TRÊN NGÔ VÀ LẠC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS NGUYỄN THÙY CHÂU PGS TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM Hà Nội - 2015 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Giáo dục Đào tạo, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch giúp đỡ tạo điều kiện cho trình học tập hoàn thành luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Thuỳ Châu - Nguyên trưởng Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm – Trưởng môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học & CNTP, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ chia sẻ khó khăn suốt thời gian thực luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS Đinh Duy Kháng - Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử, tạo điều kiện thuận lợi ủng hộ trình thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn cán phụ trách đào tạo, Viện đào tạo sau đại học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ hoàn thành thủ tục cần thiết trình làm nghiên cứu sinh Trong thời gian qua, nhận giúp đỡ nhiệt tình anh chị bạn đồng nghiệp Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch - Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, Phòng Vi sinh vật phân tử - Viện Công nghệ sinh học Bộ môn Vi sinh, Hóa sinh, Sinh học phân tử - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Nhân dịp xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tôi biết ơn người thân gia đình quan tâm tạo điều kiện tốt cho học tập nghiên cứu Tôi vô cảm ơn động viên, khích lệ bạn bè Viện dành cho Hà Nội, ngày 27 tháng 01 năm 2015 Lê Thiên Minh ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác Hà nội, ngày 27 tháng 01 năm 2015 Tập thể giáo viên hướng dẫn Tác giả Lê Thiên Minh iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A flavus A parasiticus ADN AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AOAC ARN AVF AVN AVNN DHDMST DHOMST DHST DMST dNTP EDTA EtBr FAO FDA HAVN HPLC NOR OAVN OMST PCR PDA SDS SDS-PAGE ST TCA TE TLC Tm v/p v/v VAL VERA VERB VHA vvm w/v WHO X Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Axit deoxyribonucleic Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 Aflatoxin G1 Aflatoxin G2 Association of analytical communities Axit ribonucleic Averufin Averantin Averufanin Dihydro demethylsterigmatocystin Dihydro-O-methylsterigmatocystin Dihydro sterigmatocystin Demethylsterigmatocystin Deoxiribonucleotit triphosphat Axit etylen diamin tetra axetic Ethydium bromit The Food and Agriculture Organization of the United Nations Cục quản lý Thực ph m Dược ph m Hoa kỳ 5’ hydroxyaverantin high performance liquid chromatography Norsolorinic acid Oxoaverantin O-methylsterigmatocystin Polymerase chain reaction Potato Dextro Agar Sodium dodecyl sulfate Điện di gel polyacrylamit có chứa sodium dodecyl sulfate Sterigmatocystin Axit trichloroaxetic Tris EDTA Thin layer chromatography sắc ký lớp mỏng Nhiệt độ tan chảy vòng / phút Thể tích/thể tích Versiconal Versicolorin A Versicolorin B Versiconal hemiacetal acetate thể tích/thể tích/phút Trọng lượng /thể tích Tổ chức Y tế giới Axit amin iv Danh môc c¸c b¶ng STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số tính chất lý, hóa aflatoxin Bảng 1.2 Giới hạn aflatoxin cho phép nông sản thực phẩm 12 Bảng 1.3 Giới hạn aflatoxin thức ăn tinh hỗn hợp cho Bê Bò 12 Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin thức ăn chăn nuôi 13 Bảng 1.5 Đặc điểm hình thái A flavus 14 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp mẫu A flavus DA2 40 Bảng 3.1 Kết phân lập chủng A flavus từ ngô, lạc số tỉnh Việt 44 Nam Bảng 3.2 Khả tạo aflatoxin chủng A flavus phân lập từ ngô 45 lạc Bảng 3.3a Đặc điểm hình thái chủng A flavus phân lập từ mẫu ngô lạc 47 10 Bảng 3.3b Đặc điểm hình thái chủng A flavus phân lập từ mẫu ngô lạc 48 11 Bảng 3.4a Đặc điểm cấu trúc vi học chủng A flavus phân lập từ 49 mẫu ngô lạc 12 Bảng 3.4b Đặc điểm cấu trúc vi học chủng A flavus phân lập từ 50 mẫu ngô lạc 13 Bảng 3.5 Khả sinh aflatoxin B1 chủng A flavus phân lập 52 14 Bảng 3.6 Hiệu giảm aflatoxin B1 chủng A flavus AF14 nuôi cấy 54 môi trường ngô chủng A flavus không sinh aflatoxin 15 Bảng 3.7 Mật độ tế bào A flavus DA2 A flavus AF14 nuôi hỗn hợp theo 55 tỉ lệ 1:1 16 Bảng 3.8 Trình tự cặp mồi 58 17 Bảng 3.9 Tổng hợp kết PCR với mồi sử dụng 60 18 Bảng 3.10 nh hưởng A flavus DA2 đến trọng lượng c thể chuột 63 19 Bảng 3.11 Mật độ bào tử chủng A flavus DA2 tạo môi 66 trường khác v 20 Bảng 3.12 Khả tạo bào tử chủng A flavus DA2 nhiệt độ nuôi cấy 67 khác 21 Bảng 3.13 nh hưởng độ ẩm môi trường đến khả tạo bào tử 68 chủng A flavus DA2 22 Bảng 3.14 Thời điểm thu bào tử chủng A flavus DA2 69 23 Bảng 3.15 nh hưởng t lệ tiếp giống tới mật độ bào tử A flavus DA2 70 24 Bảng 3.16 nh hưởng độ dày khối ủ tới mật độ bào tử chủng A flavus 71 DA2 25 Bảng 3.17 Mật độ bào tử A flavus DA2 chất mang thời gian 72 bảo quản khác 26 Bảng 3.18 Khả cạnh chế phẩm A.flavus DA2 t lệ khác 76 sắc ký TLC 27 Bảng 3.19 Khả cạnh tranh chủng A.flavus DA2 bón vào đất 77 t lệ khác 28 Bảng 3.20 nh hưởng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến phát triển 80 sinh khối A.flavus DA2 29 Bảng 3.21 Mức độ nhiễm nấm mốc A.flavus đất trồng ngô, lạc số 82 tỉnh Việt Nam 30 Bảng 3.22 Khả cạnh tranh chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin 84 đất trồng ngô sử dụng chế phẩm AF 31 Bảng 3.23 Hiệu giảm nấm mốc aflatoxin chủng A.flavus DA2 86 ngô bắp giai đoạn trước thu hoạch 32 Bảng 3.24 Hiệu phòng chống nấm mốc aflatoxin chế phẩm AF 89 ngô sau thời gian bảo quản tháng 33 Bảng 3.25 Khả cạnh tranh chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin 91 đất trồng lạc bón chế phẩm AF 34 Bảng 3.26 Hiệu giảm nấm mốc aflatoxin chủng A.flavus DA2 92 lạc củ giai đoạn trước thu hoạch 35 Bảng 3.27 Hiệu giảm nấm mốc aflatoxin chủng A.flavus DA2 lạc sau thời gian bảo quản tháng 93 vi Danh môc c¸c h×nh STT Tên hình Trang Hình 1.1 Công thức cấu tạo số dạng aflatoxin Hình 1.2 Aflatoxin tư ng tác đồng hóa trị với vật chất di truyền Hình 1.3 Khuẩn lạc A.flavus 15 Hình 1.4 Hệ sợi A.flavus quan sát kính hiển vi 15 Hình 1.5 C chế sinh tổng hợp aflatoxin 17 Hình 1.6 Hàm lượng aflatoxin hạt giảm t lệ AF36 tăng 29 Hình 3.1 Sắc ký đồ phân tích aflatoxin tạo chủng A flavus AF14 52 Hình 3.2 Sắc ký đồ thể khả sinh aflatoxin B1 chủng A flavus 53 DA2 Hình 3.3 Kiểm tra hàm lượng aflatoxin B1 hỗn hợp chủng A.flavus 54 nuôi cấy c chất ngô sắc ký mỏng (TLC) 10 Hình 3.4 Chủng A flavus DA2 cạnh tranh lấn át chủng A flavus AF14 56 đĩa thạch 11 Hình 3.5 Chất lượng ADN tổng số gen agarose 1,5% 59 12 Hình 3.6 Sản phẩm multiplex PCR chủng A.flavus DA2 A flavus 59 AF14 13 Hình 3.7 Khả sinh aflatoxin chủng A.flavus DA2 sau 5, 10 15 61 hệ 14 Hình 3.8 Sự tồn gen aflR, ver, omt nor chủng A.flavus 61 DA2 sau 5, 10 15 hệ 15 Hình 3.9 Đường cong sinh trưởng chủng A.flavus DA2 65 16 Hình 3.10 Khả cạnh tranh A.flavus DA2 t lệ khác 75 17 Hình 3.11 Khả đối kháng chế phẩm A.flavus DA2 thời điểm 78 cấy khác 18 Hình 3.12 Khả đối kháng chủng A.flavus DA2 có mặt thuốc bảo vệ thực vật 81 vii 19 Hình 3.13 Nấm mốc nhiễm đất trồng ngô 83 20 Hình 3.14 Khuẩn lạc chủng A.flavus phát quang phân lập từ đất trồng ngô 85 bón chế phẩm AF xã Tam Hồng, Yên Lạc, Vĩnh Phúc (8/20076/2008) 21 Hình 3.15 Khả kiểm soát aflatoxin ngô trước thu hoạch chế 87 phẩm AF 22 Hình 3.16 Bắp ngô ruộng sử dụng hai lần chế phẩm AF 88 23 Hình 3.17 Bắp ngô ruộng không sử dụng chế phẩm AF 88 24 Hình 3.18 Ngô sử dụng không sử dụng chế phẩm AF sau thời gian bảo 90 quản tháng 25 Hình 3.19 Chủng A flavus phát quang không phát quang phân lập 92 đất trồng lạc 26 Hình 3.20 Lạc sử dụng không sử dụng chế phẩm AF sau thời gian bảo quản tháng 94 PHỤ LỤC Phụ lục Đường chu n aflatoxin B1 Phụ lục 2: Cấu trúc bọng có cuống thể bình thể bình chủng A flavus DA2 110 Phụ lục 3: Khu n lạc chủng A flavus AF14 Phụ lục 4: Chủng A flavus AF14 phát quang môi trường thạch 111 Phụ lục 5: Đóng túi cho khử tr ng môi trường cám trấu chuẩn bị nhân nuôi A.flavus DA2 Phụ lục 6: Nuôi cấy bề mặt A.flavus DA2 112 Phụ lục Hệ thống lên men bề mặt sản xuất chế ph m AF Phụ lục Sinh khối nấm A flavus DA2 trình nuôi bề mặt 113 Phụ lục Chế ph m AF sản xuất từ chủng A flavus DA2 Phụ lục 10 Cán Viện Cơ điện nông nghiệp cán phòng nông nghiệp huyện Yên Lạc, Vĩnh Phúc hướng dẫn sử dụng chế ph m kiểm tra mô hình sử dụng chế ph m AF cho lạc 114 Phụ lục 11 Ruộng lạc sử dụng chế ph m AF Phụ lục 12 Ruộng lạc không sử dụng chế ph m AF 115 Phụ lục 13 Gốc lạc sử dụng chế ph m (A) không sử dụng chế ph m (B) AF Phụ lục 14 Mô hình bảo quản lạc sử dụng chế ph m AF 116 Phụ lục 14 Mô hình sử dụng chế ph m AF cho ngô Phụ lục 15 Mô hình bảo quản ngô sử dụng chế ph m AF 117 Phụ lục 15 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu aflR, nor, omt ver phần mềm PC/GENE ===18-MAR-2007====================PCRPLAN=====================PC/GENE=== ********************* * PRIMER EVALUATION * ********************* PCR product: 1034 bp Sequence selected is AFLRGENE Total number of bases is: 1692 Amplified region is the complete sequence Plus strand primer is user-defined Minus strand primer is user-defined Tm parameters Tm = delta H/(delta S + R * ln(C/4)) - 273.15 + 16.6 log[Na+] Optimal Tm: Acceptable Tm range: Salt concentration: Primer DNA concentration: 73 58-88 50 mM 250 pM Primer composition parameters Optimal primer length: Acceptable primer lengths: Maximum single base repetition: Number of bases for 3' GC clamp: Acceptable range for %GC: 20 15-25 40-60 % Primer binding parameters Maximum Maximum Maximum Maximum number of bases for primer self-complementarity: allowable stem size in stem-loop formation: percent of bases complementary to other template regions: number of bases complementary between + and - primers: - Plus strand primer evaluation ============================= Plus strand primer is (5' > 3') TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG Origin of primer is FILE AFLR1 Tm: DeltaG: Length: %GC: 72 -62 24 71 Restriction enzyme site(s): AhyI AvaI BssKI CauII HpaII ScrFI SecI SfaNI SmaI PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA: 118 4 70 % - a single base repeat containing more than bases is present %GC is not within the acceptable range primer binds to itself primer forms a stem-loop PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT SITE(S) PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT SITE(S) Plus strand primer - template binding: [Note: Locations are given relative to the original template sequence.] PLUS-PRIMER AFLRGENE TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG |||||||||||||||||||||||| ATAGAGGGGGGCCCGTAGAGGGCC LOCATION: 193 to 216 Minus strand primer evaluation ============================== Minus strand primer is (5' > 3') CCGTCAGACAGCCACTGGACACGG Origin of primer is FILE AFLR2 Tm: DeltaG: Length: %GC: 67 -53 24 67 Restriction enzyme site(s): AlwNI BsrI PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA: - %GC is not within the acceptable range PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT SITE(S) PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT SITE(S) Minus strand primer - template' binding: [Note: Locations are given relative to the original template sequence.] MINUS-PRIMER CCGTCAGACAGCCACTGGACACGG |||||||||||||||||||||||| AFLRGENE GGCAGTCTGTCGGTGACCTGTGCC LOCATION: 1203 to 1226 ===18-MAR-2007====================PCRPLAN=====================PC/GENE=== ********************* * PRIMER EVALUATION * ********************* PCR product: 399 bp Sequence selected is NOR_1 Total number of bases is: 1503 Amplified region is the complete sequence Plus strand primer is user-defined Minus strand primer is user-defined 119 Tm parameters Tm = delta H/(delta S + R * ln(C/4)) - 273.15 + 16.6 log[Na+] Optimal Tm: Acceptable Tm range: Salt concentration: Primer DNA concentration: 72 57-87 50 mM 250 pM Primer composition parameters Optimal primer length: Acceptable primer lengths: Maximum single base repetition: Number of bases for 3' GC clamp: Acceptable range for %GC: 20 15-25 40-60 % Primer binding parameters Maximum Maximum Maximum Maximum number of bases for primer self-complementarity: allowable stem size in stem-loop formation: percent of bases complementary to other template regions: number of bases complementary between + and - primers: 4 70 % Plus strand primer evaluation ============================= Plus strand primer is (5' > 3') ACCGCTACGCCGGCACTCTCGGCAC Origin of primer is FILE NOR1 Tm: DeltaG: Length: %GC: 73 -62 25 72 Restriction enzyme site(s): AciI Cfr10I Eco56I HpaII MwoI NaeI PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA: - GC clamp has less than bases - %GC is not within the acceptable range - primer binds to itself - primer binds to the other primer PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT SITE(S) PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT SITE(S) Plus strand primer - template binding: [Note: Locations are given relative to the original template sequence.] PLUS-PRIMER NOR_1 ACCGCTACGCCGGCACTCTCGGCAC ||||||||||||||||||||||||| TGGCGATGCGGCCGTGAGAGCCGTG LOCATION: 501 to Minus strand primer evaluation 120 525 ============================== Minus strand primer is (5' > 3') GTTGGCCGCCAGCTTCGACACTCCG Origin of primer is FILE NOR2 Tm: DeltaG: Length: %GC: 72 -60 25 68 Restriction enzyme site(s): AciI AluI CfrI Fnu4HI HaeIII TaqI PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA: - %GC is not within the acceptable range - primer binds to the other primer PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT SITE(S) PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT SITE(S) Minus strand primer - template' binding: [Note: Locations are given relative to the original template sequence.] MINUS-PRIMER GTTGGCCGCCAGCTTCGACACTCCG ||||||||||||||||||||||||| NOR_1 CAACCGGCGGTCGAAGCTGTGAGGC LOCATION: 875 to 899 ===18-MAR-2007====================PCRPLAN=====================PC/GENE=== ********************* * PRIMER EVALUATION * ********************* PCR product: 795 bp Sequence selected is OMT_1 Total number of bases is: 2969 Amplified region is the complete sequence Plus strand primer is user-defined Minus strand primer is user-defined Tm parameters Tm = delta H/(delta S + R * ln(C/4)) - 273.15 + 16.6 log[Na+] Optimal Tm: Acceptable Tm range: Salt concentration: Primer DNA concentration: 69 54-84 50 mM 250 pM Primer composition parameters Optimal primer length: Acceptable primer lengths: Maximum single base repetition: Number of bases for 3' GC clamp: Acceptable range for %GC: 20 15-25 40-60 % Primer binding parameters 121 Maximum Maximum Maximum Maximum number of bases for primer self-complementarity: allowable stem size in stem-loop formation: percent of bases complementary to other template regions: number of bases complementary between + and - primers: 4 70 % Plus strand primer evaluation ============================= Plus strand primer is (5' > 3') GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC Origin of primer is FILE OMT1 Tm: DeltaG: Length: %GC: 68 -52 28 60 Restriction enzyme site(s): AsuI AvaII MaeI Tth111I PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA: - GC clamp has less than bases - primer binds to itself - primer forms a stem-loop - primer binds to the other primer - primer pair Tm values are not within degrees C PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT SITE(S) PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT SITE(S) Plus strand primer - template binding: [Note: Locations are given relative to the original template sequence.] PLUS-PRIMER OMT_1 GTGGACGGACCTAGTCCGACATCACTCG |||||||||||||||||||||||||||| CACCTGCCTGGATCAGGCTGTAGTGAGC LOCATION: 964 to 991 Minus strand primer evaluation ============================== Minus strand primer is (5' > 3') GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG Origin of primer is FILE OMT2 Tm: DeltaG: Length: %GC: 73 -65 23 76 Restriction enzyme site(s): AcyI BbeI BsiYI BsrI Eco78I HaeII HgiCI HhaI Hin6I KasI NarI [others] PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA: - a single base repeat containing more than bases is present 122 - %GC is not within the acceptable range - primer binds to itself - primer binds to the other primer PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT SITE(S) PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT SITE(S) Minus strand primer - template' binding: [Note: Locations are given relative to the original template sequence.] MINUS-PRIMER GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGG ||||||||||||||||||||||| OMT_1 CAGCCGCGGTGCGTGACCCAACC LOCATION: 1734 to 1758 ===18-MAR-2007====================PCRPLAN=====================PC/GENE=== ********************* * PRIMER EVALUATION * ********************* PCR product: 537 bp Sequence selected is VER_1 Total number of bases is: 5498 Amplified region is the complete sequence Plus strand primer is user-defined Minus strand primer is user-defined Tm parameters Tm = delta H/(delta S + R * ln(C/4)) - 273.15 + 16.6 log[Na+] Optimal Tm: Acceptable Tm range: Salt concentration: Primer DNA concentration: 71 56-86 50 mM 250 pM Primer composition parameters Optimal primer length: Acceptable primer lengths: Maximum single base repetition: Number of bases for 3' GC clamp: 20 15-25 Acceptable range for %GC: 40-60 % Primer binding parameters Maximum Maximum Maximum Maximum number of bases for primer self-complementarity: allowable stem size in stem-loop formation: percent of bases complementary to other template regions: number of bases complementary between + and - primers: - Plus strand primer evaluation ============================= Plus strand primer is (5' > 3') CCGTGAGGCCGCGGAGAAAGTGGT Origin of primer is FILE VER1B 123 4 70 % Tm: DeltaG: Length: %GC: 70 -59 24 67 Restriction enzyme site(s): AciI DsaI Fnu4HI FnuDII HaeIII NspBII SacII SecI PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA: - GC clamp has less than bases - %GC is not within the acceptable range - primer binds to itself - primer binds to the other primer PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT SITE(S) PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT SITE(S) Plus strand primer - template binding: [Note: Locations are given relative to the original template sequence.] PLUS-PRIMER VER_1 CCGTGAGGCCGCGGAGAAAGTGGT |||||||||||||||||||||||| GGCACTCCGGCGCCTCTTTCACCA LOCATION: 511 to 534 Minus strand primer evaluation ============================== Minus strand primer is (5' > 3') GGGGATATACTCCCGCGACACAGCC Origin of primer is FILE VER2 Tm: DeltaG: Length: %GC: 67 -57 25 64 Restriction enzyme site(s): AciI FnuDII PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA: - a single base repeat containing more than bases is present - %GC is not within the acceptable range - primer binds to the other primer PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT SITE(S) PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT SITE(S) Minus strand primer - template' binding: [Note: Locations are given relative to the original template sequence.] MINUS-PRIMER GGGGATATACTCCCGCGACACAGCC ||||||||||||||||||||||||| VER_1 CCCCTATATGAGGGCGCTGTGTCGG LOCATION: 1023 to 1047 ===18-MAR-2007====================PCRPLAN=====================PC/GENE=== 124 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THIÊN MINH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN TRÊN NGÔ VÀ LẠC Chuyên ngành: Công nghệ sinh. .. thiểu nhiễm aflatoxin Xuất phát từ lý trên, thực đề tài: Nghiên cứu tính đối kháng Aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin ngô lạc , với mục đích nội dung nghiên cứu sau đây:... NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THIÊN MINH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN TRÊN NGÔ