(Luận văn thạc sĩ) góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 173 113​

BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU HIỀN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 173.113 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU HIỀN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 173.113 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Giáo viên hướng dẫn: Ths.VÕ THỊ THU THỦY Nơi thực hiện: Bộ môn VI SINH – SINH HỌC Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2013 Lời cảm ơn Tôi xin gửu lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo Ths Võ Thị Thu Thủy – người tận tình hướng dẫn từ bước hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên giảng dạy làm việc môn Vi sinh - Sinh học trường đại học Dược Hà nội tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian tơi làm khóa luận mơn Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu tồn thể thầy giáo trường đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập rèn luyện trường Và cuối lời cảm ơn tơi gửi tới gia đình, bạn bè động viên,giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Do thời gian thực nghiệm hạn hẹp, điều kiện trang thiết bị, phương tiện nghiên cứu trình độ thân cịn hạn chế, khóa luận khơng tránh khỏi cịn nhiều thiếu sót Tơi mong nhận góp ý thầy bạn bè để khóa luận hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng năm 2013 Sinh viên Lê Thị Thu Hiền MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN ……………………………………………………… 1.1 Đại cương kháng sinh … ………………………………………………2 1.1.1 Lược sử phát triển kháng sinh ……………….………………… 1.1.2 Định nghĩa, phân loại kháng sinh ……………………………………2 1.1.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh …………………………………….4 1.1.4 Sơ đồ tổng quát trình sản xuất kháng sinh ……………….…… 1.1.5 Các ứng dụng kháng sinh ………………………………….……6 1.2 Đại cương xạ khuẩn …………………………………………….…… 1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn ……………………………………… 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces………………………………7 1.3 Tuyển chọn, cải tạo bảo quản giống xạ khuẩn …………………….….9 1.3.1 Mục đích …………………………………………………………… 1.3.2 Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao SLNN ………….……9 1.3.3 Đột biến cải tạo giống …………………………….………………….9 1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn …………………………….…………… 10 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh …………………………………… 11 1.4.1 Khái niệm lên men ………………………………………………….11 1.4.2 Các phương pháp lên men ………………………………………….11 1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men …………………….12 1.5 Chiết tách tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ………………… 13 1.6 Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh ………………14 1.6.1 Phổ tử ngoại – khả kiến ……………………………………………14 1.6.2 Phổ hồng ngoại……… …………………………………………….14 1.6.3 Khổi phổ (MS)………………………………………………………15 1.7 Một số kết nghiên cứu kháng sinh …………………………… 15 1.7.1 Ảnh hưởng mức độ oxy hòa tan sản xuất dạng viên Rapamycin từ Streptomyces hygroscopicus …………………… 15 1.7.2 Tối ứu hóa chuy ển đổi Streptomyces sp ATCC 39.366 sản xuất Leptomycin electroporation …………………………………….16 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… ……… 17 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị …………………………………………….17 2.1.1 Nguyên vật liệu ………………………………………………………17 2.1.2 Máy móc thiết bị ………………………………………………….19 2.2 Nội dung nghiên cứu ………………………………………… ………….19 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống ……………………………………………… 19 2.2.2 Lên men, tách chiết kháng sinh ……………………………………… 20 2.2.3 Sơ xác định tính chất kháng sinh thu …………………………20 2.3 Phương pháp thực nghiệm …………………………………………….….20 2.3.1 Nuôi cấy giữ giống xạ khuẩn ……………………………………….20 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán ……… 20 2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên ……………………………………………………21 2.3.4 Phương pháp đột biến ………………………………………………….22 2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ……………………………………23 2.3.6 Tách thành phần kháng sinh sắc kí lớp mỏng …………24 2.3.7 Thu kháng sinh thô cất quay chân không ……………………… 25 2.3.8 Tinh chế kháng sinh thơ sắc kí cột ……………………………….25 2.3.9 Sợ xác định kháng sinh thô sắc kí cột ……………………… 26 Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT…………………….27 3.1 Kết sàng lọc ngẫu nhiên ……………………………………….… 27 3.2 Kết đột biến cải tạo giống lần ………………………….……… 27 3.3 Kết đột biến cải tạo giống lần ………………………….……… 28 3.4 Kết đột biến cải tạo giống lần ……………………………………29 3.5 Kết lên men sinh tổng hợp kháng sinh …………… …….……….30 3.6 Kết chọn chủng lên men ……………………………………….… 31 3.7 Kết sắc kí lớp mỏng chọn hệ dung mơi ……………………… …32 3.8 Kết sắc kí cột …………………………………………….…………32 3.9 Kết đo phổ kháng sinh tinh khiết …………………………….38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận ………………………………………………………………… … 40 Kiến nghị ………………………………………………… …………………40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT S.A Staphylococcus aureus P mirabilis Proteus mirabilis ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic DMHC Dung môi hữu ĐB1 Đột biến lần ĐB2 Đột biến lần G (-) Gram âm G (+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Hồng ngoại - Infrared KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TB Tế bào TĐC Trao đổi chất UV Tử ngoại – Ultraviolet VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học Bang 2.1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 17 Bang 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 18 Bảng 2.3: Các dung môi sử dụng 18 Bảng 3.1: Kết thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 27 Bảng 3.2: Kết thử HTKS đột biến lần 28 Bảng 3.3: Kết thử HTKS đột biến lần 28 Bảng 3.4: Kết thử HTKS đột biến lần 29 Bảng 3.5: Kết chọn môi trường lên men 30 Bảng 3.6: Kết chọn chủng lên men 31 Bảng 3.7: Kết chọn hệ dung môi chạy sắc ký 32 Bảng 3.8: Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy cột lần 33 Bảng 3.9: Kết SKLM phân đoạn lần1 (hiện hình P mirabilis) 34 Bảng 3.10: Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy cột lần 35 Bảng 3.11: Kết SKLM phân đoạn lần (hiện hình P mirabilis) 36 Bảng 3.12: Kết thử hoạt tính KS phân đoạn sau chạy cột lần 37 Bảng 3.13: Kết SKLM phân đoạn lần (hiện hình P mirabilis) 38 Bảng 3.14: Biện giải nhóm chức phổ IR 39 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Kháng sinh phát qua năm (Hopwood,2007) Hình 1.2: Vị trí tác dụng số chất kháng sinh Hình 1.3: Sơ đồ trình sản xuất kháng sinh Hình 1.4: Sơ phân loại xạ khuẩn Hình 1.5: Đường cong sinh trưởng phát triển xạ khuẩn …………………… 13 Hình 3.1: Đường biểu diễn HTKS chạy cột lần P.mirabilis………… 34 Hình 3.2: Đường biểu diễn HTKS chạy cột lần P.mirabilis ………….35 Hình 3.3: Đường biểu diễn HTKS chạy cột lần P.mirabilis ………….36 Hình P1: Thử HTKS phương pháp khối thạch Hình P2: Thử HTKS phương pháp khoanh giấy lọc Hình P3: Phát viết sắc ký phương pháp hình VSV Hình P4: Sắc kí lớp mỏng Hình P5: Sắc kí cột Hình P6: Phổ hồng ngoại kháng sinh tinh khiết thu Hình P7: Phổ khối kháng sinh tinh khiết thu Hình P8 : Phổ tử ngoại kháng sinh tinh khiết thu ĐẶT VẤN ĐỀ Tác dụng kháng sinh phát năm 1928 Penicillin sử dụng vào năm 1943, từ đời, kháng sinh mở kỷ nguyên lịch sử ngành y – dược Nhờ có nhóm thuốc mà người dự phòng điều trị bệnh nhiệm khuẩn, nhiễm nấm ,ung thư … Khơng dừng lại đó, ngày phạm vi điều trị kháng sinh mở rộng điều trị ung thư HIV/AIDS cho nhiều kết khả quan Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh tràn lan không cách làm cho tình trạng kháng kháng sinh xuất ngày trở nên nghiêm trọng Vì vậy, việc tìm kháng sinh điều cần thiết giới quan tâm Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ sinh học đại hỗ trợ nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm ứng dụng kháng sinh đạt nhiều thành tựu Do đó, việc nghiên cứu để phát kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật đề tài thu hút nhà khoa học Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh biết đến có 55% có nguồn gốc từ xạ khuẩn 75% số thuộc chi Streptomyces Đây sở để tơi lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 173.113” làm khóa luận tốt nghiệp Bởi vậy, khóa luận mong muốn đạt mục tiêu sau đây: Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt - Sơ xác định số tính chất lý, hóa kháng sinh thu Hình 3.2: Đường biểu diễn HTKS chạy cột lần P.mirabilis Tiến hành sắc ký lớp mỏng với phân đoạn có hoạt tính, hệ dung mơi chạy hệ dung môi Ethylacetat: methanol (10:1) Kết thể bảng Bảng 3.11: Kết SKLM phân đoạn lần 2(hiện hình P mirabilis) Phân đoạn 1,2 3-11 12-16 Nhận xét: Dựa theo kết thử HTKS chạy sắc kí ta chia làm phần với phần Phần 1: gồm phân đoạn tới 11: Thu chất phân đoạn Phân đoạn 2: gồm phân đoạn 12 tới 16, có chất, hoạt chất Phần 3: gồm phân đoạn 17 tới 25, thu chất phân đoạn phụ Phần 4: gồm phân đoạn 26 tới 30, không thu hoạt chất phân đoạn Kết qủa: Cô phần thu 0,0165g KS tinh khiết Hiệu suất trình tinh chế lần H2 = 25,19% Cô phần 0,0225g KS hỗn hợp, dùng cho lần chạy Chạy sắc ký lần Cân 0,0225 g KS sau tinh chế lần 2, chạy cột với hệ dung môi Ethylacetat : Methanol (10:1) - Bước 1: Đưa silicagel lên cột hệ dung môi chuẩn bị - Bước 2: Rửa cột 15-20 ml n-hexan - Bước 3: Chạy cột bình thường Thu 30 phân đoạn có 21 phân đoạn có HTKS Kết thử HTKS trình bày bảng 16 Bảng 3.12: Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy cột lần Phân đoạn 10 Hình 3.3: Đường biểu diễn HTKS chạy cột lần P.mirabilis Tiến hành sắc ký lớp mỏng phân đoạn hệ dung môi Ethylacetat: Methanol Hiện hình VSV P mirabilis kết sau Bảng 3.13 : Kết SKLM phân đoạn lần 3(hiện hình P mirabilis) Phân đoạn 2-11 12-14 Nhận xét: Sau lần chạy sắc kí, ta thu phần có hoạt chất Phần gồm phân đoạn tới 11 phần từ phân đoạn 15 tới 21 Kết quả: Từ kết bảng nhận thấy lần chạy sắc kí thứ có phân đoạn tách rõ rang KS KS 2.phân đoạn – 11 phân đoạn Đem cô, kết tinh lại thu 0,0094 g bột tinh thể KS màu vàng cam Hiệu suất trình tinh chế lần H3 = 41,77% KS tổng trình tinh chế H = 33,48% KS tinh khiết dùng để đo phổ IR, UV, nhiệt độ nóng chảy khối phổ 3.8 Kết đo phổ kháng sinh tinh khiết Nhiệt độ nóng chảy : 217,4 C Phổ tử ngoại: cho đỉnh hấp thụ ở: 204 nm, 333 nm 443 nm Từ đó, dự đốn cấu trúc KS có nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố, kết hợp đặc điểm Phổ hồng ngoại: cho thấy bước sóng hấp thụ cực đại nhóm chức dự đốn tương ứng trình bày bảng 17 Phổ khối lượng phân tử: dự đoán phân tử lượng 1268, 49dvC Bảng 3.14: Biện giải nhóm chức phổ IR [20] λ(nm) 3433 2925 1738 1465 1191,1096 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau thời gian nghiên cứu, hồn thành mục tiêu ban đầu khóa luận tốt nghiệp Các kết luận cụ thể sau: Qua lần đột biến UV lần tác nhân hố học hoạt tính kháng sinh Streptomyces 173.113 tăng lên so với mẫu sàng lọc khoảng 10-20% Chọn mơi trường lên men chìm tổng hợp kháng sinh MT1dt Kháng sinh Streptomyces 173.113 sinh tổng hợp có số đặc điểm sau: Có thành phần hoạt động kháng sinh thô thu Hiệu suất tinh chế kháng sinh đạt khoảng 33, 48% Nhiệt độ nóng chảy 217,4 C Kháng sinh tinh khiết có hấp thụ ánh sáng tử ngoại, hồng ngoại Cấu trúc phân tử kháng sinh dự đốn chứa nhân thơm, nối đơi liên hợp, dị tố; nhóm chức có kháng sinh là: ester, alkyl clorid, alkyl flourid, imin, amin, nitro, amid Kiến nghị Từ kết thu được, đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu theo hướng sau: Tiến hành giải trình tự gen để xác định xác tên khoa học Streptomyces 173.113 Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 173.113 (bằng UV, hóa chất, phương pháp đột biến bậc thang…) để tạo chủng có khả siêu sinh tổng hợp kháng sinh Khảo sát tìm điều kiện lên men tối ưu Nghiên cứu phương pháp chiết, tách khác để tạo kháng sinh với độ tinh khiết hiệu suất cao Chiết tách để thu lấy kháng sinh phụ nghiên cứu sâu Tiến hành cộng hưởng từ hạt nhân, xác định tính chất lý, hóa … để xác định xác cấu trúc hóa học kháng sinh Streptomyces 173.113 sinh tổng hợp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, tập 2 Trần Thị Hồng Anh (1993), Quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến ứng dụng định lượng kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr PL129-PL131 22-87 Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội, tr Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, NXB Y học, tr 25-57 Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr 39-67 Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuản thuộc chi Steptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học khóa 2006-2008, trường Đại học sư phạm Thái Nguyên Trần Đức Hậu (2006), Hóa dược, NXB Y học, tập 10 Võ Thị Bạch Huệ (2008), Hóa phân tích, NXB y học, tập 2, tr 58- 122, tr 205-225 11 Từ Minh Koóng (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm II, NXB Y học, tập 12 7-37 Đoàn Thị Nguyện (2009), Vi sinh vật, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 13 Lương Đức Phẩm (1999), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp 14 Nguyễn Văn Thanh (2009), Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 35-57 15 Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, tr 40-52 16 Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, NXB Y học, tập 17 Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2011) Điều tra, nghiên cứu số hoạt chất có khả kháng vi sinh vật kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn, Đại học quốc gia Hà Nội, tr.16-46 Tiếng Anh: 18 Department of Chemical and Materials Engineering “Effects of dissolved oxygen level on rapamycin production by pellet-form of Streptomyces hygroscopicus” Tunghai University, Taiwan, ROC 19 School of Life Science and Biotechnology “Optimized transformation of Streptomyces sp ATCC 39366 producing leptomycin by electroporation” Dalian University of Technology, Dalian, 116024, P R China 20 http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1945/fle ming-bio.html PHỤ LỤC Phụ lục 1: Một số kháng sinh Streptomyces tạo Kháng sinh Actinomycin Acid clavulanic Adriamycin Amphotericin Bleomycin Candicidin Cloramphenicol Daunomycin Erythromycin Kanamycin Kasugamycin Lincomycin Nystatin Oxytetracyclin Pymaricin Spiramycin Streptomycin Tetracyclin Vancomycin Hình P1: Thử HTKS phương pháp khối thạch Hình P2: Thử HTKS phương pháp khoanh giấy lọc Hình P3: Phát vết sắc ký phương pháp hình VSV Hình P4: Sắc ký lớp mỏng Ten may: GX-PerkinElmer-USA Resolution: 4cm-1 Date: 3/13/2013 102.7 90 80 70 60 %T 2925 30 20 10 0.0 4000.0 3600 Hình P6: Phổ hồng ngoại kháng sinh tinh khiết thu Hình P7: Phổ khối kháng sinh tinh khiết thu ( Đo Viện khoa học công nghệ Viêt Nam – 18 Hoàng Quốc Việt ) ... trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng tủ lạnh C định kỳ - tháng cấy lại lần.[14, 16] 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Khái niệm lên men Lên men trình trao đổi chất sinh. .. khả lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp MT1dt lên men mơi trường tối thích cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, sau lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt 2.3.6 Tách thành phần. .. HIỀN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 173. 113 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Giáo viên hướng dẫn: Ths.VÕ THỊ THU THỦY Nơi thực hiện: Bộ môn VI SINH – SINH HỌC