Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh cơ hội phân lập ở môi trường xung quanh khu vực lồng cá tôm tại vịnh nha trang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH CƠ HỘI PHÂN LẬP Ở MÔI TRƢỜNG XUNG QUANH KHU VỰC LỒNG CÁ TÔM TẠI VỊNH NHA TRANG Giảng viên hƣớng dẫn: TS Nguyễn Kim Hạnh Th.S Văn Hồng Cầm Sinh viên thực hiện: Trần Thị Trúc Hà Mã số sinh viên: 57137123 Khánh Hòa, năm 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH CƠ HỘI PHÂN LẬP Ở MÔI TRƢỜNG XUNG QUANH KHU VỰC LỒNG CÁ TÔM TẠI VỊNH NHA TRANG Giảng viên hƣớng dẫn: TS Nguyễn Kim Hạnh ThS Văn Hồng Cầm Sinh viên thực hiện: Trần Thị Trúc Hà Mã số sinh viên: 57137123 Khánh Hịa, tháng 07 năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan kết đề tài: ―Khảo sát khả kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh hội phân lập môi trƣờng quanh khu vực lồng cá, tôm vịnh Nha Trang‖ công trình nghiên cứu cá nhân tơi chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khoa học khác thời điểm Nha Trang, tháng năm 2019 Sinh viên thực Trần Thị Trúc Hà i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, trƣớc tiên xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Kim Hạnh, phòng Sinh Thái biển_ Viện Hải dƣơng học, ngƣời tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện, cung cấp kiến thức chuyên môn, hỗ trợ, tận tâm góp ý truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý giá Tôi xin cảm ơn ThS Văn Hồng Cầm ThS Nguyễn Thị Kim Cúc, giảng viên môn Sinh Học,Viện Công nghệ sinh học Môi trƣờng, trƣờng Đại Học Nha Trang ngƣời truyền dạy kinh dày dặn tận tâm bảo, chia sẻ quan tâm để tơi hồn thành tốt đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trƣờng Đại Học Nha Trang quan tâm, giúp đỡ truyền đạt kiến thức góp ý kinh nghiệm quý giá để vững cho thực nghiên cứu Tôi xin cảm ơn Cô, Chú anh chị cán cơng tác phịng Sinh thái biển_ Viện Hải dƣơng học giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc gia đình tập thể lớp 57CNSH thân thƣơng giúp đỡ, quan tâm gắn bó suốt năm tháng học tập rèn luyện Xin chân thành cảm ơn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN .4 1.1 Giới thiệu kháng sinh 1.1.1 Lịch sử hình thành chất kháng sinh 1.1.2 Phân loại kháng sinh .4 1.1.3 Tình hình sử dụng kháng sinh .11 1.2 Hiện tƣợng kháng kháng sinh 14 1.2.1 Khái niệm tƣợng kháng kháng sinh 14 1.2.2 Cơ chế kháng kháng sinh 14 1.2.3 Những nghiên cứu khả kháng kháng sinh số loài vi khuẩn gây bệnh hội 17 CHƢƠNG 20 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Địa điểm nghiên cứu: .20 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phƣơng pháp chung .21 2.2.2 Phƣơng pháp thu mẫu 21 2.3 Phân lập vi khuẩn từ mẫu nƣớc trầm tích 22 2.4 Khảo sát khả kháng kháng sinh vi khuẩn 23 2.5 Phƣơng pháp xác định đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn .26 2.6 Phƣơng pháp định danh vi khuẩn phƣơng pháp sinh học phân tử 28 2.7 Phƣơng pháp xử lí số liệu 28 CHƢƠNG 29 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 iii 3.1 Kết phân lập vi khuẩn gây bệnh hội mẫu nƣớc trầm tích 29 3.2 Kết thử nghiệm khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập……………………… 31 3.2.1 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh môi trƣờng nƣớc 31 3.2.2 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh trầm tích 33 3.3 Kết định danh vi khuẩn kháng loại kháng sinh 36 3.3.1 Đặc điểm sinh hoá chủng vi khuẩn kháng kháng sinh 37 3.3.2 Định danh vi khuẩn .39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 KẾT LUẬN…………… .41 ĐỀ XUẤT……………… 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Tài liệu Tiếng Anh 43 Tài liệu Internet 47 iv DANH MỤC VIẾT TẮT TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts SS Salmonella-Shigella MB Marine Broth TET Tetracyline COL Colistine TRI Trimethoprim NIT Nitrofurantoin RIF Rifampicine cs Cộng v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học .5 Bảng 1.2 Bảng phân chia nhóm Pennicilin phổ kháng khuẩn Bảng 1.3 Bảng phân chia hệ Cephalosporin phổ kháng khuẩn Bảng 1.4 Bảng phân chia thể hệ Quinolon phổ kháng khuẩn 10 Bảng 2.1 Pha lỗng ½ nồng độ kháng sinh……………………………………… 24 Bảng 2.2 Đọc kết kit Api 20E………………………………………… 28 Bảng 3.1 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh (%) môi trƣờng nƣớc Đầm Bấy Hòn Miễu ………………………………………………………………………32 Bảng 3.2 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh (%) nƣớc khoảng cách khác từ lồng nuôi tôm/cá (0m, 100m 200m) Đầm Bấy Hòn Miễu …………………………………… 33 Bảng 3.3 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh (%) trầm tích Đầm Bấy Hịn Miễu…………………………………………… 34 Bảng 3.4 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh (%) trầm tích thu khoảng cách khác từ lồng nuôi tôm/cá (0m, 25m, 50m, 100m, 150m 200m) Đầm Bấy Hòn Miễu …………………………………………………………………… 36 Bảng 3.5 Kết đặc điểm sinh hóa…………………………………………… 39 Bảng 3.6 Kết định danh vi khuẩn kháng lại loại kháng sinh thử nghiệm….40 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế kháng kháng sinh…………………………………………….15 Hình Bản đồ thu mẫu (A) Vị trí khu vực thu mẫu Hịn Miễu Đầm Bấy, (B) Sơ đồ thu mẫu nƣớc trầm tích dƣới lồng nuôi tôm cá .20 Hình 2 Pha lỗng mẫu………………………………………………………… 22 Hình Phƣơng pháp cấy ria 23 Hình Cách pha loãng nồng độ kháng sinh 24 Hình Giếng pha lỗng kháng sinh 26 Hình Dãy phản ứng sinh hóa kít API 20E 26 Hình Thuốc thử James,TDA, VP1, VP2 27 Hình 3.1 a: Chủng Vibrio, b: Chủng Salmonella- Shigella, c: Chủng Aeromonas 29 Hình 3.2 Số vi khuẩn phân lập đƣợc từ mẫu nƣớc biển 30 Hình 3.3 Số vi khuẩn phân lập đƣợc từ mẫu trầm tích .30 Hình 3.4 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh từ mẫu nƣớc Đầm Bấy………… .32 Hình 3.5 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh từ mẫu nƣớc Hịn Miễu…………….32 Hình 3.6 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh từ mẫu trầm tích Đầm Bấy… …….35 Hình 3.7 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh từ mẫu trầm tích Hịn Miễu……… 35 Hình 3.8 a: TCBS_HM200m b: SS_HM200m………………………… 37 Hình 3.9 Kết xác định đặc điểm sinh hóa chủng TCBS_HM200m……….37 Hình 3.10 Kết xác định đặc điểm sinh hóa chủng SS_HM200m… …… 38 Hình 3.11 Kết thử nghiệm oxidase…………………………… .38 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Kể từ kháng sinh Penicillin đƣợc Alexander Fleming phát nối tiếp thành cơng hàng trăm loại kháng sinh đƣợc phát đƣa vào sử dụng Sự đời kháng sinh mở giới cho nhà khoa học nghiên cứu, đặc biệt cho ngành y học điều trị bệnh Song song đó, kháng sinh cịn đƣợc sử dụng phổ biến ngành có giá trị kinh tế nhƣ: chăn nuôi gia súc, gia cầm, thủy sản, trồng trọt để phòng ngừa dịch bệnh đem lại hiệu cao suất Tuy nhiên, việc lạm dụng sử dụng thuốc kháng sinh bừa bãi y tế nhƣ hoạt động kinh tế khác dẫn đến hậu khơn lƣờng Hiện nay, lƣợng lớn chất kháng sinh bị thải môi trƣờng từ nhiều nguồn khác nhau, ví dụ nhƣ chất thải từ khu trồng trọt, nuôi trồng thuỷ hải sản từ nguồn thải bệnh viện, trung tâm y tế, sở chăn nuôi gia súc… Vịnh Nha Trang với diện tích 500 km2, gồm 19 đảo lớn nhỏ, vịnh quy tụ hầu hết hệ sinh thái điển hình nhƣ rạn san hô, thảm cỏ biển, rừng ngập mặn, hệ vi sinh vật vô phong phú đa dạng (https://vi.wikipedia.org/wiki/Nha_Trang) Đầm Bấy Hòn Miễu đƣợc chọn làm địa điểm lấy mẫu dựa hoạt động nuôi trồng thuỷ hải sản lồng bè mạnh mẽ nơi Trong đó, khu vực Đầm Bấy đƣợc quy hoạch vùng nuôi công nghiệp với diện tích 25 với khoảng 120 lồng ni Tại Hịn Miễu lồng bè ni trồng truyền thống đƣợc phát triển với diện tích khoảng 14 với khoảng 100 bè nuôi Cộng thêm điều kiện thiên nhiên ƣu đãi tốt nhƣ: độ mặn cao ổn định quanh năm nên hoạt động nuôi trồng thuỷ sản nơi diễn mạnh mẽ thu sản lƣợng cao cho tiêu dùng lẫn xuất Tuy nhiên, việc xuất sản phẩm thuỷ hải sản Việt Nam bị ngƣng trệ thị trƣờng nƣớc EU việc sử dụng nhiều chất kháng sinh nuôi trồng vấn nạn ô nhiễm vùng biển quanh khu vực lồng bè (Gräslund Bengtsson, 2001) Trong cơng bố nhóm nghiên cứu từ Đại học Stockholm, Thuỵ Điển có báo cáo tình hình sử dụng chất kháng sinh lồng bè nuôi trồng thuỷ sản vịnh Nha Trang Trong đó, kết cơng bố cho thấy lƣợng lớn chất kháng sinh khác nhƣ: Tetracycline, Trimethoprim, Rifampicine, Nifuroxazide Colistine đƣợc dùng hoạt động nuôi trồng thuỷ hải sản vùng Cụ thể: trung bình khoảng 555g kháng sinh đƣợc dùng cho cá sản xuất 5.555g kháng sinh cho tôm hùm nuôi (Hedberg cs, 2018) Một phần đáng kể, dƣ lƣợng kháng sinh bị thải vùng nƣớc xung quanh, lắng đọng trầm tích xunh quang lồng ni; gây ảnh hƣởng đến sức khoẻ hệ sinh thái xung quanh (ví dụ nhƣ san hơ, lồi cá tự nhiên, rong, tảo…) thông qua việc thay đổi cấu trúc quần xã vi sinh vật sống (Lalumera cs, 2004; Hedberg cs, 2018) Quan trọng hơn, diện kháng sinh Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, to, lồi, bóng trên, biến đổi môi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,5-0,6cm Màu xanh đen, bóng trên, lồi, đƣờng kính 0,2-0,3cm 66 ĐB 25m TT (2) 67 ĐB 50m TT (1) Đầm Bấy Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar 68 ĐB 50m TT (2) Đầm Bấy Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu xanh đen, lồi, đƣờng kính 0,3-0,4cm 69 ĐB 50m TT (3) Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu xanh, lồi, bóng trên, đƣờng kính 0,2-0,3cm Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, lồi, bóng trên, biến đổi môi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,2-0,3cm 70 ĐB 50m TT (4) Đầm Bấy Đầm Bấy Đầm Bấy Trầm tích 60 71 ĐB 50m TT (5) Đầm Bấy Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, trơn, bóng trên, lồi, biến đổi mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,2-0,3cm Màu vàng, bóng trên, lồi, biến đổi môi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,2-0,3cm Màu vàng, bóng trên, có tâm, lồi, biến đổi mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,3-0,4cm 72 ĐB 100m TT (1) Đầm Bấy Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar 73 ĐB 100m TT (3) Đầm Bấy Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar 74 ĐB 100m TT (4) Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu xanh, bóng trên, có tâm, lồi, đƣờng kính 0,2-0,3cm Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, bóng trên, có tâm, lồi, biến đổi mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,2-0,3cm Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng nhạt, to, bóng trên, đƣờng kính 0,7-0,8cm 75 ĐB 150m TT (1) 76 ĐB 200m TT (1) Đầm Bấy Đầm Bấy Đầm Bấy 61 77 78 ĐB 200m TT (2) ĐB 200m TT (3) Đầm Bấy Đầm Bấy Trầm tích Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Khuẩn lạc biển đổi màu từ xanh sang vàng, lồi, to, bóng, đƣờng kính 0,7-0,8cm Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, có viềm cƣa, lồi, biến đổi mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,2-0,3cm 79 HM 0m (1) Hòn Miễu Nƣớc biển Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar 80 HM 0m (2) Hòn Miễu Nƣớc biển Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar 81 HM 0m (3) Nƣớc biển Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Hòn Miễu 62 Màu vàng, có tâm, lồi, bóng trên, biến đổi màu mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,1-0,2cm Màu vàng, có tâm, lồi, bóng trên, biến đổi mơi trƣờng từ xang sang vàng, đƣờng kính đƣờng kính 0,1-0,2cm Màu xanh, có tâm, bóng trên, lồi, đƣờng kính 0,3-0,4cm 82 HM 100m (1) Hòn Miễu Nƣớc biển Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, có tâm, bóng trên, lồi, biến đổi mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,2-0,3cm 83 HM 100m (2) Hòn Miễu Nƣớc biển Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu xanh đen, có tâm, lồi, đƣờng kính 0,4-0,5cm 84 HM 100m (3) Nƣớc biển Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu xanh, có tâm, lồi, bóng trên, đƣờng kính 0,1-0,2cm Nƣớc biển Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, có tâm, lồi, biến đổi mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,2-0,3cm Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu xanh, có tâm, lồi, bóng trên, đƣờng kính 0,2-0,3cm Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, có tâm, bóng trên, lồi, biến dổi mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,2-0,3cm 85 HM 200m (1) 86 HM 0m TT (1.1) 87 HM 0m TT (1.2) Hịn Miễu Hịn Miễu Hịn Miễu Hịn Miễu Trầm tích 63 88 HM 0m TT (2) Hịn Miễu Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Biến đổi khuẩn lạc từ màu đen sang màu vàng, to, lồi, bóng trên, đƣờng kính 0,5-0,6cm 89 HM 25m TT (1) Hịn Miễu Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu xanh đen, có tâm, lồi, đƣờng kính 0,2-0,4cm Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Biến đổi khuẩn lạc từ xanh sang vàng, lồi, bóng trên, đƣờng kính 0,6-0,7cm Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, nhỏ, lồi, biến đổi môi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,1-0,2cm Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, có tâm, lồi, bóng trên, biến đổi mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,1-0,4cm 90 91 92 HM 25m TT (2) HM 50m TT (1) HM 50m TT (2) Hịn Miễu Hịn Miễu Hịn Miễu Trầm tích Trầm tích Trầm tích 64 93 HM 50m TT (3) Hịn Miễu Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, có tâm, lồi, biến đổi môi trƣờng từ xanh sang vàng, dƣờng kính 0,1-0,5cm Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Khuẩn lạc biến đổi từ màu xanh sang màu vàng, có tâm, lồi, đƣờng kính 0,2-0,6cm Màu xanh, nhỏ, bóng trên, lồi, đƣờng kính 0,1-0,2cm Trầm tích 94 HM 50m TT (4) 95 HM 50m TT (5) Hòn Miễu Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar 96 HM 100m TT (1) Hịn Miễu Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu xanh đen, có tâm, lồi, đƣờng kính 0,2-0,3cm Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, có tâm, lồi, biến đổi mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,3-0,4cm 97 HM 100m TT (2) Hòn Miễu Hòn Miễu Trầm tích 65 98 99 100 HM 100m TT (3) HM 100m TT (4) HM 100m TT (5) Hòn Miễu Hòn Miễu Hịn Miễu Trầm tích Trầm tích Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, lồi, bóng trên, biến đổi mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,3-0,4cm Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, có tâm, lồi, biến đổi mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,2-0,3cm Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng nhạt, to, lồi, bóng trên, biến đổi mơi trƣờng từ màu xanh sang vàng, đƣờng kính 0,6-0,8cm 101 HM 150m TT (1) Hịn Miễu Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar 102 HM 150m TT (2) Hịn Miễu Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar 66 Màu vàng, có tâm, mọc theo đƣờng zic zac, lồi, bóng trên, biến đổi mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,1-0,4cm Khuẩn lạc có tâm đen, vòng khuẩn lạc màu xanh nhạt, lồi, đƣờng kính 0,2-0,3cm 103 HM 150m TT (3) 104 HM 150m TT (4) 105 HM 150m TT (5) 106 HM 200m TT (1) 107 HM 200m TT (2) Hòn Miễu Hòn Miễu Hòn Miễu Hòn Miễu Hòn Miễu Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu xanh đen, có tâm, lồi, đƣờng kính 0,2-0,4cm Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Khuẩn lạc biến đổi từ xanh sang vàng, có tâm, lồi, bóng trên, đƣờng kính 0,1-0,5cm Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, to, bóng trên, lồi, đƣờng kính 0,6-0,9cm Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, có tâm, lồi, biến đổi mơi trƣờng từ xanh sang vàng, đƣờng kính 0,2-0,4cm Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu xanh, có tâm, bóng trên, lồi, đƣờng kính 0,1-0,2cm Trầm tích 67 108 HM 200m TT (3) 109 HM 200m TT (4) Hịn Miễu Hịn Miễu Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu xanh đen, có tâm, lồi, đƣờng kính 0,1-0,3cm Trầm tích Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar Màu vàng, to, bóng trên, lồi, đƣờng kính 0,5-0,6cm Ghi chú: Quan sát hình thái, kích thước màu sắc sau 24 – 48h nuôi cấy 37°C 68 Phụ lục Thiết bị dụng cụ Cân phân tích Micropipet Máy Microplate Reader BIORAD Tủ hấp khử trùng Tủ sấy 69 Phụ lục Kết định danh Kết định danh chủng Vibrio harveyi 70 Kết định danh chủng Oceanimonas baumannii 71 Phụ lục Bảng tiêu chuẩn nồng độ ức chế tối thiểu kháng sinh Tiêu chuẩn nồng độ ức chế tối thiểu Kháng sinh S I R TET ≤4 ≥ 16 COL ≤2 ≥8 TRI ≤8 – ≥ 16 NIT ≤ 32 64 ≥ 128 RIF ≤1 ≥4 Ghi chú: I (Intermediate): Trung gian R (Resistant) : Kháng S (Susceptible) : Nhạy cảm (Cockerill cs, 2011) 72 Phụ lục Vật liệu môi trƣờng Dụng cụ thiết bị Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa peptri Ø 90, bình tam giác, đèn cồn, micropipet loại, que cấy ria, que cấy trang, ống đong,… Thiết bị: Tủ sấy, tủ hông khơ, tủ ấm, lị vi sóng, cân điện tử, tủ lạnh đo OD, tủ cấy vô trùng Môi trƣờng hóa chất Mơi trƣờng Marine Broth 2216 (MB) đƣợc sử dụng để tăng sinh vi khuẩn biển mẫu nƣớc trầm tích Thành phần bao gồm: Peptone: 5g/l, Yeast extract: 1g/l, Ferric citrate: 0,1g/l, Natri chloride: 19,45g/l, Manesium chloride: 8,8g/l, Natri sulphate: 3,24g/l, Calcium chloride: 1,8g/l, Potassium chloride: 0,55g/l, Natri bicarbonate: 0,16g/l, Potassium bromide: 0,08g/l, Strontium chloride: 0,034g/l, Boric acid: 0,022g/l, Natri silicate: 0,004g/l, Natri fluorate: 0,0024g/l, Ammonium nitrate: 0,0016g/l, Disodium phosphate: 0,008g/l, pH= 7,6 25°C Trong đề tài sử dụng môi MB Himedia, Ấn Độ Tủ hấp autoclave dùng để hấp môi trƣờng số dụng cụ thí nghiệm Nguyên tắc Phƣơng pháp tăng sinh phƣơng pháp sử dụng môi trƣờng lỏng dùng để tăng sinh khơng có tính chọn lọc, làm mật độ vi khuẩn có mẫu sinh trƣởng nhiều mật độ ban đầu Phân lập vi khuẩn nhóm Vibrio Mơi trƣờng Thiosulfate Citrate Bile Salts (TCBS) mơi trƣờng phân lập chọn lọc dịng khác nhóm vi khuẩn Vibrio Thành phần bao gồm: Yeast extract: 5g/l, Peptone: 10g/l, Sodium thiosulphate: 10g/l, Sodium citrate: 10g/l, Oxbile: 8g/l, Sucrose: 20g/l, Sodium chloride: 10g/l, Ferric citrate: 1g/l, Bromothymol blue: 0,04g/l, Thymol blue: 0,04g/l, Agar: 11g/l, pH= 8,6 25°C Trong đề tài sử dụng môi trƣờng Himedia, Ấn Độ Nguyên tắc Phân lập vi khuẩn nhóm Vibrio q trình tách riêng lồi vi khuẩn từ quần thể ban đầu nuôi cấy tế bào môi trƣờng dinh dƣỡng đặc trƣng để đƣợc khuẩn lạc riêng rẽ Các vi khuẩn lên men đƣợc đƣờng sucrose môi trƣờng 73 TCBS cho khuẩn lạc màu vàng làm acid hóa mơi trƣờng bên dƣới khuẩn lạc cịn tƣờng hợp khơng lên men đƣờng sucrose cho khuẩn lạc màu xanh Phân lập vi khuẩn nhóm Salmonella- Shigella Mơi trƣờng Salmonella- Shigella (SS) môi trƣờng phân biệt chọn lọc cho phân lập, nuôi cấy phân biệt Salmonella số chủng Shigella Thành phần môi trƣờng: Peptone: 10g/l, Bile salt: 5,5g/l, Lactose:10g/l, Sodium citrate:10g/l, Sodium thiosulphate: 8,5g/l, Ferric citrate:1g/l, Neutral: 0,025g/l, Brilliant green: 0,0003g/l, Agar: 12g/l, pH=7,3 25°C Nguyên tắc Việc bao gồm muối mật (bile salts), sodium citrate brilliant green cung cấp ức chế vi sinh vật coliform Gram dƣơng ức chế nhóm lại proteus cho phép Salmonella phát triển Dịch chiết thịt bò, dịch phân giải casein enzyme, dịch phân giải mô động vật enzyme cung cấp nguồn nitrogen, carbon vitamins đƣợc yêu cầu cho sinh vật phát triển Lactose, thiosulfate ferric citrate cho phép xác định hydrogen sulfide việc sản xuất khuẩn lạc Salmonella với màu đen trung tâm Phân lập vi khuẩn nhóm Aeromonas Mơi trƣờng Aeromonas Agar mơi trƣờng chọn lọc đặc trƣng cho nhóm vi khuẩn Aeromonas Thành phân bao gồm: HM peptone B: 5g/l; Proteose peptone: 5g/l; , D-Xylose: 10g/l, Sodium thiosulfate: 5.44g/l, Brilliant green: 0,005g/l, Neutral red: 0,025g/l, Bile salt: 8,5g/l, Irgasan: 0,05g/l, Agar: 11,5g/l, pH= 25°C Nguyên tắc Peptone proteose HM peptone B cung cấp hợp chất nitơ thiết yếu D- Xylose nguồn carbon lƣợng Các vi khuẩn coliform Gram dƣơng bị ức chế muối mật, sodium thiosulfate brilliant green vi khuẩn Gram âm có nitratase loại A bị ức chế irgasan Các sinh vật sống sót đƣợc phân biệt khả lên men xylose 74 ... ― Khảo sát khả kháng kháng sinh vi khu? ??n gây bệnh hội phân lập mơi trƣờng quanh khu vực lịng ni cá Vịnh Nha Trang? ?? có ý nghĩa quan trọng để xác định khu vực ảnh hƣởng kháng sinh xung quanh khu. .. HỌC NHA TRANG VI? ??N CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHU? ??N GÂY BỆNH CƠ HỘI PHÂN LẬP Ở MÔI TRƢỜNG XUNG QUANH KHU. .. cứu khảo sát khả kháng kháng sinh vi khu? ??n gây bệnh hội phân lập môi trƣờng quanh khu vực lịng ni cá Vịnh Nha Trang Ý nghĩ thực tiễn: Kết đề tài góp phần xác định khu vực xung quanh lồng nuôi cá