Nghiên cứu tính đối kháng của aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc ( Luận án tiến sĩ)

Nghiên cứu tính đối kháng của aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu tính đối kháng của aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu tính đối kháng của aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu tính đối kháng của aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu tính đối kháng của aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc ( Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THIÊN MINH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHƠNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHỊNG CHỐNG AFLATOXIN TRÊN NGƠ VÀ LẠC Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THIÊN MINH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHƠNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHỊNG CHỐNG AFLATOXIN TRÊN NGƠ VÀ LẠC Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS NGUYỄN THÙY CHÂU PGS TS NGUYỄN THN XUÂN SÂM Hà Nội - 2014 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Giáo dục Đào tạo, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình học tập hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Thuỳ Châu - Nguyên trưởng Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch PGS.TS Nguyễn Thị Xn Sâm – Trưởng mơn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học & CNTP, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ chia sẻ khó khăn tơi suốt thời gian tơi thực luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS Đinh Duy Kháng - Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử, tạo điều kiện thuận lợi ủng hộ tơi q trình thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn cán phụ trách đào tạo, Viện đào tạo sau đại học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ hồn thành thủ tục cần thiết q trình làm nghiên cứu sinh Trong thời gian qua, nhận giúp đỡ nhiệt tình anh chị bạn đồng nghiệp Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch - Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, Phòng Vi sinh vật phân tử - Viện Cơng nghệ sinh học Bộ mơn Vi sinh, Hóa sinh, Sinh học phân tử - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Nhân dịp xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tơi biết ơn người thân gia đình quan tâm tạo điều kiện tốt cho học tập nghiên cứu Tôi vô cảm ơn động viên, khích lệ bạn bè ngồi Viện dành cho tơi Hà Nội, ngày 23 tháng năm 2014 Lê Thiên Minh ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Hà nội, ngày 23 tháng năm 2014 Tác giả Lê Thiên Minh iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN ARN EDTA SDS-PAGE TCA v/p v/v vvm w/v X WHO Tm FDA TE PCR SDS TLC EtBr dNTP A flavus A parasiticus NOR AVN HAVN OAVN AVNN AVF VHA VAL VERB VERA DMST DHDMST ST DHST OMST DHOMST AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Axit deoxyribonucleic Axit ribonucleic Axit etylen diamin tetra axetic Điện di gel polyacrylamit có chứa sodium dodecyl sulfate Axit trichloroaxetic vòng / phút Thể tích/thể tích thể tích/thể tích/phút Trọng lượng /thể tích Axit amin Tổ chức Y tế giới Nhiệt độ tan chảy Cục quản lý Thực phNm Dược phNm Hoa kỳ Tris EDTA Polymerase chain reaction Sodium dodecyl sulfate Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng) Ethydium bromit Deoxiribonucleotit triphosphat Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Norsolorinic acid Averantin 5’ hydroxyaverantin Oxoaverantin Averufanin Averufin Versiconal hemiacetal acetate Versiconal Versicolorin B Versicolorin A Demethylsterigmatocystin Dihydro demethylsterigmatocystin Sterigmatocystin Dihydro sterigmatocystin O-methylsterigmatocystin Dihydro-O-methylsterigmatocystin Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 Aflatoxin G1 Aflatoxin G2 iv Danh mục bảng STT Tờn bng Trang Bảng 1.1 Một số tính chất lý, hóa aflatoxin Bảng 1.2 Giới hạn aflatoxin cho phép nông sản thực ph m 12 Bảng 1.3 Giới hạn aflatoxin thức ăn tinh hỗn hợp cho Bê Bò 12 Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin thức ăn chăn nuôi 13 Bảng 1.5 Đặc điểm hình thái A flavus 14 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp mẫu A flavus DA2 40 Bảng 3.1 Kết phân lập chủng A flavus từ ngô, lạc số tỉnh Việt 44 Nam Bảng 3.2 Khả tạo aflatoxin chủng A flavus phân lập từ ngô 45 lạc Bảng 3.3a Đặc điểm hình thái chủng A flavus phân lập từ mẫu ngơ lạc 47 10 Bảng 3.3b Đặc điểm hình thái chủng A flavus phân lập từ mẫu ngô lạc 48 11 Bảng 3.4a Đặc điểm cấu trúc vi học chủng A flavus phân lập từ 49 mẫu ngô lạc 12 Bảng 3.4b Đặc điểm cấu trúc vi học chủng A flavus phân lập từ 50 mẫu ngô lạc 13 Bảng 3.5 Khả sinh aflatoxin B1 chủng A flavus phân lập 52 14 Bảng 3.6 Hiệu giảm aflatoxin B1 chủng A flavus AF14 nuôi cấy 54 môi trường ngô chủng A flavus không sinh aflatoxin 15 Bảng 3.7 Mật độ tế bào A flavus DA2 A flavus AF14 nuôi hỗn hợp theo 55 tỉ lệ 1:1 16 Bảng 3.8 Trình tự cặp mồi 58 17 Bảng 3.9 Tổng hợp kết PCR với mồi sử dụng 60 18 Bảng 3.10 Ảnh hưởng A flavus DA2 đến trọng lượng thể chuột 63 19 Bảng 3.11 Mật độ bào tử chủng A flavus DA2 tạo môi 66 trường khác v 20 Bảng 3.12 Khả tạo bào tử chủng A flavus DA2 nhiệt độ nuôi cấy 67 khác 21 Bảng 3.13 Ảnh hưởng độ m môi trường đến khả tạo bào tử 68 chủng A flavus DA2 22 Bảng 3.14 Thời điểm thu bào tử chủng A flavus DA2 69 23 Bảng 3.15 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống tới mật độ bào tử A flavus DA2 70 24 Bảng 3.16 Ảnh hưởng độ dày khối ủ tới mật độ bào tử chủng A flavus 71 DA2 25 Bảng 3.17 Mật độ bào tử A flavus DA2 chất mang thời gian 72 bảo quản khác 26 Bảng 3.18 Khả cạnh chế ph m A.flavus DA2 tỷ lệ khác 76 sắc ký TLC 27 Bảng 3.19 Khả cạnh tranh chủng A.flavus DA2 bón vào đất 77 tỷ lệ khác 28 Bảng 3.20 Ảnh hưởng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến phát triển 80 sinh khối A.flavus DA2 29 Bảng 3.21 Mức độ nhiễm nấm mốc A.flavus đất trồng ngô, lạc số 82 tỉnh Việt Nam 30 Bảng 3.22 Khả cạnh tranh chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin 84 đất trồng ngô sử dụng chế ph m AF 31 Bảng 3.23 Hiệu giảm nấm mốc aflatoxin chủng A.flavus DA2 86 ngô bắp giai đoạn trước thu hoạch 32 Bảng 3.24 Hiệu phòng chống nấm mốc aflatoxin chế ph m AF 89 ngô sau thời gian bảo quản tháng 33 Bảng 3.25 Khả cạnh tranh chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin 91 đất trồng lạc bón chế ph m AF 34 Bảng 3.26 Hiệu giảm nấm mốc aflatoxin chủng A.flavus DA2 92 lạc củ giai đoạn trước thu hoạch 35 Bảng 3.27 Hiệu giảm nấm mốc aflatoxin chủng A.flavus DA2 lạc sau thời gian bo qun thỏng 93 vi Danh mục hình STT Tên hình Trang Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo số dạng aflatoxin Hình 1.2 Aflatoxin tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền Hình 1.3 Khu n lạc A.flavus 15 Hình 1.4 Hệ sợi A.flavus quan sát kính hiển vi 15 Hình 1.5 Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin 17 Hình 1.6 Hàm lượng aflatoxin hạt giảm tỷ lệ AF36 tăng 29 Hình 3.1 Sắc ký đồ phân tích aflatoxin tạo chủng A flavus AF14 52 Hình 3.2 Sắc ký đồ thể khả sinh aflatoxin B1 chủng A flavus 53 DA2 Hình 3.3 Kiểm tra hàm lượng aflatoxin B1 hỗn hợp chủng A.flavus 54 nuôi cấy chất ngô sắc ký mỏng (TLC) 10 Hình 3.4 Chủng A flavus DA2 cạnh tranh lấn át chủng A flavus AF14 56 đĩa thạch 11 Hình 3.5 Chất lượng ADN tổng số gen agarose 1,5% 59 12 Hình 3.6 Sản ph m multiplex PCR chủng A.flavus DA2 A flavus 59 AF14 13 Hình 3.7 Khả sinh aflatoxin chủng A.flavus DA2 sau 5, 10 15 61 hệ 14 Hình 3.8 Sự tồn gen aflR, ver, omt nor chủng A.flavus 61 DA2 sau 5, 10 15 hệ 15 Hình 3.9 Đường cong sinh trưởng chủng A.flavus DA2 65 16 Hình 3.10 Khả cạnh tranh A.flavus DA2 tỷ lệ khác 75 17 Hình 3.11 Khả đối kháng chế ph m A.flavus DA2 thời điểm 78 cấy khác 18 Hình 3.12 Khả đối kháng chủng A.flavus DA2 có mặt thuốc bảo vệ thực vật 81 vii 19 Hình 3.13 Nấm mốc nhiễm đất trồng ngơ 83 20 Hình 3.14 Khu n lạc chủng A.flavus phát quang phân lập từ đất trồng ngơ 85 bón chế ph m AF xã Tam Hồng, Yên Lạc, Vĩnh Phúc (8/20076/2008) 21 Hình 3.15 Khả kiểm sốt aflatoxin ngô trước thu hoạch chế 87 ph m AF 22 Hình 3.16 Bắp ngơ ruộng sử dụng hai lần chế ph m AF 88 23 Hình 3.17 Bắp ngô ruộng không sử dụng chế ph m AF 88 24 Hình 3.18 Ngơ sử dụng khơng sử dụng chế ph m AF sau thời gian bảo 90 quản tháng 25 Hình 3.19 Chủng A flavus phát quang không phát quang phân lập 92 đất trồng lạc 26 Hình 3.20 Lạc sử dụng không sử dụng chế ph m AF sau thời gian bảo quản tháng 94 CL C Trang L I M N………………………………………………………………………………….……i L I CAM OAN.……………………………………………………………………….…………ii DANH M C CÁC KÝ HI U VÀ CH VI T T T ……………………………… ………… iii DANH M C CÁC B NG.……………………………………………………………………… iv DANH M C CÁC HÌNH NH, TH …………………………………………………… … vi M U……………………………………………………………………………………….… CH NG I T NG QUAN TÀI LI U 1.1 T NG QUAN V AFLATOXIN 1.1.1 C u t o 1.1.2 Tính ch t hóa lý 1.1.3 c tính c a aflatoxin 1.1.4 Th c tr ng nhi m aflatoxin ngô, l c 1.1.5 Gi i h n aflatoxin cho phép nông s n th c ph m 11 1.2 ASPERGILLUS FLAVUS 13 1.2.1 c m hình thái 13 1.2.2 Các y u t 1.2.3 nh h ng n s sinh tr ng c a A flavus 15 u ki n sinh aflatoxin 16 1.3 PHÒNG CH NG S NHI M AFLATOXIN 19 1.3.1 Bi n pháp canh tác nông nghi p 19 1.3.2 Bi n pháp sau thu ho ch 20 1.3.3 Bi n pháp sinh h c 21 1.4 PHỊNG CH NG AFLATOXIN B NG CH NG A.FLAVUS KHƠNG SINH AFLATOXIN 22 1.4.1 C ch ki m soát n m m c aflatoxin b ng ch ng A.flavus không sinh aflatoxin 22 1.4.2 Tuy n ch n ch ng A flavus không sinh aflatoxin làm tác nhân i kháng 24 1.5 NGHIÊN C U NG D NG CH PH M N M A FLAVUS KHƠNG SINH CT TRONG PHỊNG CH NG AFLATOXIN 26 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THIÊN MINH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHƠNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHỊNG CHỐNG AFLATOXIN TRÊN NGƠ VÀ LẠC Chun ngành: Cơng nghệ sinh. .. ch ng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin phân l p c 46 3.1.4 Tuy n ch n ch ng A flavus không sinh aflatoxin 51 3.1.5 ánh giá kh n ng c nh tranh c a ch ng A flavus không sinh aflatoxin. .. A .FLAVUS KHÔNG SINH AFLATOXIN 22 1.4.1 C ch ki m soát n m m c aflatoxin b ng ch ng A .flavus không sinh aflatoxin 22 1.4.2 Tuy n ch n ch ng A flavus không sinh aflatoxin